Summary
유리체 내 주사는 망막에 바이러스 매개 유전자 요법을 전달하기 위해 양 눈에서 수행되었습니다.
Abstract
망막에 치료제를 전달하는 방법에는 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 비롯한 여러 방법이 있습니다. IVT 약물 전달은 눈의 후방을 채우고 눈 구체의 모양을 유지하는 젤라틴 물질인 눈의 유리체액에 주사하는 것을 포함합니다. IVT 경로는 망막 하 전달보다 덜 구체적으로 표적화되지만 훨씬 덜 침습적이며 다양한 안구 질환에 대한 임상 환경에서 널리 사용됩니다.
우리는 이전에 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 치료 제품(AAV9)의 유리체내 전달의 효능을 입증했습니다. CLN5) 자연적으로 발생하는 CLN5 형태의 신경 세로이드 리포푸신증(NCL)이 있는 양에서. 영향을받은 양은 한쪽 눈에서 IVT 유전자 치료를 받았고 다른 쪽 눈은 내부 대조군으로 사용되었습니다. 망막 구조와 기능은 치료 후 최대 15개월까지 치료된 눈에서 유지된 반면, 치료되지 않은 눈은 사후 검사 중에 점진적으로 기능 저하와 심각한 위축을 보였습니다. 양 연구에 따르면 CLN5 유전자 치료 제품은 2021년 9월 미국 식품의약국(FDA)으로부터 후보 임상시험용 신약(IND)으로 승인되었습니다. 이 논문은 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.
Introduction
치료제를 망막에 전달하기 위해 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 포함하는 여러 방법이 사용될 수 있다. 각 투여 경로는 혈액 망막 장벽 또는 내부 및 외부 제한막과 같은 장벽을 극복하는 것을 포함하며 전달되는 약물 및 특정 망막 표적 1,2에 따라 효능 비율이 다릅니다.
IVT 약물 전달은 눈의 후방을 차지하는 젤라틴 물질 인 눈의 유리체 체액에 주사하는 것을 포함합니다. 유리체 유머의 주요 기능은 눈 구체의 모양을 유지하고 렌즈 및 망막과 같은 안구 조직을 제자리에 유지하는 것입니다. 유리체 체액은 주로 물로 구성되어 있으며 소량의 콜라겐, 히알루 론산 및 기타 비 콜라겐 성 단백질3. IVT 주사는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 및 여러 유전성 망막 이영양증 4,5를 포함한 광범위한 안구 상태를 치료하기 위해 일상적으로 사용되는 간단하고 일반적인 절차입니다.
뉴런 세로이드 리포푸시노스(NCL; Batten disease)는 뇌와 망막의 심각한 퇴행을 유발하는 치명적인 리소좀 축적 질환의 그룹입니다. 현재 주로 어린이에게 영향을 미치지 만 발병 연령과 질병 중증도가 다양한 다양한 다른 유전자 (CLN1-8, CLN10-14)의 돌연변이로 인한 NCL의 13 가지 알려진 변종이 있습니다6. NCL은인지 및 운동 저하, 발작 및 시력 상실을 포함한 일반적인 진행성 증상을 공유합니다. NCL에 대한 치료법은 없습니다. 그러나 뇌 유도 효소 대체 요법은 현재 CLN2 질환 7,8에 대한 임상 시험 중이며 AAV 매개 유전자 요법은 전임상 연구에서 큰 가능성을 보여 CLN5 유전자 요법에 대한 임상 시험은 2022 년에 시작될 것으로 예상됩니다 9,10.
다른 많은 종들은 고양이, 개, 양 및 소를 포함하여 자연적으로 발생하는 형태의 NCL을 개발합니다. NCL의 두 가지 양 모델은 현재 뉴질랜드에서 활발히 연구 중입니다 : 보더 데일 양의 CLN5 질병 모델과 사우스 햄프셔 양의 CLN6 질병 모델. 영향을받은 양은 망막 위축 및 시력 상실10,11을 포함하여 인간 질병의 많은 임상 적 및 병리학 적 특징을 나타냅니다. CLN5 질환이 있는 양에서 뇌 유도 CLN5 유전자 요법이 뇌 위축과 임상적 쇠퇴를 예방하거나 중단시킬 수 있지만, 치료받은 양은여전히 시력을 잃습니다9. 이것은 시력을 보존하고 더 나은 삶의 질을 유지하기 위해 망막을 치료할 필요성을 강조하여 양의 안구 유전자 치료를위한 프로토콜을 수립하게되었습니다.
양눈은 눈 구체 치수, 유리체 부피 및 망막 구조10,12,13의 유사성으로 인해 인간 눈의 좋은 모델을 나타냅니다. 이 논문은 소량의 (≤100 μL) 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 링컨 대학 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 지침 및 뉴질랜드 동물 복지법 (1999)과 일치합니다. 보더데일 양은 출생14 세에 진단을 받았고 링컨 대학교 연구 농장에서 관리되었습니다. 3개월 된 동형접합체(CLN5-/-) 암양 3마리가 왼쪽 눈에 IVT 단일 주사를 맞았고, 치료되지 않은 오른쪽 눈은 내부 대조군 역할을 했습니다. 전기 망막 조영술 및 병리학 데이터는 과거의 건강 및 영향을받은 대조군 데이터와 비교되었습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 벡터는 치킨 베타 작용(CBh) 프로모터와 코돈 최적화된 양 CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt)를 포함하는 자가 상보적인 아데노 관련 바이러스 혈청형 9였습니다. 바이러스 벡터는 미국 노스캐롤라이나주 노스캐롤라이나 대학교 벡터 코어에 의해 제공되었다.
1. 수술 전
- 수술 키트를 오토클레이브합니다(그림 1).
- 수술 전에 양을 24 시간 동안 금식하십시오.
- 수술 전에 생체중을 기록하십시오.
그림 1: 유리체내 수술 키트. IVT 수술에 필요한 도구에는 (1) 눈꺼풀을 열린 상태로 유지하는 검경과 (2) 구근 결막을 잡고 눈을 회전시키는 한 쌍의 구부러진 코 집게가 포함됩니다. (3) 구근 결막을 잡고 안와로 다시 굴러 들어간 경우 눈을 제자리에 고정하는 대체 도구로 직선 코 지혈 장치도 포함됩니다. 이 키트는 수술 전에 오토클레이브됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 수술 절차
- 동물을 제지하고 전자 클리퍼를 사용하여 목의 한쪽에서 경정맥 위로 양모를 면도하십시오.
- 경정맥 홈의 기저부에 압력을 가하여 경정맥을 폐색하고 융기된 정맥을 시각화합니다.
- 적절한 양의 디아제팜(0.3mg/kg)과 케타민(7.5mg/kg)을 멸균 주사기에 넣고 멸균 20G 바늘을 부착합니다. 바늘을 경정맥에 삽입하고 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 혈액이 허브로 들어가고 바늘이 정맥 내부에 있는지 확인합니다. 일단 확인되면, 정맥 (jugular) 투여를 통해 유도한다.
- 유도 직후 동물을 등쪽 누운 자세에 놓고 목을 펴고 후두경을 사용하여 후두를 시각화하여 혀를 위아래로 잡습니다. 동물이 숨을 내쉴 때 성대 사이에 기관 내 튜브 (양의 크기에 따라 크기 6.0-9.0)를 부드럽게 삽입하여 기관 내 삽관을 수행하십시오. 기관 내 커프를 즉시 팽창시키고 아래턱 주위에 넥타이로 튜브를 고정하십시오. 튜브를 통한 공기 흐름을 확인하십시오.
- 양을 수술대로 옮기고 옆으로 누운 곳에 놓습니다.
- 기관 내 튜브를 마취기의 호스에 즉시 연결하여 100 % 산소에서 이소 플루 란을 전달합니다. 처음에는 3%-4% 이소플루란으로 시작한 다음 유지 관리를 위해 2%-3%로 줄입니다. 양의 자발적인 환기를 관찰하십시오.
- 시술 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수, 산소 포화도, 호기말CO2 수준 및 직장 체온을 모니터링합니다. 마취된 양에서 이러한 매개변수에 대한 생리학적 값은 표 1 을 참조하십시오(가변적이지만 지침으로 사용).
- 수술용 카트에 크고 멸균된 사각형 드레이프를 놓고 멸균 기구를 그 뒤에 놓습니다.
- 주사할 눈 위에 멸균된 수술용 드레이프를 놓습니다.
- 멸균 된 20mL 주사기를 사용하여 눈을 무균 적으로 소독하여 1-5 % 포비돈-요오드 용액으로 눈을 관개하십시오.
- 알카인 0.5% W/V 안액에 1-2방울을 국소 마취제로 눈에 바릅니다.
- 노파 바라케르-콜리브리 눈 검경(10mm)을 눈꺼풀에 맞추어 눈을 뜨게 합니다.
- 집게로 눈의 배외측 쪽에 있는 구근 결막을 잡고 눈 지구를 복측으로 회전시킵니다.
| 의식 | 마 취 | 권장되는 중요 개입 지점 | |
| 심박수(비트/분) | 50-80(휴식)에서 280(활성) | 50-80 | <50, >100 |
| 호흡수(호흡수/분) | 15-40 (휴식)에서 350 (과열) | 10-30 | <8, >40 |
| 산소 포화도 (밀리미터 Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| 호기말 CO2 (mmHg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| 체온 (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
표 1 : 마취 된 양에서 모니터링 할 매개 변수의 생리 학적 값.
3. 바이러스 제제
- AAV 벡터 분취량은 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 수술 당일, 얼음에서 IVT 전달에 필요한 수의 바이알을 해동하십시오.
- 투여 직전에, 바이러스 벡터 분취량을 400 × g 에서 10초 동안 와동시켜 내용물을 수집하였다.
- 멸균 여과된 1x 인산완충 식염수(PBS)에 각 바이러스 벡터 분취량을 최종 부피 100μL의 원하는 용량으로 희석합니다. 멸균 필터 피펫 팁을 사용하여 멸균된 1.5mL 저단백질 결합 마이크로원심분리 튜브에서 벡터 희석액을 준비합니다. 바이러스 벡터와 접촉 한 모든 소모품을 소독액에 폐기하십시오 ( 재료 표 참조).
참고: 원래 간행물15 에서 치료제(AAV9. CLN5)는 1.9 x 1010 바이러스 게놈이었다. 권장 복용량은 투여되는 치료제에 따라 다릅니다. 따라서 여기에 제시된 표준 프로토콜에는 복용량이 포함되지 않았습니다. - AAV 벡터 제제의 전체 100μL를 즉시 주입할 수 있도록 바늘에 영구적으로 부착된 28G x 1/2가 있는 멸균된 저사수 공간 1mL 주사기에 넣습니다. 준비에서 주사까지의 시간이 2분 미만인지 확인하십시오.
4. 바이러스 투여
- 바늘을 눈의 측면에있는 공막에 약 7mm 뒤쪽으로 삽입하고 렌즈를 피하기 위해 뒤쪽으로 기울입니다 (그림 2 및 그림 3). 100 μL의 단일 주사를 망막 표면을 교란하지 않고 가능한 한 망막에 가까운 볼루스로 투여한다.
- 검경과 드레이프를 제거하기 전에 약 10-15mL의 1-5% 포비돈-요오드 용액과 10mL의 식염수로 눈을 헹굽니다.
- 양을 뒤집고 필요한 경우 다른 눈으로 반복하십시오.
그림 2: 눈 지구본의 복측 회전. (A) 톱니가 없는 겸자로 구근 결막을 잡고 (B) 복부로(즉, 아래쪽으로) 회전하여 주사를 위해 눈의 등측 표면을 노출시킵니다. 약어 : V = 복부, D = 등쪽, M = 내측, L = 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 사출 위치 및 깊이. 바늘은 눈 지구본의 등측 측면에 주입되고 바늘 샤프트의 전체 길이(0.5인치/12.7mm)가 눈에 삽입됩니다. 렌즈를 피하고 가능한 한 망막에 가깝게 주입하기 위해 눈의 뒤쪽을 향한 바늘의 각도에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 수술 후 관리
- 절차가 완료되면 이소 플루 란 가스 흡입 마취를 중단하고 100 % 산소로 라인을 세척하고 기관 내 튜브에서 호스를 분리 한 다음 양을 회복실로 옮깁니다.
- 양을 흉골 누운 자세로 놓고 다리를 아래에 집어 넣고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 동물의 입에 장애물이 없는지 확인하십시오.
- 삼키는 반사가 관찰되면 기관 내 튜브의 커프를 부분적으로 수축시키고 입에서 튜브를 부드럽게 제거하십시오.
- 뒷다리의 이두근 대퇴근에 근육 내 비 스테로이드 성 항염증제를 투여하고 목 옆이나 어깨 뒤쪽의 피하 항생제를 투여하고 0.5 % 클로람페니콜 점안액을 눈 구체 표면에 투여합니다.
- 양이 도움 없이 설 수 있게 되면 물과 음식(루체른 알갱이와 왕겨)을 제공하십시오.
- 수술 후 7 일 동안 하루에 2-3 % 0.5 % 클로람페니콜 안약을 투여하십시오.
- 수술 후 약 24 시간 후에 야외 목장으로 돌아 오기 전에 양을 밤새 실내에 두십시오.
- 3 주 동안 매일 직장 온도를 기록하십시오. 맥박 또는 호흡수, 음식 섭취, 신경 행동, 체온, 체중, 자세, 눈 건강 및 건강 악화의 임상 징후의 변화를 모니터링합니다. 부작용의 징후가있는 경우 적절한 수의 치료를 받으십시오.
6. 생체 내 효능 평가
- IVT 주사의 목표가 시력을 보존하는 것이라면 망막 세포 기능을 평가하기 위한 미로 검사 또는 전기 망막 조영술(ERG) 또는 망막 구조를 평가하기 위한 광학 간섭 단층 촬영(OCT)과 같은 방법으로 생체 내 효능을 모니터링합니다.
참고: 이러한 효능 측정은 IVT 유전자 요법11,15,16 이후에 잘 설명되었습니다.
7. 사후 조직 분석
- 유리체 내 주사 수술 후 적절한 종말점에서 승인 된 방법으로 양 안락사를 수행하십시오.
참고: 정맥 주사 수의학 안락사 약물 또는 경추에 관통하는 포로 볼트와 같은 제안된 안락사 방법은15,16의 다른 곳에 자세히 설명되어 있습니다. - 외과 용 날카 롭고 뭉툭한 곡선 가위를 사용하여 양 눈 지구를 수확합니다. 측면 및 내측 칸투스를 절단하여 눈 소켓 개구부를 늘린 다음 결막 주름, 결합 조직, 근육 및 시신경을 체계적으로 절단하여 소켓에서 눈 지구를 제거합니다.
- 2 시간 동안 10 % 포르말린에 온전한 상태로 핵을 제거한 눈 구체를 침지 고정시킨 다음 4 시간 동안 Bouin의 용액에 후고정하여 충분한 관류를 허용하기 위해 공막에서 작은 (0.5cm) 절단을합니다. 또는 데이비슨의 용액에 아이 글로브를 48시간 동안 침지하여 고정할 수 있습니다.
- 일상적인 파라핀 왁스 매립 및 3-5 μm의 절편을 통해 눈 조직의 절편을 처리합니다.
참고: 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 면역조직화학 분석을 위한 염색 절차는 이전에15,16에 기술되었다. - 망막 세포 유형, 망막 아교 세포 또는 관심 단백질에 대한 총 망막 두께, 망막 층 두께, 외부 핵층 세포 열 수 및 면역 조직 화학적 염색과 같은 측정을 통해 사후 조직의 효능을 평가합니다.
참고: 이러한 분석에 대한 프로토콜은 이전 간행물15,16을 참조하십시오.
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Representative Results
CLN5 NCL을 가진 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 CLN5 유전자 요법 벡터의 IVT 전달의 효능은 이전에 이 연구 그룹15에 의해 입증되었습니다. 영향을 받은 양은 AAV 혈청형 9(AAV9) 벡터(AAV9)에 패키징된 CLN5의 단일 100μL IVT 주사를 받았습니다. CLN5)를 한쪽 눈으로, 반대쪽 눈은 치료되지 않은 내부 대조군 역할을합니다. 시력은 주사 시점의 연령 (3 개월)부터 말기 질환 (18 개월)까지 매월 평가되었다. 망막 조직학의 사후 분석은 치료된 눈과 치료되지 않은 눈뿐만 아니라 연령이 일치하는 건강한 대조군과 CLN5에 영향을 받은 대조군에서 수행되었습니다.
망막 조영술(ERG) 분석은 치료된 눈에서 보존된 망막 기능을 입증한 반면, 치료되지 않은 눈은 CLN5에 영향을 받은 동물과 유사한 방식으로 감소했습니다(그림 4)15. 망막 조직학은 치료 된 눈에서 거의 정상화되었으며, 총 망막 두께는 중앙 망막의 건강한 대조군 동물과 비슷했습니다. 대조적으로, 처리되지 않은 망막의 두께는 CLN5에 영향을 받은 동물과 비슷했습니다(그림 5)15. NCL의 특징적인 병리학 적 특징 인 리소좀 저장은 치료 된 눈에서는 관찰되지 않았지만 치료되지 않은 눈에서는 존재했다15. 이러한 결과는 IVT 주사를 통해 전달된 유전자 치료 벡터가 CLN5에 영향을 받은 양눈에서 질병 발병기전을 중단시킬 수 있음을 보여줍니다. 망막 스트레스와 성상교세포의 지표인 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP)의 발현은 치료하지 않은 눈보다 치료된 눈에서 더 낮았으며, 이는 치료 후 질병 관련 염증이 약화되었음을 나타냅니다(그림 6)15.
그림 4: AAV9의 유리체내 전달 후 CLN5-/- 양의 어둠 적응 ERG 반응. CLN5. (a) CLN5-/ - 양의 처리된(짙은 녹색, n=3) 및 처리되지 않은(연한 녹색, n=3) 눈에서 시간에 따른 ERG 진폭을 평균(±)하고, 뿐만 아니라 건강한 대조군(청색, n=6) 및 CLN5에 영향을 받은 양(적색, n=6)의 양. (B) 대표적인 ERG는 생후 5개월(검은색 선) 및 17개월(회색 선)에 치료된 눈과 건강한 대조군 및 영향을 받은 양에서 추적합니다. *는 P < 0.05를 나타냅니다. 이 수치는 엘스비어의 허가를 받아 Murray et al.15 에서 가져온 것입니다. 약어 : ERG = 전기 망막 조영술; AAV = 아데노 관련 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: AAV9의 유리체내 전달 후 CLN5-/- 양의 망막 두께. CLN5. 연령 일치 대조군과 비교하여 CLN5-/- 양의 처리된 눈과 치료되지 않은 눈에서의 H&E 조직학적 염색의 대표적인 현미경 사진. 이미지와 두께 측정은 두 위치에서 촬영되었습니다. 중심 망막 (A-E) 및 말초 망막 (FJ). (e) 건강한 대조군(청색, n=4) 및 CLN5에 영향을 받은 (적색, n=4) 망막에 비해 처리된 (짙은 녹색, n=3) 및 처리되지 않은(연한 녹색, n=3) 눈의 중심 망막 내의 망막 두께(μm)를 평균(± SEM)하였다. (J) 건강한 대조군 및 CLN5 영향을받은 망막과 비교 한 CLN5-/- 양의 치료 및 치료되지 않은 눈의 말초 망막에서의 평균 (± SEM) 망막 두께 (μm). *는 P < 0.05를 나타내고, ****는 P < 0.0001을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm. 이 수치는 엘스비어의 허가를 받아 Murray et al.15에서 복제한 것입니다. 약어 : NFL = 신경 섬유층; GCL = 신경절 세포층; IPL = 내부 플렉시 폼 층; INL = 내부 핵층; OPL = 외부 플렉시 폼 층; ONL = 외부 핵층; IS/OS = 광수용체의 내부 및 외부 세그먼트; RPE = 망막 색소 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: AAV9의 유리체내 전달 후 CLN5-/- 양의 망막에서 GFAP 면역반응성. CLN5. 대조군과 비교하여 CLN5-/- 양의 치료된 눈과 치료되지 않은 눈에서 GFAP 면역반응성의 대표적인 공초점 이미지. (주후) GFAP 면역반응성, (E-H) DAPI 핵 마커, (I-L) 두 채널의 병합된 이미지. 스케일 바 = 20 μm. 이 수치는 엘스비어의 허가를 받아 Murray et al.15에서 복제한 것입니다. 약어 : NFL = 신경 섬유층; GCL = 신경절 세포층; INL = 내부 핵층; ONL = 외부 핵층; IS/OS = 광수용체의 내부 및 외부 세그먼트; GFAP = 신경교 섬유 산성 단백질; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유리체 내 주사는 인간 안과에서 가장 일반적인 수술 절차 중 하나이며 양의 망막에 AAV 매개 유전자 요법을 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 우리는 이전에 AAV9의 효능을 입증했습니다. CLN5 유전자 요법은 CLN5 NCL15로 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 유리체 내 전달을 받았습니다. 인간 NCL 환자에게이 투여 경로의 번역이 또한 유익한 것으로 입증 될 것으로 기대된다.
양의 눈에 소량 IVT 주사를 위한 프로토콜은 비교적 간단하고 비침습적이며 쉽게 재현할 수 있고 비전문가도 쉽게 배울 수 있습니다. 성공 여부는 망막 내의 표적 세포, 전달되는 치료법, 주사 자체의 위치와 방향에 달려 있습니다. IVT 주사는 종종 망막 내층을 표적으로 하는 데 가장 효과적인 것으로 생각되지만, 많은 연구자들은 망막 외막이 질병 발병기전의 주요 위치인 질병에서 IVT 주사의 효능을 입증했습니다 15,17,18,19. IVT 주사 후 기능적 및 병리학적 결과의 차이는 또한 주어진 치료의 유형과 관련이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 가용성 단백질 (예를 들어, CLN5)을 코딩하는 유전자를 전달하는 유전자 요법은 세포 내 또는 막 결합 단백질 (예를 들어, CLN6)을 코딩하는 유전자를 전달하는 유전자 요법보다 훨씬 더 효과적인 것으로 나타났다 15. 치료의 대상과 유형에 관계없이 효능을 극대화하기 위해 주사 부위와 각도를 정확하게 하는 것이 중요합니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이, 양의 주사 부위는 눈의 측면 측면에서 공막의 뒤쪽으로 약 7mm 떨어져 있어야 하며 후방 유리체를 표적으로 하기 위해 뒤쪽으로 기울어져 있어야 합니다. 바늘의 각도는 렌즈를 피하고 주사 된 약물을 가능한 한 망막에 가깝게 향하게하는 것입니다. 저사각 공간 바늘에 영구적으로 부착된 28G(또는 그 이하) x 0.5가 있는 안전 주사기를 사용하는 것은 주사 관련 불편함과 바늘 또는 허브에 남아 있는 죽은 부피를 최소화하는 데 중요합니다. 이 길이의 바늘은 수술 현미경 및/또는 망막에 구멍을 뚫을 위험 없이 후방 각도로 양 눈에 완전히 삽입할 수 있습니다. 수술용 현미경에 접근할 수 있는 연구원은 이를 사용하여 망막 파괴를 방지하는 데 대한 추가 확실성을 제공할 수 있습니다. 그렇지 않으면 안전 주사기를 사용하고 치료받는 나이에 양 눈 지구본의 치수를 인식하는 것만으로도 이 절차를 안전하게 수행할 수 있습니다15.
눈을 잡고 내측으로 회전시키고 주사 부위를 노출시킬 때 눈의 섬세한 조직이 손상되지 않도록 톱니가 없는 무외상 기구를 사용하는 것이 필수적입니다. 눈이 중앙에 위치하면 공막과 홍채의 경계에있는 구근 결막을 잡고 한 손으로 회전하면서 다른 손으로 주사하는 것이 비교적 간단합니다. 그러나 전신 마취하에 발생할 수있는 눈이 중심에서 벗어나 회전 한 경우 지혈제를 사용하여 구근 결막에 고정하고 눈을 제자리로 돌리고 지혈제를 제자리에 두어 절차를 계속해야합니다.
양의 눈은 튼튼하고 CLN5를 운반하는 AAV9로 IVT 치료 후 잘 회복되었으며, 주사 후 1주일 후에 치료된 눈에서 포도막염이 발생한 양은 한 마리뿐입니다15. 이 경우 포도막염은 1 주일 이내에 해결되었으며 시력에 장기적인 영향을 미치지 않았습니다. 이 한 가지 경우를 제외하고, IVT 주사의 부정적인 영향은 처음 발표 된 연구15 또는 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 3 개월, 6 개월 또는 9 개월령에 주사 된 연구 프로그램의 >30 추가 동물에서보고되지 않았습니다. 그러나 연구자들이 수술 후 평가에 추가하는 것을 고려할 수 있는 주사 안전성에 대한 추가적인 정량적 측정이 있습니다. 여기에는 안압(IOP), 안저 영상 또는 OCT 측정이 포함됩니다. 주사 전후의 안저 이미지는 주사로 인해 망막이 손상되었는지 여부를 강조할 수 있으며 장기적으로 일반적으로 망막 건강에 대한 개요를 제공할 수 있습니다.
형광 마커가 주입되는 경우에, 안저의 형광 영상화는 주입된 마커(16, 20)의 확산을 가시화하는데 도움을 줄 수 있다. OCT는 생체 내 단면에서 망막을 시각화하여 주입 후 잠재적인 구조적 손상을 식별하고 치료에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 망막의 두께를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 주입 후 시각 기능은 ERG 또는 미로 테스트15,16으로도 평가할 수 있습니다. IVT 바이러스 매개 유전자 요법의 경우, 면역 반응의 영향 및 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 존재를 고려해야 한다. 양에 대해 여기에 설명된 프로토콜의 일부는 아니지만, 형질도입 효율을 증가시키기 위해 투여 경로에 관계없이 유전자 치료 전에 피험자에게 항-AAV 중화 항체의 존재 여부를 테스트하는 것이 좋습니다16,21. 독자들은 Whitehead et al.22에 의해 AAV에 대한 면역 반응 문제에 대한보다 포괄적 인 논의를 참조합니다.
IVT 시술 중 흔한 합병증은 결막 하 출혈 (SCH)23이며, 이는 바늘 삽입 중에 구근 결막의 모세 혈관에 구멍이 뚫린 경우 발생할 수 있습니다. 다행히 SCH는 일반적으로 무해하며 며칠 내에 해결됩니다. 그러나 바늘을 삽입 할 때 결막 모세 혈관을 피하는 것이 가장 좋습니다. IVT 주사 후 주사된 눈을 항생제 점안액(예: 클로람페니콜)으로 치료하고 감염이나 염증(포도막염)의 징후가 있는지 눈을 모니터링하는 것이 중요합니다. IVT 절차 중 또 다른 일반적인 사건은 안압의 증가입니다. 이러한 증가는 가장 일반적으로 주입 후 몇 분 동안 일시적인 압력 스파이크이며 오래 지속되는 손상을 일으키지 않습니다24,25. 그러나 IOP를 고려하고 모니터링해야하는 경우가 있습니다. 녹내장과 같은 기존 안구 질환이 존재하거나 더 많은 부피 (≥100 μL)가 주입되는 경우 안압을 면밀히 모니터링하고 안구 4,16의 압력을 줄이기 위해 예방 적 전방 천자를 고려해야합니다. 또한, 반복적인 IVT 주사의 경우 IOP의 반복적인 스파이크가 우려될 수 있으며 상기4와 같이 감쇠되어야 한다. 여기에서 우리는 단일 AAV 매개 유전자 요법의 목적으로 IVT를 시연하고 있습니다. 따라서 반복 주사의 장기적인 결과는 주요 고려 사항이 아닙니다.
IVT 주사의 한계에는 해부학적 장벽을 통과해야 할 필요성과 보다 침습적인 방법에 비해 표적 특이성이 낮다는 점이 포함됩니다. 먼저, 주입된 물질은 유리체에서 희석된 다음 유리체강과 망막 조직을 통해 표적 세포로 확산되는 거리를 갖게 된다. 이는 IVT 주사 후 내부 망막이 외부 망막보다 더 쉽게 형질도입되며 희석을 막기 위해 더 높은 용량이 필요할 수 있음을 의미합니다26. 여기에 설명된 프로토콜은 유리체를 통한 희석 및 확산의 영향을 완화하기 위해 가능한 한 망막에 가깝게 주입하는 것의 중요성을 강조합니다. 따라서 0.5인치/12.7mm 니들 샤프트의 전체 길이가 눈에 삽입됩니다. 전체 바늘 길이를 삽입하는 또 다른 이점은 주입 4,27 동안 유체 역류 가능성이 감소한다는 것입니다.
이 현재 프로토콜은 이를 생략하지만 유체 역류의 가능성을 더욱 줄이기 위해 주입 후 몇 분 동안 바늘 제거를 지연시키는 것이 좋습니다. 또한, 주입 된 유체의 제트가 망막을 파괴하거나 IOP의 급격한 스파이크를 일으키지 않도록 주입을 천천히 수행해야하며, 주입 속도 증가가 유리체28,29를 통한 확산 속도에 영향을 미치지 않도록해야합니다. 내부 제한막(ILM)은 유리체와 망막 사이의 1차 장벽이며, 이는 망막(30) 내로의 분자의 이동을 제한하는 기능을 한다. 그러나 ILM의 투과성은 소화 또는 외과 적 박리에 의해 증가 될 수 있으며 병든 눈에서 증가하여 치료 분자의 침투가 더 쉬워집니다.
표적 특이성과 관련하여, IVT 투여는 상기 및 다른 곳에서 논의된 바와 같이 망막하 및 흉막과 같은 다른 안구내 경로에 비해 가장 적다(10). 그러나, 새로운 세대의 AAV는 특정 세포 유형에 대한 표적화를 향상시키거나 ILM31과 같은 장벽을 보다 효율적으로 극복하는 변형을 포함하도록 일상적으로 개발되고 있다. 이러한 변형된 캡시드의 사용은 다수의 모델 종 5,32,33에서 IVT 투여 후 형질도입 효율을 증가시켰다.
Murray et al.15 에 의해 자세히 설명된 유전자 치료의 목적은 CLN5 유전자의 기능적 사본을 전달하는 것이었습니다. 따라서, 효능의 한 척도는 CLN5 단백질을 발현하는 형질도입된 세포의 존재이다. 우리는 양 뇌 조직에서 일상적으로하는 것처럼 망막에서 CLN5 형질 도입 된 세포를 검출하기 위해 면역 조직 화학을 사용하려고 시도했습니다. 그러나 우리가 일반적으로 자유 부유 뇌 조직에서 사용하는 항체는 파라핀이 묻힌 망막 조직에서는 작동하지 않습니다. 망막에서 관심있는 유전자 또는 단백질을 검출하는 대안적인 방법의 문제 해결 및 조사는 효능 평가에 추가하기 위해 진행 중이다. 이를 달성하는 한 가지 잠재적인 방법은 리포터 유전자(예: 녹색 형광 단백질; 증권 시세 표시기) 면역조직화학을 통한 GFP 발현 평가. 효능을 평가하는 또 다른 방법은 정량적 PCR을 사용하여 전이유전자 발현 수준을 평가하는 것입니다.
IVT 유전자 요법이 유망한 잠재적 치료법이기 때문에 대형 동물에서 IVT 주사를 위한 프로토콜을 개발하는 것은 망막의 퇴행성 질환, 특히 유전적 요소가 있는 질병을 치료하는 데 중요한 단계입니다. 망막이 이미 취약한 퇴행성 질환의 경우 IVT 치료는 망막 박리 또는 파열의 위험이 적습니다. 양과 인간의 눈의 크기와 구조의 유사성을 감안할 때, 양에서 IVT 주사의 용량과 양을 최적화하는 것은 클리닉으로의 번역을 위한 관련 단계입니다. 이 논문은 안전하고 매우 낮은 안구 염증 반응 비율을 보여주는 양 눈에 IVT 주사 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 방법은 또한 양에서 NCL의 망막 구성 요소를 해결하기 위한 AAV9 매개 안구 유전자 요법의 효능을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Steve Heap 박사 (BVSc, CertVOphthal)가이 프로토콜을 수립하고 Murray et al.15에 의해 설명 된 주사를 수행하는 데 도움을 준 것에 대해 인정하고자합니다. 저자는 또한 CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc 및 Batten Disease Support and Research Association의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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