Summary
Le iniezioni intravitreali sono state eseguite nell'occhio di pecora con l'obiettivo di fornire la terapia genica mediata da virus alla retina.
Abstract
Esistono diversi metodi per la somministrazione di agenti terapeutici alla retina, tra cui la somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che riempie la camera posteriore dell'occhio e mantiene la forma del globo oculare. Sebbene la via IVT sia meno mirata rispetto alla somministrazione sottoretinica, è molto meno invasiva ed è ampiamente utilizzata in ambito clinico per una serie di malattie oculari.
Abbiamo precedentemente dimostrato l'efficacia della somministrazione intravitreale di un prodotto di terapia genica mediato da virus adeno-associati (AAV) (AAV9). CLN5) in pecore con una forma naturale CLN5 di ceroide lipofuscinosi neuronale (NCL). Le pecore affette hanno ricevuto la terapia genica IVT in un occhio, con l'altro occhio non trattato che funge da controllo interno. La struttura e la funzione retinica sono state mantenute nell'occhio trattato fino a 15 mesi dopo il trattamento, mentre l'occhio non trattato ha mostrato una funzione progressivamente in declino e una grave atrofia durante l'esame post mortem. Sulla base degli studi sulle pecore, il prodotto di terapia genica CLN5 è stato approvato come nuovo farmaco sperimentale candidato (IND) dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti nel settembre 2021. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un vettore virale terapeutico all'occhio ovino.
Introduction
Diversi metodi possono essere utilizzati per fornire agenti terapeutici alla retina, tra cui somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. Ogni via di somministrazione comporta il superamento di barriere come la barriera emato-retina o le membrane limitanti interne ed esterne e ha tassi di efficacia variabili a seconda del farmaco somministrato e del bersaglio retinico specifico 1,2.
La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che occupa la camera posteriore dell'occhio. La funzione primaria dell'umore vitreo è quella di mantenere la forma del globo oculare e mantenere i tessuti oculari, come la lente e la retina, in posizione. L'umore vitreo è composto in gran parte da acqua, con piccole quantità di collagene, acido ialuronico e altre proteine non collagene3. L'iniezione IVT è una procedura semplice e comune utilizzata di routine per trattare una vasta gamma di condizioni oculari, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, l'edema maculare diabetico, la retinopatia diabetica, l'occlusione venosa retinica e diverse distrofie retiniche ereditarie 4,5.
Ceroidolipofuscinosi neuronale (NCL; Malattia di Batten) sono un gruppo di malattie da accumulo lisosomiale fatali che causano una grave degenerazione del cervello e della retina. Attualmente sono note 13 varianti di NCL derivanti da mutazioni in diversi geni (CLN1-8, CLN10-14) che colpiscono prevalentemente i bambini ma hanno diverse età di insorgenza e gravità della malattia6. Le NCL condividono sintomi progressivi comuni, tra cui declino cognitivo e motorio, convulsioni e perdita della vista. Non esiste una cura per NCL; tuttavia, la terapia enzimatica sostitutiva diretta al cervello è attualmente in studi clinici per la malattia CLN27,8 e la terapia genica mediata da AAV ha mostrato grandi promesse negli studi preclinici, con una sperimentazione clinica per la terapia genica CLN5 che dovrebbe iniziare nel 2022 9,10.
Molte altre specie sviluppano forme naturali di NCL, tra cui gatti, cani, pecore e mucche. Due modelli ovini di NCL sono attualmente in fase di studio attivo in Nuova Zelanda: un modello di malattia CLN5 nelle pecore di Borderdale e un modello di malattia CLN6 nelle pecore del South Hampshire. Le pecore colpite presentano molte delle caratteristiche cliniche e patologiche della malattia umana, tra cui l'atrofia retinica e la perdita della vista10,11. Sebbene la terapia genica CLN5 diretta al cervello nelle pecore con malattia CLN5 possa prevenire o arrestare l'atrofia cerebrale e il declino clinico, le pecore trattate perdono ancora la vista9. Ciò ha evidenziato la necessità di trattare la retina per preservare la vista e mantenere una migliore qualità della vita, portando alla creazione di un protocollo per la terapia genica oculare negli ovini.
L'occhio di pecora rappresenta un buon modello dell'occhio umano grazie alla sua somiglianza nelle dimensioni del globo oculare, nel volume vitreo e nella struttura retinica10,12,13. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un piccolo volume (≤100 μL) di vettore virale terapeutico all'occhio ovino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico degli animali della Lincoln University e sono in linea con le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il New Zealand Animal Welfare Act (1999). Le pecore di Borderdale sono state diagnosticate alla nascita14 e mantenute nelle fattorie di ricerca della Lincoln University. Tre pecore omozigoti di 3 mesi (CLN5-/-) hanno ricevuto una singola iniezione IVT all'occhio sinistro, con l'occhio destro non trattato che fungeva da controllo interno. I dati di elettroretinografia e patologia sono stati confrontati con i dati storici di controllo sani e affetti. Il vettore virale utilizzato in questo studio era un sierotipo 9 del virus adeno-associato autocomplementare, contenente il promotore dell'azione beta del pollo (CBh) e l'ovino CLN5 ottimizzato per il codone (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Il vettore virale è stato fornito dalla University of North Carolina Vector Core, NC, USA.
1. Pre-chirurgia
- Autoclavare il kit chirurgico (Figura 1).
- Digiunare le pecore per 24 ore prima dell'intervento.
- Registrare pesi vivi prima dell'intervento chirurgico.
Figura 1: Kit di chirurgia intravitreale. Gli strumenti necessari per la chirurgia IVT includono (1) uno speculum per tenere aperte le palpebre e (2) un paio di pinze per il naso curvo per afferrare la congiuntiva bulbare e ruotare l'occhio. (3) Un emostatico naso dritto è incluso anche come strumento alternativo per afferrare la congiuntiva bulbare e tenere l'occhio in posizione se è tornato nell'orbita dell'occhio. Questo kit viene autoclavato prima dell'intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Procedura chirurgica
- Trattenere l'animale e, usando tagliatrici elettroniche, radere la lana da un lato del collo sopra la vena giugulare.
- Occludere la vena giugulare applicando pressione alla base del solco giugulare e visualizzare la vena sollevata.
- Aspirare la quantità appropriata di diazepam (0,3 mg/kg) e ketamina (7,5 mg/kg) in una siringa sterile e inserire un ago sterile da 20 G. Inserire l'ago nella vena giugulare e tirare delicatamente indietro sullo stantuffo per assicurarsi che il sangue entri nel mozzo e l'ago sia all'interno della vena. Una volta confermato, indurre attraverso la somministrazione endovenosa (giugulare).
- Immediatamente dopo l'induzione, posizionare l'animale in posizione dorsale, estendere il collo e tenere la lingua in alto e in avanti, usando un laringoscopio per visualizzare la laringe. Eseguire l'intubazione endotracheale inserendo delicatamente un tubo endotracheale (taglia 6.0-9.0 a seconda delle dimensioni della pecora) tra le corde vocali quando l'animale espira. Gonfiare immediatamente il bracciale endotracheale e fissare il tubo con una cravatta intorno alla mascella inferiore. Confermare il flusso d'aria attraverso il tubo.
- Trasferire la pecora sul tavolo chirurgico e posizionarla in posizione sdraiata laterale.
- Collegare immediatamente il tubo endotracheale ai tubi della macchina anestetica per l'erogazione di isoflurano al 100% di ossigeno. Iniziare inizialmente con isoflurano al 3% -4% e poi ridurre al 2% -3% per la manutenzione. Osservare la ventilazione spontanea delle pecore.
- Monitorare la frequenza cardiaca (polso), la frequenza respiratoria, la saturazione di ossigeno, i livelli di CO2 end-tidal e la temperatura corporea rettale durante tutta la procedura. Vedi Tabella 1 per i valori fisiologici per questi parametri nelle pecore anestetizzate (variabile, ma usare come guida).
- Posizionare un grande drappo sterile quadrato su un carrello operatorio chirurgico, seguito dagli strumenti sterili.
- Posizionare un drappo chirurgico sterile e fenestrato sull'occhio da iniettare.
- Disinfettare asetticamente l'occhio usando una siringa sterile da 20 ml per irrigare l'occhio con una soluzione di iodio povidone all'1-5%.
- Applicare 1-2 gocce di soluzione oftalmica Alcaine 0,5% W/V, come anestetico locale, sull'occhio.
- Montare uno speculum oculare Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) sulle palpebre per tenere l'occhio aperto.
- Afferrare la congiuntiva bulbare sull'aspetto dorsolaterale dell'occhio con una pinza e ruotare il globo oculare ventromedialmente.
| Cosciente | Anestetizzati | Punto critico di intervento consigliato | |
| Frequenza cardiaca (battiti/min) | Da 50-80 (a riposo) a 280 (attivo) | 50-80 | <50, >100 |
| Frequenza respiratoria (respiri / min) | Da 15-40 (a riposo) a 350 (surriscaldato) | 10-30 | <8, >40 |
| Saturazione di ossigeno (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO 2 di fine marea(mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Temperatura corporea (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabella 1: Valori fisiologici dei parametri da monitorare negli ovini anestetizzati.
3. Preparazione virale
- Conservare le aliquote vettoriali AAV a -80 °C fino all'uso.
- Il giorno dell'intervento, scongelare il numero richiesto di fiale per la consegna IVT sul ghiaccio.
- Immediatamente prima della somministrazione, vortice l'aliquota del vettore virale e centrifugare a 400 × g per 10 s per raccogliere il contenuto.
- Diluire ciascuna aliquota del vettore virale in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) filtrata sterile 1x alla dose desiderata in un volume finale di 100 μL. Preparare le diluizioni del vettore in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL a basso legame proteico utilizzando punte per pipette filtranti sterili. Smaltire tutti i materiali di consumo che sono stati a contatto con il vettore virale in soluzione disinfettante (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Nella pubblicazione originale15 la dose dell'agente terapeutico (AAV9. CLN5) era 1,9 x 1010 genomi virali. Il dosaggio raccomandato varierà a seconda dell'agente terapeutico somministrato; Pertanto, un dosaggio non è stato incluso nel protocollo standard presentato qui. - Aspirare l'intero 100 μL del preparato del vettore AAV in una siringa sterile, a basso spazio morto da 1 mL con un ago da 28 G x 1/2 in fissato in modo permanente per l'iniezione immediata. Assicurarsi che il tempo dalla preparazione all'iniezione sia inferiore a 2 minuti.
4. Somministrazione virale
- Inserire l'ago circa 7 mm posteriormente alla sclera sull'aspetto laterale dell'occhio e inclinato posteriormente per evitare la lente (Figura 2 e Figura 3). Somministrare la singola iniezione di 100 μL come bolo il più vicino possibile alla retina senza disturbare la superficie retinica.
- Risciacquare l'occhio con circa 10-15 ml di soluzione di povidone-iodio all'1-5% seguita da 10 ml di soluzione salina prima di rimuovere lo speculum e il drappo.
- Capovolgere le pecore e ripetere con l'altro occhio, se necessario.
Figura 2: Rotazione ventromediale del globo oculare . (A) Afferrare la congiuntiva bulbare con una pinza non dentata e (B) ruotare ventromedialmente (cioè verso il basso e verso il muso) per esporre la superficie dorsolaterale dell'occhio per l'iniezione. Abbreviazioni: V = ventrale, D = dorsale, M = mediale, L = laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Luogo e profondità dell'iniezione. L'ago viene iniettato sull'aspetto dorsolaterale del globo oculare e l'intera lunghezza dell'albero dell'ago (0,5 in/12,7 mm) viene inserita nell'occhio. Notare l'angolo dell'ago verso la parte posteriore dell'occhio per evitare la lente e iniettare il più vicino possibile alla retina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Gestione postoperatoria
- Al termine della procedura, interrompere l'anestesia per inalazione di gas isoflurano, lavare la linea con ossigeno al 100%, scollegare il tubo dal tubo endotracheale e trasferire le pecore nella stanza di recupero.
- Mettere le pecore in posizione sdraiata sternale, con le zampe nascoste sotto, e monitorare fino al completo recupero. Assicurarsi che la bocca dell'animale sia libera da eventuali ostruzioni.
- Quando si osserva il riflesso della deglutizione, sgonfiare parzialmente il bracciale del tubo endotracheale e rimuovere delicatamente il tubo dalla bocca.
- Somministrare un antinfiammatorio intramuscolare non steroideo nel muscolo bicipite femorale dell'arto posteriore, antibiotici sottocutanei sul lato del collo o dietro la spalla e collirio cloramfenicolo allo 0,5% sulla superficie del globo oculare.
- Fornire acqua e cibo (pellet di erba medica e pula) una volta che le pecore possono stare in piedi senza assistenza.
- Somministrare colliri cloramfenicolo allo 0,5% 2-3 al giorno per 7 giorni dopo l'intervento.
- Tenere le pecore in casa durante la notte prima di tornare al paddock all'aperto circa 24 ore dopo l'intervento.
- Registra le temperature rettali ogni giorno per 3 settimane. Monitorare eventuali cambiamenti nel polso o nella frequenza respiratoria, consumo di cibo, neurocomportamento, temperatura corporea, peso, postura, salute degli occhi e segni clinici di cattiva salute. Cercare un trattamento veterinario appropriato se ci sono indicazioni di eventi avversi.
6. Valutazione dell'efficacia in vivo
- Se l'obiettivo dell'iniezione IVT è quello di preservare la vista, monitorare l'efficacia in vivo con metodi come il test del labirinto o l'elettroretinografia (ERG) per valutare la funzione delle cellule retiniche o la tomografia a coerenza ottica (OCT) per valutare la struttura retinica.
NOTA: Queste misure di efficacia sono state ben descritte dopo la terapia genica IVT11,15,16.
7. Analisi dei tessuti postmortem
- Eseguire l'eutanasia delle pecore con un metodo approvato in un endpoint appropriato dopo un intervento chirurgico di iniezione intravitreale.
NOTA: I metodi di eutanasia suggeriti, come i farmaci per l'eutanasia veterinaria per via endovenosa o un fulmine prigioniero penetrante al rachide cervicale seguito da un rapido dissanguamento, sono dettagliati altrove15,16. - Raccogli i globi di occhio di pecora usando forbici curve chirurgiche affilate / smussate. Tagliare il canto laterale e mediale per aumentare l'apertura dell'orbita oculare e quindi tagliare sistematicamente le pieghe congiuntivali, il tessuto connettivo, i muscoli e il nervo ottico per liberare il globo oculare dalla presa.
- Globi oculari enucleati intatti per immersione in formalina al 10% per 2 ore, seguiti da postfissazione nella soluzione di Bouin per 4 ore, facendo un piccolo taglio (0,5 cm) nella sclera per consentire una perfusione sufficiente. In alternativa, fissare a immersione i globi oculari nella soluzione di Davidson per 48 ore.
- Elaborare sezioni di tessuto oculare tramite incorporazione di cera di paraffina di routine e sezionamento a 3-5 μm.
NOTA: Le procedure di colorazione per la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) e l'analisi immunoistochimica sono state descritte in precedenza15,16. - Valutare l'efficacia nel tessuto postmortem mediante misure quali lo spessore totale della retina, lo spessore dello strato retinico, la conta delle file cellulari dello strato nucleare esterno e la colorazione immunoistochimica per i tipi di cellule retiniche, la glia retinica o le proteine di interesse.
NOTA: Per i protocolli per queste analisi, vedere le pubblicazioni precedenti15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'efficacia della somministrazione IVT di un vettore di terapia genica CLN5 nell'attenuare la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL è stata precedentemente dimostrata da questo gruppo di ricerca15. Le pecore affette hanno ricevuto una singola iniezione IVT da 100 μL di CLN5 confezionata in un vettore AAV sierotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) in un occhio, con l'occhio controlaterale che funge da controllo interno non trattato. La vista è stata valutata mensilmente dall'età all'iniezione (3 mesi) alla malattia allo stadio terminale (18 mesi). L'analisi postmortem dell'istologia retinica è stata eseguita su occhi trattati e non trattati, nonché su controlli sani e affetti da CLN5 di pari età.
L'analisi elettroretinografica (ERG) ha dimostrato la conservazione della funzione retinica nell'occhio trattato, mentre l'occhio non trattato è diminuito in modo simile agli animali affetti da CLN5 (Figura 4)15. L'istologia retinica era quasi normalizzata nell'occhio trattato, con uno spessore retinico totale paragonabile agli animali sani di controllo nella retina centrale. Al contrario, lo spessore della retina non trattata era paragonabile agli animali affetti da CLN5 (Figura 5)15. La conservazione lisosomiale, una caratteristica patologica caratteristica della NCL, non è stata osservata nell'occhio trattato, ma era presente nell'occhio non trattato15. Questi risultati dimostrano che il vettore di terapia genica somministrato tramite iniezione IVT è stato in grado di arrestare la patogenesi della malattia nell'occhio di pecora affetto da CLN5. L'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP), un marker di stress retinico e astroglia, era inferiore negli occhi trattati rispetto agli occhi non trattati, indicando che l'infiammazione associata alla malattia era attenuata dopo il trattamento (Figura 6)15.
Figura 4: Risposte ERG adattate al buio di pecore CLN5-/- dopo somministrazione intravitreale di AAV9. CLN5. (A) Ampiezza media (± SEM) ERG nel tempo negli occhi trattati (verde scuro, n = 3) e non trattati (verde chiaro, n = 3) delle pecore CLN5-/-, nonché di controllo sano (blu, n = 6) e CLN5-affetto (rosso, n = 6) delle pecore affette da CLN5. (B) Tracce rappresentative di ERG dagli occhi trattati e non trattati e dai controlli sani e dagli ovini affetti a 5 (linea nera) e 17 (linea grigia) mesi di età. * indica P < 0,05. Questa figura riprodotta è di Murray et al.15 con il permesso di Elsevier. Abbreviazioni: ERG = elettroretinografia; AAV = virus adeno-associato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Spessore retinico delle pecore CLN5-/- dopo somministrazione intravitreale di AAV9. CLN5. Fotomicrografie rappresentative della colorazione istologica H&E negli occhi trattati e non trattati delle pecore CLN5-/- rispetto ai controlli di pari età. Le immagini e le misurazioni dello spessore sono state effettuate in due posizioni; retina centrale (A-E) e retina periferica (F-J). (E) Spessore retinico medio (± SEM) (μm) nella retina centrale degli occhi trattati (verde scuro, n = 3) e non trattati (verde chiaro, n = 3) rispetto al controllo sano (blu, n = 4) e alla retina affetta da CLN5 (rosso, n = 4). (J) Spessore retinico medio (± SEM) (μm) nella retina periferica degli occhi trattati e non trattati delle pecore CLN5-/- rispetto al controllo sano e alla retina affetta da CLN5. * indica P < 0,05, **** indica P < 0,0001. Barre della scala = 50 μm. Questa figura è riprodotta da Murray et al.15 con il permesso di Elsevier. Abbreviazioni: NFL = strato di fibre nervose; GCL = strato di cellule ganglionari; IPL = strato plessiforme interno; INL = strato nucleare interno; OPL = strato plessiforme esterno; ONL = strato nucleare esterno; IS/OS = segmenti interni ed esterni dei fotorecettori; RPE = epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Immunoreattività GFAP nella retina di pecore CLN5-/- dopo somministrazione intravitreale di AAV9. CLN5. Immagini confocali rappresentative dell'immunoreattività GFAP negli occhi trattati e non trattati delle pecore CLN5-/- rispetto ai controlli. (A-D) Immunoreattività GFAP, (E-H) marcatore nucleare DAPI, (I-L) Immagini unite dei due canali. Barra della scala = 20 μm. Questa figura è riprodotta da Murray et al.15 con il permesso di Elsevier. Abbreviazioni: NFL = strato di fibre nervose; GCL = strato di cellule ganglionari; INL = strato nucleare interno; ONL = strato nucleare esterno; IS/OS = segmenti interni ed esterni dei fotorecettori; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le iniezioni intravitreali sono una delle procedure chirurgiche più comuni nell'oftalmologia umana e si sono dimostrate efficaci nel fornire terapie geniche mediate da AAV alla retina delle pecore. In precedenza avevamo dimostrato l'efficacia di AAV9. La terapia genica CLN5 è stata somministrata per via intravitreale attenuando la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL15. Si spera che anche la traduzione di questa via di somministrazione ai pazienti con NCL umani si riveli utile.
Il protocollo per iniezioni IVT di piccoli volumi in un occhio di pecora è relativamente semplice e non invasivo, facilmente riproducibile e facile da imparare per un non esperto. Il successo dipende dalle cellule bersaglio all'interno della retina, dalla terapia erogata e dalla posizione e dalla direzione dell'iniezione stessa. Sebbene le iniezioni IVT siano spesso ritenute più efficaci nel colpire gli strati retinici interni, molti ricercatori hanno dimostrato l'efficacia delle iniezioni IVT in malattie in cui la retina esterna è la posizione primaria della patogenesi della malattia15,17,18,19. Le differenze negli esiti funzionali e patologici dopo le iniezioni di IVT probabilmente riguardano anche il tipo di terapia somministrata. Ad esempio, la terapia genica per fornire geni che codificano proteine solubili (ad esempio, CLN5) ha dimostrato di essere molto più efficace delle terapie geniche per fornire geni che codificano proteine intracellulari o legate alla membrana (ad esempio, CLN6)15. Indipendentemente dall'obiettivo e dal tipo di terapia, è fondamentale ottenere il sito di iniezione e l'angolo corretti per massimizzare l'efficacia. Come descritto nel protocollo, il sito di iniezione per gli ovini deve essere di circa 7 mm posteriormente alla sclera sull'aspetto laterale dell'occhio e inclinato posteriormente per colpire il vitreo posteriore. L'angolazione dell'ago serve sia ad evitare la lente che a dirigere il farmaco iniettato il più vicino possibile alla retina. L'uso di una siringa di sicurezza con un ago da 28 G (o inferiore) x 0,5 pollici a basso spazio morto è fondamentale per ridurre al minimo il disagio correlato all'iniezione e il volume morto rimanente nell'ago o nel mozzo. Questo ago può essere completamente inserito nell'occhio di pecora con un angolo posteriore senza un microscopio chirurgico e/o il rischio di perforare la retina. I ricercatori che hanno accesso a un microscopio chirurgico possono usarlo per fornire un ulteriore livello di certezza su come evitare l'interruzione della retina. In caso contrario, l'uso di siringhe di sicurezza ed essere consapevoli delle dimensioni del globo oculare all'età da trattare è sufficiente per eseguire questa procedura in sicurezza15.
Quando si afferra l'occhio per ruotarlo medialmente ed esporre il sito di iniezione, è essenziale utilizzare strumenti atraumatici non dentati per evitare di danneggiare il delicato tessuto dell'occhio. Se l'occhio è posizionato centralmente, è relativamente semplice afferrare la congiuntiva bulbare al bordo della sclera e dell'iride e ruotare con una mano, iniettando con l'altra mano. Tuttavia, se l'occhio ha ruotato fuori centro, che può verificarsi in anestesia generale, è spesso necessario utilizzare un emostatico per bloccare la congiuntiva bulbare e ruotare l'occhio in posizione, lasciando l'emostatico in posizione per continuare con la procedura.
Gli occhi delle pecore sono robusti e recuperati bene dopo il trattamento IVT con AAV9 portatore di CLN5 dell'ovino, con una sola pecora che sviluppa uveite nell'occhio trattato 1 settimana dopo l'iniezione15. In questo caso, l'uveite si è risolta entro 1 settimana e non ha avuto alcun impatto a lungo termine sulla visione. A parte questo caso, non sono stati riportati effetti negativi delle iniezioni IVT nel primo studio pubblicato15, o nei >30 animali aggiuntivi nel programma di ricerca iniettati a 3 mesi, 6 mesi o 9 mesi di età seguendo il protocollo descritto qui. Tuttavia, ci sono ulteriori misure quantitative di sicurezza dell'iniezione che i ricercatori potrebbero voler prendere in considerazione per aggiungere alle loro valutazioni postoperatorie. Questi includono misure di pressione intraoculare (IOP), imaging del fondo oculare o OCT. Le immagini del fondo oculare prima e dopo l'iniezione possono evidenziare se c'è stata qualche interruzione della retina a causa dell'iniezione e, a lungo termine, possono fornire una panoramica della salute della retina in generale.
Nel caso in cui venga iniettato un marcatore fluorescente, l'imaging a fluorescenza del fondo può aiutare a visualizzare la diffusione del marcatore iniettato 16,20. L'OCT può essere utilizzato per visualizzare la retina in sezione trasversale in vivo per identificare eventuali danni strutturali potenziali dopo l'iniezione e misurare lo spessore della retina nel tempo in risposta al trattamento. La funzione visiva post-iniezione può anche essere valutata mediante ERG o maze test15,16. Nel caso della terapia genica mediata da virus IVT, deve essere considerato l'impatto della risposta immunitaria e la presenza di anticorpi neutralizzanti contro i vettori AAV. Sebbene non faccia parte del protocollo qui delineato per gli ovini, si suggerisce che i soggetti siano testati per la presenza di anticorpi neutralizzanti anti-AAV prima della terapia genica, indipendentemente dalla via di somministrazione, per aumentare l'efficienza di trasduzione16,21. I lettori sono rimandati a una discussione più completa sulla questione delle risposte immunitarie all'AAV di Whitehead et al.22.
Una complicanza comune durante le procedure IVT è l'emorragia subcongiuntivale (SCH)23, che può verificarsi se i capillari nella congiuntiva bulbare vengono perforati durante l'inserimento dell'ago. Fortunatamente, SCH è generalmente innocuo e si risolve in pochi giorni; Tuttavia, è meglio evitare i capillari congiuntivali quando si inserisce l'ago. Dopo l'iniezione di IVT, è importante trattare gli occhi iniettati con colliri antibiotici (ad es. cloramfenicolo) e monitorare gli occhi per eventuali segni di infezione o infiammazione (uveite). Un altro evento comune durante le procedure IVT è un aumento della IOP. Questi aumenti sono più comunemente picchi transitori di pressione nei minuti successivi all'iniezione e non causano danni duraturi24,25. Tuttavia, ci sono casi in cui la IOP dovrebbe essere considerata e monitorata. Quando sono presenti condizioni oculari preesistenti come il glaucoma, o quando vengono iniettati volumi più elevati (≥100 μL), la IOP deve essere attentamente monitorata e la paracentesi profilattica della camera anteriore deve essere considerata per ridurre la pressione nel globo oculare 4,16. Inoltre, picchi ripetuti di IOP in caso di iniezioni IVT ripetute possono essere un problema e dovrebbero essere attenuati come sopra4. Qui, stiamo dimostrando la IVT ai fini di una singola terapia genica mediata da AAV; Pertanto, le conseguenze a lungo termine delle iniezioni ripetute non sono una considerazione importante.
I limiti delle iniezioni IVT includono la necessità di penetrare le barriere anatomiche e la minore specificità del bersaglio rispetto ai metodi più invasivi. In primo luogo, la sostanza iniettata sarà diluita nel vitreo e quindi avrà una distanza per diffondersi attraverso la cavità vitreale e il tessuto retinico alle cellule bersaglio. Ciò significa che la retina interna è più facilmente trasdotta rispetto alla retina esterna dopo l'iniezione IVT e possono essere necessarie dosi più elevate per contrastare la diluizione26. Il protocollo qui descritto sottolinea l'importanza di iniettare il più vicino possibile alla retina per mitigare gli effetti della diluizione e della diffusione attraverso il corpo vitreo. Pertanto, l'intera lunghezza dell'albero dell'ago da 0,5 pollici / 12,7 mm viene inserita nell'occhio. L'ulteriore vantaggio dell'inserimento dell'ago a tutta la lunghezza dell'ago è la ridotta possibilità di reflusso fluido durante l'iniezione 4,27.
Sebbene questo protocollo attuale lo ometta, si raccomanda di ritardare la rimozione dell'ago per diversi minuti dopo l'iniezione per ridurre ulteriormente le possibilità di reflusso di liquidi. Inoltre, l'iniezione deve essere eseguita lentamente per garantire che il getto di liquido iniettato non interrompa la retina o causi un rapido picco di IOP e una maggiore velocità di iniezione non influenzi i tassi di diffusione attraverso il vitreo28,29. La membrana limitante interna (ILM) è la barriera primaria tra il vitreo e la retina, che funziona per limitare il movimento delle molecole nella retina30. Tuttavia, la permeabilità dell'ILM può essere aumentata dalla digestione o dal peeling chirurgico ed è probabile che aumenti nell'occhio malato, rendendo più facile la penetrazione delle molecole terapeutiche.
Per quanto riguarda la specificità del bersaglio, la somministrazione di IVT è la meno rispetto ad altre vie intraoculari come quella sottoretinica e sopracoroidale, come discusso sopra e altrove10. Tuttavia, nuove generazioni di AAV vengono regolarmente sviluppate per contenere modifiche, che migliorano il targeting a particolari tipi di cellule o superano in modo più efficiente barriere come ILM31. L'uso di tali capsidi modificati ha aumentato l'efficienza di trasduzione dopo somministrazione IVT in un certo numero di specie modello 5,32,33.
Lo scopo della terapia genica descritta da Murray et al.15 era quello di fornire una copia funzionale del gene CLN5 ; pertanto, una misura dell'efficacia è la presenza di cellule trasdotte che esprimono la proteina CLN5. Abbiamo tentato di utilizzare l'immunoistochimica per rilevare le cellule trasdotte da CLN5 nella retina, come facciamo abitualmente nel tessuto cerebrale delle pecore; Tuttavia, l'anticorpo che usiamo tipicamente nel tessuto cerebrale fluttuante non funziona nel tessuto retinico incorporato in paraffina. Sono in corso la risoluzione dei problemi e la ricerca di modi alternativi per rilevare il gene o la proteina di interesse nella retina per aggiungere alla valutazione dell'efficacia. Un modo potenziale per raggiungere questo obiettivo è iniettare un vettore virale contenente un gene reporter (come la proteina fluorescente verde; GFP) e valutare l'espressione di GFP tramite immunoistochimica. Un altro modo per valutare l'efficacia è l'utilizzo della PCR quantitativa per valutare i livelli di espressione transgenica.
Lo sviluppo di protocolli per le iniezioni IVT in animali di grandi dimensioni è un passo cruciale verso il trattamento delle malattie degenerative della retina, in particolare le malattie con una componente genetica, poiché la terapia genica IVT è una potenziale terapeutica promettente. Per le malattie degenerative in cui la retina è già fragile, il trattamento IVT presenta meno rischi di distacco o lacerazione della retina. Date le somiglianze nelle dimensioni e nella struttura degli occhi delle pecore e degli occhi umani, l'ottimizzazione della dose e del volume delle iniezioni di IVT negli ovini è un passo rilevante verso la traduzione in clinica. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo per l'iniezione IVT nell'occhio di pecora, che è sicuro e mostra un tasso molto basso di risposte infiammatorie oculari. Questo metodo dimostra anche l'efficacia della terapia genica oculare mediata da AAV9 per affrontare la componente retinica di NCL negli ovini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) per la sua assistenza nello stabilire questo protocollo ed eseguire le iniezioni descritte da Murray et al.15. Gli autori riconoscono anche i finanziamenti di CureKids New Zealand, della Canterbury Medical Research Foundation, di Neurogene Inc e della Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
