Summary
Intravitreale Injektionen wurden im Schafauge mit dem Ziel durchgeführt, eine viral vermittelte Gentherapie an die Netzhaut zu verabreichen.
Abstract
Es gibt mehrere Methoden für die Abgabe von Therapeutika an die Netzhaut, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer füllt und die Form der Augenkugel beibehält. Obwohl der IVT-Weg weniger spezifisch ausgerichtet ist als die subretinale Abgabe, ist er viel weniger invasiv und wird häufig in klinischen Umgebungen für eine Reihe von Augenerkrankungen eingesetzt.
Wir haben zuvor die Wirksamkeit der intravitrealen Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Gentherapieprodukts (AAV9) nachgewiesen. CLN5) bei Schafen mit einer natürlich vorkommenden CLN5-Form der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose (NCL). Betroffene Schafe erhielten eine IVT-Gentherapie auf einem Auge, wobei das andere unbehandelte Auge als interne Kontrolle diente. Die Netzhautstruktur und -funktion blieb im behandelten Auge bis zu 15 Monate nach der Behandlung erhalten, während das unbehandelte Auge während der postmortalen Untersuchung eine zunehmend abnehmende Funktion und eine schwere Atrophie zeigte. Basierend auf den Schafstudien wurde das Gentherapieprodukt CLN5 im September 2021 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als Kandidat für ein neues Prüfpräparat (IND) zugelassen. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Verabreichung eines therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.
Introduction
Mehrere Methoden können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. Jeder Verabreichungsweg beinhaltet die Überwindung von Barrieren wie der Blut-Netzhaut-Schranke oder den inneren und äußeren Begrenzungsmembranen und hat je nach verabreichtem Arzneimittel und spezifischem Netzhautzielunterschiedliche Wirksamkeitsraten 1,2.
IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer besetzt. Die Hauptfunktion des Glaskörpers besteht darin, die Form der Augenkugel zu erhalten und Augengewebe wie Linse und Netzhaut an Ort und Stelle zu halten. Der Glaskörper besteht größtenteils aus Wasser, mit geringen Mengen an Kollagen, Hyaluronsäure und anderen nicht-kollagenen Proteinen3. Die IVT-Injektion ist ein einfaches und gebräuchliches Verfahren, das routinemäßig zur Behandlung einer Vielzahl von Augenerkrankungen angewendet wird, einschließlich altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Makulaödeme, diabetischer Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und mehrerer erblicher Netzhautdystrophien 4,5.
Neuronale Ceroid-Lipofuszinosen (NCL; Batten-Krankheit) sind eine Gruppe von tödlichen lysosomalen Speicherkrankheiten, die eine schwere Degeneration des Gehirns und der Netzhaut verursachen. Derzeit sind 13 Varianten von NCL bekannt, die aus Mutationen in verschiedenen Genen (CLN1-8, CLN10-14) resultieren, die überwiegend Kinder betreffen, aber unterschiedliches Erkrankungsalter und Krankheitsschweregrad6 aufweisen. Die NCLs teilen gemeinsame progressive Symptome, einschließlich kognitivem und motorischem Verfall, Krampfanfällen und Sehverlust. Es gibt keine Heilung für NCL; Die gehirngesteuerte Enzymersatztherapie befindet sich jedoch derzeit in klinischen Studien für die CLN2-Krankheit7,8, und die AAV-vermittelte Gentherapie hat sich in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen, wobei eine klinische Studie für die CLN5-Gentherapie voraussichtlich 2022 beginnen wird 9,10.
Viele andere Arten entwickeln natürlich vorkommende Formen von NCL, einschließlich Katzen, Hunde, Schafe und Kühe. Zwei NCL-Schafmodelle werden derzeit in Neuseeland aktiv untersucht: ein CLN5-Krankheitsmodell bei Borderdale-Schafen und ein CLN6-Krankheitsmodell bei Schafen in South Hampshire. Betroffene Schafe weisen viele der klinischen und pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit auf, einschließlich Netzhautatrophie und Sehverlust10,11. Obwohl die gehirngesteuerte CLN5-Gentherapie bei Schafen mit CLN5-Krankheit Hirnatrophie und klinischen Verfall verhindern oder stoppen kann, verlieren die behandelten Schafe immer noch ihrSehvermögen 9. Dies unterstrich die Notwendigkeit, die Netzhaut zu behandeln, um das Sehvermögen zu erhalten und eine bessere Lebensqualität zu erhalten, was zur Erstellung eines Protokolls für die Augengentherapie bei Schafen führte.
Das Schafauge stellt aufgrund seiner Ähnlichkeit in den Augenkugelabmessungen, dem Glaskörper und der Netzhautstruktur10,12,13 ein gutes Modell des menschlichen Auges dar. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Abgabe eines kleinen Volumens (≤100 μL) therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentellen Protokolle wurden vom Lincoln University Animal Ethics Committee genehmigt und entsprechen den Richtlinien der US National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und dem New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale-Schafe wurden bei der Geburt14 diagnostiziert und auf Forschungsfarmen der Lincoln University gepflegt. Drei 3 Monate alte homozygote (CLN5-/-) Mutterschafe erhielten eine einzige IVT-Injektion in das linke Auge, wobei das unbehandelte rechte Auge als interne Kontrolle diente. Elektroretinographie- und Pathologiedaten wurden mit historischen gesunden und betroffenen Kontrolldaten verglichen. Der in dieser Studie verwendete virale Vektor war ein selbstkomplementärer Adeno-assoziierter Virus-Serotyp 9, der den Chicken Beta Action (CBh)-Promotor und das Codon-optimierte Schaf CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt) enthielt. Der virale Vektor wurde von der University of North Carolina Vector Core, NC, USA zur Verfügung gestellt.
1. Prächirurgie
- Autoklavieren Sie das OP-Kit (Abbildung 1).
- Fasten Sie die Schafe für 24 Stunden vor der Operation.
- Erfassen Sie Lebendgewichte vor der Operation.
Abbildung 1: Intravitreales Chirurgie-Kit. Zu den Instrumenten, die für die IVT-Operation erforderlich sind, gehören (1) ein Spekulum, um die Augenlider offen zu halten, und (2) ein Paar gebogene Nasenzangen, um die bulbäre Bindehaut zu greifen und das Auge zu drehen. (3) Ein gerader Nasenhämostat ist auch als alternatives Instrument enthalten, um die bulbäre Bindehaut zu greifen und das Auge an Ort und Stelle zu halten, wenn es in die Augenhöhle zurückgerollt ist. Dieses Kit wird vor der Operation autoklaviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Chirurgischer Eingriff
- Halten Sie das Tier fest und rasieren Sie die Wolle mit elektronischen Haarschneidern von einer Seite des Halses über die Halsvene.
- Verschließen Sie die Halsvene, indem Sie Druck auf die Basis der Jugularrille ausüben und die erhöhte Vene visualisieren.
- Die entsprechende Menge Diazepam (0,3 mg/kg) und Ketamin (7,5 mg/kg) in eine sterile Spritze geben und eine sterile 20 g Nadel anbringen. Führen Sie die Nadel in die Halsvene ein und ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um sicherzustellen, dass Blut in die Nabe gelangt und sich die Nadel in der Vene befindet. Nach der Bestätigung durch intravenöse (juguläre) Verabreichung induzieren.
- Legen Sie das Tier unmittelbar nach der Induktion in eine dorsale Liege, strecken Sie den Hals aus und halten Sie die Zunge mit einem Laryngoskop nach oben, um den Kehlkopf zu visualisieren. Führen Sie eine endotracheale Intubation durch, indem Sie beim Ausatmen des Tieres vorsichtig einen Endotrachealtubus (Größe 6,0-9,0 je nach Größe des Schafes) zwischen die Stimmbänder einführen. Blasen Sie die Endotrachealmanschette sofort auf und sichern Sie den Schlauch mit einer Krawatte um den Unterkiefer. Bestätigen Sie den Luftstrom durch das Rohr.
- Legen Sie die Schafe auf den OP-Tisch und legen Sie sie in seitliche Liege.
- Verbinden Sie sofort den Endotrachealtubus mit den Schläuchen des Anästhesiegeräts, um Isofluran in 100% Sauerstoff abzugeben. Beginnen Sie zunächst mit 3% -4% Isofluran und reduzieren Sie dann auf 2% -3% für die Wartung. Beobachten Sie die spontane Belüftung der Schafe.
- Überwachen Sie die Herzfrequenz (Pulsfrequenz), die Atemfrequenz, die Sauerstoffsättigung, die endtidalen CO2-Werte und die rektale Körpertemperatur während des gesamten Verfahrens. Siehe Tabelle 1 für physiologische Werte für diese Parameter bei betäubten Schafen (variabel, aber als Orientierungshilfe zu verwenden).
- Legen Sie einen großen, sterilen, quadratischen Vorhang auf einen chirurgischen Operationswagen, gefolgt von den sterilen Instrumenten.
- Positionieren Sie einen sterilen, fenestrierten chirurgischen Vorhang über dem zu injizierenden Auge.
- Desinfizieren Sie das Auge aseptisch mit einer sterilen 20-ml-Spritze, um das Auge mit 1-5% iger Povidon-Jod-Lösung zu spülen.
- Tragen Sie 1-2 Tropfen Alcain 0,5% W/V Augenlösung als Lokalanästhetikum auf das Auge auf.
- Bringen Sie ein Nopa Barraquer-Colibri Augenspekulum (10 mm) an die Augenlider, um das Auge offen zu halten.
- Fassen Sie die bulbäre Bindehaut auf dem dorsolateralen Aspekt des Auges mit einer Pinzette und drehen Sie die Augenkugel ventromedial.
| Bewusst | Betäubt | Empfohlener kritischer Interventionspunkt | |
| Herzfrequenz (Schläge/Min.) | 50-80 (Ruhe) bis 280 (aktiv) | 50-80 | <50, >100 |
| Atemfrequenz (Atemzüge/min) | 15-40 (Rest) bis 350 (überhitzt) | 10-30 | <8, >40 |
| Sauerstoffsättigung (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| Endtidales CO2 (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Körpertemperatur (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabelle 1: Physiologische Werte der bei betäubten Schafen zu überwachenden Parameter.
3. Virale Vorbereitung
- Bewahren Sie AAV-Vektoraliquots bis zur Verwendung bei −80 °C auf.
- Am Tag der Operation tauen Sie die erforderliche Anzahl von Fläschchen für die IVT-Lieferung auf Eis auf.
- Unmittelbar vor der Verabreichung den viralen Vektoraliquot vortex und 10 s bei 400 × g zentrifugieren, um den Inhalt zu sammeln.
- Verdünnen Sie jeden viralen Vektoraliquot in steril filtrierter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die gewünschte Dosis in einem Endvolumen von 100 μL. Bereiten Sie Vektorverdünnungen in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Proteinbindung unter Verwendung steriler Filterpipettenspitzen vor. Entsorgen Sie alle Verbrauchsmaterialien, die mit dem viralen Vektor in Kontakt gekommen sind, in Desinfektionslösung (siehe Materialtabelle).
ANMERKUNG: In der Originalpublikation15 wurde die Dosis des Therapeutikums (AAV9. CLN5) war 1,9 x10 10 virale Genome. Die empfohlene Dosierung variiert je nach verabreichtem Therapeutikum; Daher wurde eine Dosierung nicht in das hier vorgestellte Standardprotokoll aufgenommen. - Ziehen Sie die vollen 100 μL des AAV-Vektorpräparats in eine sterile, totraumarme 1-ml-Spritze mit einer fest angebrachten 28 G x 1/2-in-Nadel zur sofortigen Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Zeitspanne von der Zubereitung bis zur Injektion weniger als 2 Minuten beträgt.
4. Virale Verabreichung
- Führen Sie die Nadel etwa 7 mm hinter der Sklera auf der lateralen Seite des Auges ein und schwenken Sie sie nach hinten, um die Linse zu vermeiden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Verabreichen Sie die einmalige Injektion von 100 μL als Bolus so nah wie möglich an der Netzhaut, ohne die Netzhautoberfläche zu stören.
- Spülen Sie das Auge mit ca. 10-15 ml 1-5% iger Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 10 ml Kochsalzlösung, bevor Sie das Spekulum entfernen und abdecken.
- Drehen Sie die Schafe um und wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem anderen Auge.
Abbildung 2: Ventromediale Rotation der Augenkugel . (A) Fassen Sie die bulbäre Bindehaut mit einer Zange ohne Zahn und (B) drehen Sie sich ventromedial (d. h. nach unten und zur Schnauze hin), um die dorsolaterale Oberfläche des Auges für die Injektion freizulegen. Abkürzungen: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Injektionsposition und -tiefe. Die Nadel wird auf den dorsolateralen Aspekt der Augenkugel injiziert und die gesamte Länge des Nadelschaftes (0,5 Zoll / 12,7 mm) wird in das Auge eingeführt. Beachten Sie den Winkel der Nadel zum hinteren Teil des Auges, um die Linse zu vermeiden und so nah wie möglich an die Netzhaut zu injizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Postoperatives Management
- Beenden Sie nach Abschluss des Verfahrens die Isoflurangasinhalationsanästhesie, spülen Sie die Leitung mit 100% Sauerstoff, trennen Sie den Schlauch vom Endotrachealtubus und bringen Sie die Schafe in den Aufwachraum.
- Legen Sie die Schafe in eine sternale Liege, wobei die Beine darunter versteckt sind, und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt haben. Stellen Sie sicher, dass das Maul des Tieres frei von Hindernissen ist.
- Wenn der Schluckreflex beobachtet wird, entleeren Sie die Manschette des Endotrachealtubus teilweise und entfernen Sie den Schlauch vorsichtig aus dem Mund.
- Verabreichen Sie ein intramuskuläres nichtsteroidales entzündungshemmendes Mittel in den Bizeps femoris-Muskel der Hintergliedmaße, subkutane Antibiotika an der Seite des Halses oder hinter der Schulter und 0,5% Chloramphenicol Augentropfen auf die Oberfläche der Augenkugel.
- Stellen Sie Wasser und Futter (Luzernepellets und Spreu) bereit, sobald die Schafe ohne Hilfe stehen können.
- Verabreichen Sie 0,5% Chloramphenicol Augentropfen 2-3 pro Tag für 7 Tage nach der Operation.
- Halten Sie die Schafe über Nacht drinnen, bevor sie etwa 24 Stunden nach der Operation auf die Außenkoppel zurückkehren.
- Aufzeichnung der rektalen Temperaturen täglich für 3 Wochen. Überwachen Sie auf Veränderungen des Pulses oder der Atemfrequenz, der Nahrungsaufnahme, des Neuroverhaltens, der Körpertemperatur, des Gewichts, der Körperhaltung, der Augengesundheit und der klinischen Anzeichen von Krankheit. Suchen Sie eine geeignete tierärztliche Behandlung auf, wenn es Anzeichen für unerwünschte Ereignisse gibt.
6. Bewertung der Wirksamkeit in vivo
- Wenn das Ziel der IVT-Injektion darin besteht, das Sehvermögen zu erhalten, überwachen Sie die Wirksamkeit in vivo durch Methoden wie Labyrinthtests oder Elektroretinographie (ERG) zur Beurteilung der Netzhautzellfunktion oder optische Kohärenztomographie (OCT) zur Beurteilung der Netzhautstruktur.
HINWEIS: Diese Wirksamkeitsmaßnahmen wurden nach der IVT-Gentherapie 11,15,16 gut beschrieben.
7. Postmortale Gewebeanalyse
- Durchführung der Schafeuthanasie nach einer zugelassenen Methode an einem geeigneten Endpunkt nach intravitrealer Injektionsoperation.
ANMERKUNG: Vorgeschlagene Euthanasiemethoden, wie intravenöse veterinärmedizinische Euthanasiemedikamente oder ein eindringender Bolzen an der Halswirbelsäule, gefolgt von einer schnellen Exsanguination, sind an anderer Stelle15,16 detailliert beschrieben. - Ernten Sie Schafaugenkugeln mit einer chirurgischen scharfen / stumpfen gebogenen Schere. Schneiden Sie die laterale und mediale Canthus, um die Öffnung der Augenhöhle zu vergrößern, und schneiden Sie dann systematisch durch die Bindehautfalten, das Bindegewebe, die Muskeln und den Sehnerv, um die Augenkugel von der Augenhöhle zu befreien.
- Intakte, enukleierte Augenkugeln in 10% Formalin für 2 h eintauchen, gefolgt von einer Nachfixierung in Bouins Lösung für 4 h, wobei ein kleiner (0,5 cm) Schnitt in der Sklera vorgenommen wird, um eine ausreichende Durchblutung zu ermöglichen. Alternativ können Sie die Augenkugeln für 48 Stunden in Davidsons Lösung eintauchen.
- Verarbeiten Sie Schnitte des Augengewebes durch routinemäßiges Einbetten und Schneiden von Paraffinwachs bei 3-5 μm.
ANMERKUNG: Färbeverfahren für Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung und immunhistochemische Analyse wurden zuvorbeschrieben 15,16. - Beurteilen Sie die Wirksamkeit in postmortalem Gewebe durch Maßnahmen wie Gesamtdicke der Netzhaut, Dicke der Netzhautschicht, Anzahl der Zellreihen der äußeren Kernschicht und immunhistochemische Färbung für retinale Zelltypen, retinale Gliazellen oder Proteine von Interesse.
HINWEIS: Protokolle für diese Analysen finden Sie in früheren Publikationen15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Wirksamkeit der IVT-Verabreichung eines CLN5-Gentherapievektors bei der Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL wurde bereits von dieser Forschungsgruppe15 nachgewiesen. Die betroffenen Schafe erhielten eine einmalige 100 μL IVT-Injektion von CLN5, verpackt in einem AAV-Serotyp 9 (AAV9) Vektor (AAV9). CLN5) in ein Auge, wobei das kontralaterale Auge als unbehandelte innere Kontrolle dient. Das Sehvermögen wurde monatlich vom Injektionsalter (3 Monate) bis zum Krankheitsendstadium (18 Monate) beurteilt. Die postmortale Analyse der Netzhauthistologie wurde an behandelten und unbehandelten Augen sowie an altersentsprechenden gesunden und CLN5-betroffenen Kontrollen durchgeführt.
Die Elektroretinographie-Analyse (ERG) zeigte eine erhaltene Netzhautfunktion im behandelten Auge, während das unbehandelte Auge in ähnlicher Weise wie bei CLN5-betroffenen Tieren abnahm (Abbildung 4)15. Die Netzhauthistologie war im behandelten Auge nahezu normalisiert, mit einer Gesamtnetzhautdicke, die mit der gesunder Kontrolltiere in der zentralen Netzhaut vergleichbar war. Im Gegensatz dazu war die Dicke der unbehandelten Netzhaut vergleichbar mit CLN5-betroffenen Tieren (Abbildung 5)15. Die lysosomale Speicherung, ein charakteristisches pathologisches Merkmal der NCL, wurde nicht im behandelten Auge beobachtet, war aber im unbehandelten Auge vorhanden15. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Gentherapievektor, der über die IVT-Injektion verabreicht wurde, in der Lage war, die Krankheitspathogenese im CLN5-betroffenen Schafauge zu stoppen. Die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP), einem Marker für Netzhautstress und Astroglia, war bei behandelten Augen niedriger als bei unbehandelten Augen, was darauf hindeutet, dass krankheitsassoziierte Entzündungen nach der Behandlung abgeschwächt wurden (Abbildung 6)15.
Abbildung 4: Dunkel-adaptierte ERG-Reaktionen von CLN5-/- Schafen nach intravitrealer Verabreichung von AAV9. CLN5. (A) Mittlere (± SEM) ERG-Amplituden über die Zeit in den behandelten (dunkelgrün, n = 3) und unbehandelten (hellgrün, n = 3) Augen von CLN5-/- Schafen sowie gesunden Kontroll- (blau, n = 6) und CLN5-betroffenen (rot, n = 6) Schafen. (B) Repräsentative ERG-Spuren von den behandelten und unbehandelten Augen und gesunden Kontrollen und betroffenen Schafen im Alter von 5 (schwarze Linie) und 17 (graue Linie) Monaten. * bedeutet P < 0,05. Diese Abbildung stammt von Murray et al.15 mit Genehmigung von Elsevier. Abkürzungen: ERG = Elektroretinographie; AAV = Adeno-assoziiertes Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Netzhautdicke von CLN5-/- Schafen nach intravitrealer Verabreichung von AAV9. CLN5. Repräsentative Mikroaufnahmen der histologischen H&E-Färbung in den behandelten und unbehandelten Augen von CLN5-/- Schafen im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrollen. Bilder und Dickenmessungen wurden an zwei Orten durchgeführt; zentrale Netzhaut (A-E) und periphere Netzhaut (F-J). (E) Mittlere (± SEM) Netzhautdicke (μm) in der zentralen Netzhaut der behandelten (dunkelgrün, n = 3) und unbehandelten (hellgrün, n = 3) Augen im Vergleich zu gesunder Kontroll- (blau, n = 4) und CLN5-betroffener (rot, n = 4) Netzhaut. (J) Mittlere (± SEM) Netzhautdicke (μm) in der peripheren Netzhaut der behandelten und unbehandelten Augen von CLN5-/- Schafen im Vergleich zu gesunder Kontroll- und CLN5-betroffener Netzhaut. * bedeutet P < 0,05, **** bedeutet P < 0,0001. Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung wurde von Murray et al.15 mit Genehmigung von Elsevier reproduziert. Abkürzungen: NFL = Nervenfaserschicht; GCL = Ganglienzellschicht; IPL = innere plexiforme Schicht; INL = innere Kernschicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; IS/OS = innere und äußere Segmente von Photorezeptoren; RPE = retinales Pigmentepithel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: GFAP-Immunreaktivität in der Netzhaut von CLN5-/- Schafen nach intravitrealer Verabreichung von AAV9. CLN5. Repräsentative konfokale Bilder der GFAP-Immunreaktivität in den behandelten und unbehandelten Augen von CLN5-/- Schafen im Vergleich zu Kontrollen. (A-D) GFAP-Immunreaktivität, (E-H) DAPI-Kernmarker, (I-L) Zusammengeführte Bilder der beiden Kanäle. Maßstabsbalken = 20 μm. Diese Abbildung wurde von Murray et al.15 mit Genehmigung von Elsevier reproduziert. Abkürzungen: NFL = Nervenfaserschicht; GCL = Ganglienzellschicht; INL = innere Kernschicht; ONL = äußere Kernschicht; IS/OS = innere und äußere Segmente von Photorezeptoren; GFAP = saures Gliafibrillenprotein; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitreale Injektionen sind eines der häufigsten chirurgischen Verfahren in der menschlichen Ophthalmologie und haben sich bei der Verabreichung von AAV-vermittelten Gentherapien an die Netzhaut von Schafen als wirksam erwiesen. Wir hatten zuvor die Wirksamkeit von AAV9 nachgewiesen. Die CLN5-Gentherapie führte intravitreal zur Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL15. Es ist zu hoffen, dass sich auch die Übertragung dieses Verabreichungsweges an menschliche NCL-Patienten als vorteilhaft erweisen wird.
Das Protokoll für kleinvolumige IVT-Injektionen in ein Schafauge ist relativ einfach und nichtinvasiv, leicht reproduzierbar und für einen Nicht-Experten leicht zu erlernen. Der Erfolg hängt von den Zielzellen innerhalb der Netzhaut, der Therapie sowie dem Ort und der Richtung der Injektion selbst ab. Obwohl oft angenommen wird, dass IVT-Injektionen am effektivsten auf innere Netzhautschichten abzielen, haben viele Forscher die Wirksamkeit von IVT-Injektionen bei Krankheiten gezeigt, bei denen die äußere Netzhaut der primäre Ort der Krankheitspathogenese ist15,17,18,19. Die Unterschiede in den funktionellen und pathologischen Ergebnissen nach IVT-Injektionen beziehen sich wahrscheinlich auch auf die Art der verabreichten Therapie. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Gentherapie zur Abgabe von Genen, die für lösliche Proteine (z. B. CLN5) kodieren, viel effektiver ist als Gentherapien, um Gene zu liefern, die intrazelluläre oder membrangebundene Proteine kodieren (z. B. CLN6)15. Unabhängig vom Ziel und der Art der Therapie ist es wichtig, die Injektionsstelle und den richtigen Winkel zu finden, um die Wirksamkeit zu maximieren. Wie im Prüfplan beschrieben, sollte die Injektionsstelle für Schafe etwa 7 mm hinter der Sklera auf der lateralen Seite des Auges liegen und nach hinten abgewinkelt sein, um auf den hinteren Glaskörper zu zielen. Das Anwinkeln der Nadel dient sowohl dazu, die Linse zu vermeiden als auch das injizierte Medikament so nah wie möglich an die Netzhaut zu richten. Die Verwendung einer Sicherheitsspritze mit einer fest angebrachten 28 G (oder kleiner) x 0,5 Zoll Low-Dead-Space-Nadel ist entscheidend, um injektionsbedingte Beschwerden und Totvolumen in der Nadel oder Nabe zu minimieren. Diese Längennadel kann vollständig in einem hinteren Winkel in das Schafauge eingeführt werden, ohne dass ein Operationsmikroskop und/oder das Risiko einer Punktion der Netzhaut besteht. Forscher, die Zugang zu einem Operationsmikroskop haben, können dies nutzen, um ein zusätzliches Maß an Sicherheit bei der Vermeidung von Netzhautstörungen zu bieten. Andernfalls reicht die Verwendung von Sicherheitsspritzen und die Kenntnis der Abmessungen der Schafaugenkugel im zu behandelnden Alter aus, um diesen Vorgang sicher durchzuführen15.
Wenn Sie das Auge greifen, um es medial zu drehen und die Injektionsstelle freizulegen, ist es wichtig, nicht gezahnte atraumatische Instrumente zu verwenden, um eine Beschädigung des empfindlichen Gewebes des Auges zu vermeiden. Wenn das Auge zentral positioniert ist, ist es relativ einfach, die bulbäre Bindehaut am Rand der Sklera und der Iris zu greifen und mit einer Hand zu drehen, während sie mit der anderen Hand injiziert. Wenn sich das Auge jedoch außerhalb der Mitte gedreht hat, was unter Vollnarkose auftreten kann, ist es oft notwendig, einen Hämostat zu verwenden, um die bulbäre Bindehaut zu klemmen und das Auge in Position zu drehen, so dass das Hämostat an Ort und Stelle bleibt, um mit dem Eingriff fortzufahren.
Die Schafaugen sind robust und erholten sich gut nach der IVT-Behandlung mit AAV9, das das Schaf CLN5 trug, wobei nur ein Schaf 1 Woche nach der Injektion eine Uveitis im behandelten Auge entwickelte15. In diesem Fall klang die Uveitis innerhalb von 1 Woche ab und hatte keinen langfristigen Einfluss auf das Sehvermögen. Abgesehen von diesem einen Fall wurden in der ersten veröffentlichten Studie15 oder in den >30 zusätzlichen Tieren des Forschungsprogramms, die im Alter von 3 Monaten, 6 Monaten oder 9 Monaten nach dem hier beschriebenen Protokoll injiziert wurden, keine negativen Auswirkungen von IVT-Injektionen berichtet. Es gibt jedoch zusätzliche quantitative Maßnahmen zur Injektionssicherheit, die Forscher in Betracht ziehen sollten, um ihre postoperativen Bewertungen zu ergänzen. Dazu gehören Messungen des Augeninnendrucks (IOD), Fundusbildgebung oder OCT. Bilder des Fundus vor und nach der Injektion können verdeutlichen, ob es aufgrund der Injektion zu einer Störung der Netzhaut gekommen ist, und langfristig einen Überblick über die Netzhautgesundheit im Allgemeinen geben.
In dem Fall, in dem ein fluoreszierender Marker injiziert wird, kann die Fluoreszenzbildgebung des Fundus bei der Visualisierung der Ausbreitung des injizierten Markershelfen 16,20. OCT kann verwendet werden, um die Netzhaut im Querschnitt in vivo sichtbar zu machen, um mögliche strukturelle Schäden nach der Injektion zu identifizieren und die Dicke der Netzhaut im Laufe der Zeit als Reaktion auf die Behandlung zu messen. Die Sehfunktion nach der Injektion kann auch durch ERG- oder Labyrinthtests15,16 beurteilt werden. Im Falle einer IVT-viralvermittelten Gentherapie sollten die Auswirkungen der Immunantwort und das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen AAV-Vektoren berücksichtigt werden. Obwohl nicht Teil des hier beschriebenen Protokolls für Schafe, wird vorgeschlagen, dass Probanden vor der Gentherapie auf das Vorhandensein von Anti-AAV-neutralisierenden Antikörpern getestet werden, unabhängig vom Verabreichungsweg, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen16,21. Die Leser werden auf eine umfassendere Diskussion der Frage der Immunantwort auf AAV von Whitehead et al.22 verwiesen.
Eine häufige Komplikation bei IVT-Eingriffen ist die subkonjunktivale Blutung (SCH)23, die auftreten kann, wenn die Kapillaren in der bulbären Bindehaut während des Nadeleinführens punktiert werden. Glücklicherweise ist SCH im Allgemeinen harmlos und löst sich innerhalb weniger Tage auf; Es ist jedoch am besten, Bindehautkapillaren beim Einführen der Nadel zu vermeiden. Nach der IVT-Injektion ist es wichtig, die injizierten Augen mit antibiotischen Augentropfen (z. B. Chloramphenicol) zu behandeln und die Augen auf Anzeichen einer Infektion oder Entzündung (Uveitis) zu überwachen. Ein weiteres häufiges Ereignis während IVT-Verfahren ist ein Anstieg des IOD. Diese Erhöhungen sind am häufigsten vorübergehende Druckspitzen in den Minuten nach der Injektion und verursachen keine dauerhaften Schäden24,25. Es gibt jedoch Fälle, in denen IOD berücksichtigt und überwacht werden sollte. Wenn vorbestehende Augenerkrankungen wie Glaukom vorliegen oder wenn höhere Volumina (≥100 μL) injiziert werden, sollte der IOD engmaschig überwacht werden, und eine prophylaktische Vorderkammerparazentese sollte in Betracht gezogen werden, um den Druck in der Augenkugelzu senken 4,16. Darüber hinaus können wiederholte Spitzen des IOD bei wiederholten IVT-Injektionen ein Problem darstellen und sollten wie oben4 abgeschwächt werden. Hier demonstrieren wir IVT für die Zwecke einer einzigen AAV-vermittelten Gentherapie; Daher sind die langfristigen Folgen wiederholter Injektionen keine große Überlegung.
Zu den Einschränkungen von IVT-Injektionen gehören die Notwendigkeit, anatomische Barrieren zu durchdringen, und die geringere Zielspezifität im Vergleich zu invasiveren Methoden. Zuerst wird die injizierte Substanz im Glaskörper verdünnt und hat dann einen Abstand, um durch die Glaskörperhöhle und das Netzhautgewebe zu den Zielzellen zu diffundieren. Dies bedeutet, dass die innere Netzhaut nach IVT-Injektion leichter transduziert wird als die äußere Netzhaut, und höhere Dosen erforderlich sein können, um der Verdünnung entgegenzuwirken26. Das hier beschriebene Protokoll betont, wie wichtig es ist, so nah wie möglich an die Netzhaut zu injizieren, um die Auswirkungen der Verdünnung und Diffusion durch den Glaskörper zu mildern. Daher wird der 0,5 Zoll/12,7 mm Nadelschaft in voller Länge in das Auge eingeführt. Der zusätzliche Vorteil des Einführens der vollen Nadellänge ist die geringere Wahrscheinlichkeit eines Flüssigkeitsrückflusses während der Injektion 4,27.
Obwohl dieses aktuelle Protokoll es auslässt, wird empfohlen, die Entfernung der Nadel nach der Injektion um mehrere Minuten zu verzögern, um die Wahrscheinlichkeit eines Flüssigkeitsrückflusses weiter zu verringern. Darüber hinaus sollte die Injektion langsam erfolgen, um sicherzustellen, dass der Strahl der injizierten Flüssigkeit die Netzhaut nicht stört oder einen schnellen Anstieg des IOD verursacht, und eine erhöhte Injektionsgeschwindigkeit beeinträchtigt die Diffusionsraten durch den Glaskörper28,29 nicht. Die innere begrenzende Membran (ILM) ist die primäre Barriere zwischen dem Glaskörper und der Netzhaut, die die Bewegung von Molekülen in die Netzhaut30 einschränkt. Die Durchlässigkeit des ILM kann jedoch durch Verdauung oder chirurgisches Peeling erhöht werden und wird wahrscheinlich im erkrankten Auge erhöht, was das Eindringen therapeutischer Moleküle erleichtert.
In Bezug auf die Zielspezifität hat die IVT-Verabreichung im Vergleich zu anderen intraokularen Routen wie subretinal und suprachoroidal am geringsten, wie oben und an anderer Stelle diskutiert10. Es werden jedoch routinemäßig neue Generationen von AAVs entwickelt, um Modifikationen einzudämmen, die das Targeting auf bestimmte Zelltypen verbessern oder Barrieren wie ILM31 effizienter überwinden. Die Verwendung solcher modifizierten Kapside hat die Transduktionseffizienz nach IVT-Verabreichung in einer Reihe von Modellspezies 5,32,33 erhöht.
Das Ziel der von Murray et al.15 beschriebenen Gentherapie war es, eine funktionelle Kopie des CLN5-Gens zu liefern; Daher ist ein Maß für die Wirksamkeit das Vorhandensein von transduzierten Zellen, die CLN5-Protein exprimieren. Wir haben versucht, die Immunhistochemie zu nutzen, um CLN5-transduzierte Zellen in der Netzhaut nachzuweisen, wie wir es routinemäßig in Schafhirngewebe tun; Der Antikörper, den wir typischerweise in frei schwebendem Hirngewebe verwenden, funktioniert jedoch nicht in paraffineingebettetem Netzhautgewebe. Die Fehlerbehebung und Untersuchung alternativer Wege zum Nachweis des interessierenden Gens oder Proteins in der Netzhaut ist im Gange, um die Wirksamkeit zu bewerten. Ein möglicher Weg, dies zu erreichen, ist die Injektion eines viralen Vektors, der ein Reportergen enthält (z. B. grün fluoreszierendes Protein; GFP) und die Beurteilung der GFP-Expression mittels Immunhistochemie. Eine weitere Möglichkeit, die Wirksamkeit zu beurteilen, ist die Verwendung quantitativer PCR zur Bestimmung der Transgenexpression.
Die Entwicklung von Protokollen für IVT-Injektionen bei großen Tieren ist ein entscheidender Schritt zur Behandlung degenerativer Erkrankungen der Netzhaut, insbesondere von Erkrankungen mit einer genetischen Komponente, da die IVT-Gentherapie ein vielversprechendes potenzielles Therapeutikum ist. Bei degenerativen Erkrankungen, bei denen die Netzhaut bereits zerbrechlich ist, birgt die IVT-Behandlung ein geringeres Risiko einer Netzhautablösung oder eines Netzhautrisses. Angesichts der Ähnlichkeiten in Größe und Struktur der Schafe und des menschlichen Auges ist die Optimierung der Dosis und des Volumens von IVT-Injektionen bei Schafen ein relevanter Schritt zur Übertragung in die Klinik. Dieses Papier beschreibt das Protokoll für die IVT-Injektion in das Schafauge, das sicher ist und eine sehr geringe Rate von okulären Entzündungsreaktionen zeigt. Diese Methode zeigt auch die Wirksamkeit der AAV9-vermittelten okulären Gentherapie zur Behandlung der retinalen Komponente von NCL bei Schafen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) für seine Unterstützung bei der Erstellung dieses Protokolls und der Durchführung der von Murray et al.15 beschriebenen Injektionen. Die Autoren würdigen auch die Finanzierung durch CureKids New Zealand, die Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc und die Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
