Summary
Injeções intravítreas foram realizadas no olho de ovelha com o objetivo de fornecer terapia gênica mediada por vírus para a retina.
Abstract
Existem vários métodos para a entrega de agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que preenche a câmara posterior do olho e mantém a forma do globo ocular. Embora a via IVT seja menos especificamente direcionada do que o parto sub-retiniano, é muito menos invasiva e é amplamente utilizada em ambientes clínicos para uma série de doenças oculares.
Demonstramos anteriormente a eficácia da entrega intravítrea de um produto de terapia gênica mediado por vírus adenoassociado (AAV) (AAV9. CLN5) em ovinos com uma forma natural de CLN5 de lipofuscinose ceróide neuronal (NCL). As ovelhas afetadas receberam terapia genética IVT em um olho, com o outro olho não tratado servindo como um controle interno. A estrutura e a função da retina foram mantidas no olho tratado até 15 meses após o tratamento, enquanto o olho não tratado apresentou função progressivamente declinante e atrofia grave durante o exame post-mortem. Com base nos estudos com ovelhas, o produto de terapia genética CLN5 foi liberado como um candidato a novo medicamento experimental (IND) pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos em setembro de 2021. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a entrega de TVI de um vetor viral terapêutico ao olho ovino.
Introduction
Vários métodos podem ser usados para fornecer agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. Cada via de administração envolve a superação de barreiras como a barreira sangue-retina ou as membranas limitantes internas e externas e tem taxas variadas de eficácia dependendo do fármaco a ser administrado e do alvo específico da retina 1,2.
A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que ocupa a câmara posterior do olho. A principal função do humor vítreo é manter a forma do globo ocular e manter os tecidos oculares, como a lente e a retina, no lugar. O humor vítreo é composto em grande parte de água, com pequenas quantidades de colágeno, ácido hialurônico e outras proteínas não colágenas3. A injeção de TVI é um procedimento simples e comum usado rotineiramente para tratar uma ampla gama de condições oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, retinopatia diabética, oclusão da veia retiniana e várias distrofias hereditárias da retina 4,5.
Lipofuscinoses ceroides neuronais (NCL; Doença de Batten) é um grupo de doenças fatais de armazenamento lisossômico que causam degeneração grave do cérebro e da retina. Atualmente, existem 13 variantes conhecidas de NCL resultantes de mutações em diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afetam predominantemente crianças, mas têm idades variadas de início e gravidade da doença6. As NCLs compartilham sintomas progressivos comuns, incluindo declínio cognitivo e motor, convulsões e perda de visão. Não há cura para a NCL; no entanto, a terapia de reposição enzimática dirigida pelo cérebro está atualmente em ensaios clínicos para a doença CLN27,8, e a terapia gênica mediada por AAV tem se mostrado grande promessa em estudos pré-clínicos, com um ensaio clínico para a terapia gênica CLN5 esperado para começar em 2022 9,10.
Muitas outras espécies desenvolvem formas naturais de NCL, incluindo gatos, cães, ovelhas e vacas. Dois modelos ovinos de NCL estão atualmente em estudo ativo na Nova Zelândia: um modelo de doença CLN5 em ovinos de Borderdale e um modelo de doença CLN6 em ovinos de South Hampshire. Os ovinos afetados apresentam muitas das características clínicas e patológicas da doença humana, incluindo atrofia retiniana e perda de visão10,11. Embora a terapia gênica CLN5 dirigida pelo cérebro em ovinos com doença CLN5 possa prevenir ou deter a atrofia cerebral e o declínio clínico, as ovelhas tratadas ainda perdem a visão9. Isso evidenciou a necessidade de tratar a retina para preservar a visão e manter uma melhor qualidade de vida, levando ao estabelecimento de um protocolo de terapia gênica ocular em ovinos.
O olho de ovelha representa um bom modelo do olho humano devido à sua semelhança nas dimensões do globo ocular, volume vítreo e estrutura da retina10,12,13. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a administração de TVI de um pequeno volume (≤100 μL) de vetor viral terapêutico ao olho ovino.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de Ética Animal da Universidade Lincoln e estão de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com a Lei de Bem-Estar Animal da Nova Zelândia (1999). As ovelhas Borderdale foram diagnosticadas ao nascer14 e mantidas em fazendas de pesquisa da Universidade Lincoln. Três ovelhas homozigotas (CLN5-/-) de 3 meses de idade receberam uma única injeção de TVI no olho esquerdo, com o olho direito não tratado atuando como um controle interno. Os dados de eletrorretinografia e patologia foram comparados com os dados históricos de controle saudável e afetado. O vetor viral utilizado neste estudo foi um sorotipo 9 de vírus adenoassociado autocomplementar, contendo o promotor de ação beta de frango (CBh) e o ovino CLN5 otimizado para códons (scAAV9/CBh-oCLN5opt). O vetor viral foi fornecido pelo University of North Carolina Vector Core, NC, EUA.
1. Pré-cirurgia
- Autoclave o kit cirúrgico (Figura 1).
- Jejue as ovelhas por 24 h antes da cirurgia.
- Registre pesos vivos antes da cirurgia.
Figura 1: Kit de cirurgia intravítrea. Os instrumentos necessários para a cirurgia de TVI incluem (1) um espéculo para manter as pálpebras abertas e (2) um par de pinças de nariz curvo para agarrar a conjuntiva bulbar e girar o olho. (3) Um hemostato de nariz reto também é incluído como um instrumento alternativo para segurar a conjuntiva bulbar e manter o olho no lugar se ele tiver revertido para a órbita do olho. Este kit é autoclavado antes da cirurgia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Procedimento cirúrgico
- Restrinja o animal e, usando cortadores eletrônicos, raspe a lã de um lado do pescoço sobre a veia jugular.
- Ocluir a veia jugular aplicando pressão na base do sulco jugular e visualizar a veia levantada.
- Recolher a quantidade adequada de diazepam (0,3 mg/kg) e cetamina (7,5 mg/kg) numa seringa estéril e colocar uma agulha estéril de 20 G. Insira a agulha na veia jugular e retire suavemente o êmbolo para garantir que o sangue entre no cubo e a agulha esteja dentro da veia. Uma vez confirmado, induzir através de administração intravenosa (jugular).
- Imediatamente após a indução, coloque o animal em decúbito dorsal, estenda o pescoço e segure a língua para cima e para frente, usando um laringoscópio para visualizar a laringe. Realizar a intubação endotraqueal inserindo suavemente um tubo endotraqueal (tamanho 6,0-9,0, dependendo do tamanho da ovelha) entre as cordas vocais quando o animal expirar. Inflar o manguito endotraqueal imediatamente e prender o tubo com uma gravata ao redor da mandíbula inferior. Confirme o fluxo de ar através do tubo.
- Transfira o ovino para a mesa cirúrgica e coloque-o em decúbito lateral.
- Conecte imediatamente o tubo endotraqueal às mangueiras da máquina anestésica para a entrega de isoflurano em oxigênio a 100%. Inicialmente comece com 3%-4% de isoflurano e, em seguida, reduza para 2%-3% para manutenção. Observe a ventilação espontânea dos ovinos.
- Monitore a frequência cardíaca (pulso), a frequência respiratória, a saturação de oxigênio, os níveis de CO2 no final da maré e a temperatura corporal retal durante todo o procedimento. Veja a Tabela 1 para valores fisiológicos para esses parâmetros em ovinos anestesiados (variável, mas uso como orientação).
- Coloque uma cortina grande, estéril e quadrada em um carrinho cirúrgico, seguido pelos instrumentos estéreis.
- Posicione uma cortina cirúrgica estéril e fenestrada sobre o olho a ser injetado.
- Desinfete assepticamente o olho usando uma seringa estéril de 20 mL para irrigar o olho com solução de iodopovidona a 1-5%.
- Aplicar 1-2 gotas de Alcaine 0,5% W/V solução oftálmica, como um anestésico local, para o olho.
- Encaixe um espéculo ocular Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) nas pálpebras para manter o olho aberto.
- Segure a conjuntiva bulbar na face dorsolateral do olho com fórceps e gire o globo ocular ventromedialmente.
| Consciente | Anestesiado | Ponto crítico de intervenção recomendado | |
| Frequência cardíaca (batimentos/min) | 50-80 (repouso) a 280 (ativo) | 50-80 | <50, >100 |
| Frequência respiratória (respirações/min) | 15-40 (descanso) a 350 (superaquecido) | 10-30 | <8, >40 |
| Saturação de oxigênio (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO2 da maré final (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Temperatura corporal (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | 36 < de >40 |
Tabela 1: Valores fisiológicos dos parâmetros a serem monitorados em ovinos anestesiados.
3. Preparação viral
- Armazenar alíquotas vetoriais AAV a -80 °C até o uso.
- No dia da cirurgia, descongele o número necessário de frascos para entrega de IVT no gelo.
- Imediatamente antes da administração, o vórtice da alíquota do vetor viral e centrifugar a 400 × g por 10 s para coletar o conteúdo.
- Diluir cada alíquota do vetor viral em solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada estéril 1x para a dose desejada em um volume final de 100 μL. Prepare diluições vetoriais em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas usando pontas de pipeta de filtro estéreis. Eliminar todos os consumíveis que tenham estado em contacto com o vector viral em solução desinfetante (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Na publicação original15 a dose do agente terapêutico (AAV9. CLN5) foi de 1,9 x 1010 genomas virais. A dosagem recomendada irá variar dependendo do agente terapêutico que está sendo administrado; portanto, uma dosagem não foi incluída no protocolo padrão aqui apresentado. - Retirar todos os 100 μL da preparação do vetor AAV para uma seringa estéril de 1 ml com um 28 G x 1/2 permanentemente ligado em agulha para injeção imediata. Certifique-se de que o período de tempo entre a preparação e a injeção é inferior a 2 minutos.
4. Administração viral
- Inserir a agulha aproximadamente 7 mm posterior à esclera na face lateral do olho e inclinada posteriormente para evitar o cristalino (Figura 2 e Figura 3). Administrar a injeção única de 100 μL em bolus o mais próximo possível da retina sem perturbar a superfície da retina.
- Enxaguar o olho com aproximadamente 10-15 mL de solução de iodopovidona a 1-5%, seguido de 10 mL de solução salina antes da remoção do espéculo e da cortina.
- Vire as ovelhas e repita com o outro olho, se necessário.
Figura 2: Rotação ventromedial do globo ocular . (A) Segure a conjuntiva bulbar com pinça não dentada e (B) gire ventromedialmente (ou seja, para baixo e em direção ao focinho) para expor a superfície dorsolateral do olho para injeção. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Localização e profundidade da injeção. A agulha é injetada no aspecto dorsolateral do globo ocular e todo o comprimento do eixo da agulha (0,5 pol/12,7 mm) é inserido no olho. Observe o ângulo da agulha em direção à parte posterior do olho para evitar a lente e injete o mais próximo possível da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Manejo pós-operatório
- Após a conclusão do procedimento, pare a anestesia por inalação de gás isoflurano, lave a linha com oxigênio a 100%, desconecte a mangueira do tubo endotraqueal e transfira as ovelhas para a sala de recuperação.
- Coloque as ovelhas em decúbito esternal, com as pernas dobradas por baixo, e monitore até a recuperação completa. Certifique-se de que a boca do animal esteja livre de quaisquer obstruções.
- Quando o reflexo de deglutição for observado, esvazie parcialmente o manguito do tubo endotraqueal e remova suavemente o tubo da boca.
- Administrar um anti-inflamatório não esteroidal intramuscular no músculo bíceps femoral do membro posterior, antibióticos subcutâneos no lado do pescoço ou atrás do ombro e colírios de cloranfenicol a 0,5% na superfície do globo ocular.
- Forneça água e comida (pellets de luzerna e palha) uma vez que as ovelhas possam ficar desassistidas.
- Administrar 0,5% cloranfenicol colírio 2-3 por dia durante 7 dias após a cirurgia.
- Mantenha as ovelhas dentro de casa durante a noite antes de retornar ao piquete ao ar livre aproximadamente 24 horas após a cirurgia.
- Registre as temperaturas retais diariamente por 3 semanas. Monitore quaisquer alterações no pulso ou na frequência respiratória, consumo de alimentos, neurocomportamento, temperatura corporal, peso, postura, saúde ocular e sinais clínicos de problemas de saúde. Procure tratamento veterinário adequado se houver indícios de eventos adversos.
6. Avaliação da eficácia in vivo
- Se o objetivo da injeção de TVI for preservar a visão, monitore a eficácia in vivo por métodos como o teste de labirinto ou eletrorretinografia (ERG) para avaliar a função celular da retina ou a tomografia de coerência óptica (OCT) para avaliar a estrutura da retina.
NOTA: Essas medidas de eficácia têm sido bem descritas após a terapia gênica comTVI 11,15,16.
7. Análise de tecido post-mortem
- Realizar a eutanásia de ovinos por um método aprovado em um desfecho apropriado após a cirurgia de injeção intravítrea.
NOTA: Métodos de eutanásia sugeridos, como medicamentos veterinários intravenosos para eutanásia ou um parafuso cativo penetrante na coluna cervical seguido de exsanguinação rápida, são detalhados em outros lugares15,16. - Colha globos oculares de ovelha usando tesouras curvas cirúrgicas afiadas/contundentes. Corte o canto lateral e medial para aumentar a abertura da cavidade ocular e, em seguida, corte sistematicamente as dobras conjuntivais, o tecido conjuntivo, os músculos e o nervo óptico para liberar o globo ocular da órbita.
- Imersão-fixação de globos oculares enucleados intactos em formalina a 10% por 2 h, seguida de pós-fixação em solução de Bouin por 4 h, fazendo um pequeno corte (0,5 cm) na esclera para permitir perfusão suficiente. Alternativamente, a imersão fixa os globos oculares na solução de Davidson por 48 h.
- Processe seções do tecido ocular através da incorporação e seccionamento de cera de parafina de rotina a 3-5 μm.
NOTA: Procedimentos de coloração por coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e análise imuno-histoquímica já foram descritos anteriormente15,16. - Avalie a eficácia no tecido post-mortem por medidas como espessura total da retina, espessura da camada da retina, contagens de fileiras celulares da camada nuclear externa e coloração imuno-histoquímica para tipos de células da retina, glia da retina ou proteínas de interesse.
NOTA: Para protocolos para essas análises, ver publicações anteriores15,16.
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Representative Results
A eficácia da administração de IVT de um vetor de terapia gênica CLN5 na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL já foi demonstrada anteriormente por este grupo de pesquisa15. Os ovinos afetados receberam uma única injeção de 100 μL de TVI de CLN5 embalado em um vetor AAV sorotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) em um olho, com o olho contralateral servindo como um controle interno não tratado. A visão foi avaliada mensalmente desde a idade na injeção (3 meses) até a doença em estágio terminal (18 meses). A análise post-mortem da histologia da retina foi realizada em olhos tratados e não tratados, bem como em controles saudáveis e afetados por CLN5 pareados por idade.
A análise eletrorretinográfica (ERG) demonstrou função retiniana preservada no olho tratado, enquanto o olho não tratado diminuiu de maneira semelhante aos animais afetados pela CLN5 (Figura 4)15. A histologia da retina foi quase normalizada no olho tratado, com uma espessura total da retina comparável a animais controle saudáveis na retina central. Em contraste, a espessura da retina não tratada foi comparável aos animais afetados pela CLN5 (Figura 5)15. O armazenamento lisossômico, característica patológica da LLC, não foi observado no olho tratado, mas no olho não tratado15. Estes resultados demonstram que o vetor de terapia gênica fornecido através da injeção de TVI foi capaz de deter a patogênese da doença no olho de ovelha afetado pelo CLN5. A expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP), um marcador de estresse retiniano e astroglia, foi menor nos olhos tratados do que nos olhos não tratados, indicando que a inflamação associada à doença foi atenuada após o tratamento (Figura 6)15.
Figura 4: Respostas ERG adaptadas ao escuro de ovinos CLN5-/- após a administração intravítrea de AAV9. CLN5. (A) Amplitudes médias (± EPM) do ERG ao longo do tempo nos olhos tratados (verde escuro, n = 3) e não tratados (verde claro, n = 3) de ovinos CLN5-/- , bem como controle saudável (azul, n = 6) e CLN5 (vermelho, n = 6). (B) Vestígios representativos do ERG dos olhos tratados e não tratados e dos controlos saudáveis e dos ovinos afetados aos 5 (linha preta) e aos 17 (linha cinzenta) meses de idade. * indica P < 0,05. Essa figura reproduzida é de Murray et al.15 com permissão da Elsevier. Abreviaturas: ERG = eletrorretinografia; AAV = vírus adenoassociado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Espessura retiniana de ovinos CLN5-/- após administração intravítrea de AAV9. CLN5. Fotomicrografias representativas da coloração histológica de H&E nos olhos tratados e não tratados de ovinos CLN5-/- em comparação com controles pareados por idade. As imagens e as medidas de espessura foram realizadas em dois locais; retina central (A-E) e retina periférica (F-J). (E) Espessura média (± EPM) da retina (μm) na retina central dos olhos tratados (verde escuro, n = 3) e não tratados (verde claro, n = 3) em comparação com o controle saudável (azul, n = 4) e a retina afetada por CLN5 (vermelho, n = 4). (J) Espessura média (± MEV) da retina (μm) na retina periférica dos olhos tratados e não tratados de ovinos CLN5-/- em comparação com o controle saudável e a retina afetada por CLN5. * indica P < 0,05, **** indica P < 0,0001. Barras de escala = 50 μm. Essa figura é reproduzida de Murray et al.15 com permissão da Elsevier. Abreviaturas: NFL = camada de fibras nervosas; GCL = camada de células ganglionares; IPL = camada plexiforme interna; INL = camada nuclear interna; OPL = camada plexiforme externa; ONL = camada nuclear externa; IS/OS = segmentos internos e externos dos fotorreceptores; PSE = epitélio pigmentar da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imunorreatividade à GFAP na retina de ovinos CLN5-/- após administração intravítrea de AAV9. CLN5. Imagens confocais representativas da imunorreatividade da GFAP nos olhos tratados e não tratados de ovinos CLN5-/- em comparação com os controles. (A-D) Imunorreatividade GFAP, (E-H) marcador nuclear DAPI, (I-L) Imagens mescladas dos dois canais. Barra de escala = 20 μm. Essa figura é reproduzida de Murray et al.15 com permissão da Elsevier. Abreviaturas: NFL = camada de fibras nervosas; GCL = camada de células ganglionares; INL = camada nuclear interna; ONL = camada nuclear externa; IS/OS = segmentos internos e externos dos fotorreceptores; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As injeções intravítreas são um dos procedimentos cirúrgicos mais comuns na oftalmologia humana e provaram ser eficazes na administração de terapias genéticas mediadas por AAV para a retina de ovinos. Já havíamos demonstrado anteriormente a eficácia do AAV9. A terapia gênica com CLN5 foi administrada intravitrealmente na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL15. Espera-se que a tradução desta via de administração para pacientes humanos com NCL também se mostre benéfica.
O protocolo para injeções de IVT de pequeno volume em um olho de ovelha é relativamente simples e não invasivo, prontamente reprodutível e fácil para um não especialista aprender. O sucesso depende das células-alvo dentro da retina, da terapia que está sendo administrada e da localização e direção da própria injeção. Embora as injeções de TVI sejam frequentemente consideradas mais eficazes no direcionamento das camadas internas da retina, muitos pesquisadores demonstraram a eficácia das injeções de TVI em doenças em que a retina externa é o principal local da patogênese da doença15,17,18,19. As diferenças nos resultados funcionais e patológicos após as injeções de TVI também provavelmente estão relacionadas ao tipo de terapia administrada. Por exemplo, a terapia gênica para fornecer genes que codificam proteínas solúveis (por exemplo, CLN5) tem se mostrado muito mais eficaz do que as terapias gênicas para fornecer genes que codificam proteínas intracelulares ou ligadas à membrana (por exemplo, CLN6)15. Independentemente do alvo e do tipo de terapia, é fundamental obter o local e o ângulo de injeção corretos para maximizar a eficácia. Conforme descrito no protocolo, o local de injeção para ovinos deve ser aproximadamente 7 mm posterior à esclera na face lateral do olho e inclinado posteriormente para atingir o vítreo posterior. A inclinação da agulha é tanto para evitar a lente quanto para direcionar a droga injetada o mais próximo possível da retina. O uso de uma seringa de segurança com um 28 G (ou menor) x 0,5 permanentemente ligado em agulha de baixo espaço morto é crucial para minimizar o desconforto relacionado à injeção e o volume morto restante na agulha ou cubo. Esta agulha de comprimento pode ser totalmente inserida no olho de ovelha em um ângulo posterior sem um microscópio cirúrgico e / ou o risco de perfurar a retina. Os pesquisadores que têm acesso a um microscópio cirúrgico podem usar isso para fornecer um nível adicional de certeza em torno de evitar a ruptura da retina. Caso contrário, o uso de seringas de segurança e o conhecimento das dimensões do globo ocular de ovino na idade a ser tratada são suficientes para realizar esse procedimento com segurança15.
Ao agarrar o olho para girá-lo medialmente e expor o local da injeção, é essencial usar instrumentos atraustrados sem dentes para evitar danificar o tecido delicado do olho. Se o olho estiver posicionado centralmente, é relativamente simples agarrar a conjuntiva bulbar na borda da esclera e da íris e girar com uma mão, enquanto injeta com a outra mão. No entanto, se o olho girou para fora do centro, o que pode ocorrer sob anestesia geral, muitas vezes é necessário usar um hemostato para prender a conjuntiva bulbar e girar o olho na posição, deixando o hemostato no lugar para continuar com o procedimento.
Os olhos das ovelhas são robustos e recuperados bem após o tratamento com TVI com AAV9 portando CLN5 ovino, com apenas uma ovelha desenvolvendo uveíte no olho tratado 1 semana após a injeção15. Neste caso, a uveíte se resolveu dentro de 1 semana e não teve impacto a longo prazo na visão. Além deste caso, nenhum efeito negativo das injeções de TVI foi relatado no primeiro estudo publicado15, ou no >30 animais adicionais no programa de pesquisa injetados aos 3 meses, 6 meses ou 9 meses de idade seguindo o protocolo descrito aqui. No entanto, existem medidas quantitativas adicionais de segurança de injeção que os pesquisadores podem querer considerar adicionar às suas avaliações pós-operatórias. Estes incluem medidas de pressão intraocular (PIO), imagem de fundo de olho ou OCT. Imagens do fundo antes e depois da injeção podem destacar se houve alguma ruptura da retina por causa da injeção e, a longo prazo, podem fornecer uma visão geral da saúde da retina em geral.
No caso em que um marcador fluorescente é injetado, a imagem de fluorescência do fundo de olho pode auxiliar na visualização da disseminação do marcador injetado16,20. A OCT pode ser usada para visualizar a retina em seção transversal in vivo para identificar qualquer dano estrutural potencial após a injeção e medir a espessura da retina ao longo do tempo em resposta ao tratamento. A função visual pós-injeção também pode ser avaliada pelo teste ERG ou labirinto15,16. No caso da terapia gênica mediada por vírus IVT, o impacto da resposta imune e a presença de anticorpos neutralizantes aos vetores de AAV devem ser considerados. Embora não faça parte do protocolo aqui delineado para ovinos, sugere-se que os indivíduos sejam testados quanto à presença de anticorpos neutralizantes anti-AAV antes da terapia gênica, independentemente da via de administração, para aumentar a eficiência da transdução16,21. Os leitores são encaminhados para uma discussão mais abrangente sobre a questão das respostas imunes à AAV por Whitehead et al.22.
Uma complicação comum durante os procedimentos de TVI é a hemorragia subconjuntival (HSC)23, que pode ocorrer se os capilares da conjuntiva bulbar forem puncionados durante a inserção da agulha. Felizmente, o SCH é geralmente inofensivo e se resolve dentro de alguns dias; no entanto, é melhor evitar capilares conjuntivais ao inserir a agulha. Após a injeção de TVI, é importante tratar os olhos injetados com colírios antibióticos (por exemplo, cloranfenicol) e monitorar os olhos em busca de sinais de infecção ou inflamação (uveíte). Outro evento comum durante os procedimentos de TVI é um aumento na PIO. Esses aumentos são mais comumente picos transitórios de pressão nos minutos seguintes à injeção e não causam danos duradouros24,25. No entanto, há casos em que a PIO deve ser considerada e monitorada. Quando condições oculares pré-existentes, como glaucoma, estão presentes, ou quando volumes maiores (≥100 μL) estão sendo injetados, a PIO deve ser monitorada de perto e a paracentese profilática da câmara anterior deve ser considerada para reduzir a pressão no globo ocular 4,16. Além disso, picos repetidos de PIO no caso de injeções repetidas de TVI podem ser uma preocupação e devem ser atenuados como acima de4. Aqui, estamos demonstrando a IVT para fins de uma única terapia gênica mediada por AAV; portanto, as consequências a longo prazo de injeções repetidas não são uma consideração importante.
As limitações das injeções de TVI incluem a necessidade de penetrar nas barreiras anatômicas e a menor especificidade do alvo em comparação com métodos mais invasivos. Primeiro, a substância injetada será diluída no vítreo e, em seguida, terá uma distância para se difundir através da cavidade vítrea e do tecido da retina até as células-alvo. Isso significa que a retina interna é mais facilmente transduzida do que a retina externa após a injeção de TVI, e doses mais altas podem ser necessárias para neutralizar a diluição26. O protocolo aqui descrito enfatiza a importância de injetar o mais próximo possível da retina para mitigar os efeitos da diluição e difusão através do corpo vítreo. Portanto, todo o comprimento do eixo da agulha de 0,5 pol/12,7 mm é inserido no olho. A vantagem adicional de inserir todo o comprimento da agulha é a redução da chance de refluxo de fluido durante a injeção 4,27.
Embora este protocolo atual o omita, recomenda-se atrasar a remoção da agulha por vários minutos após a injeção para reduzir ainda mais as chances de refluxo de fluidos. Além disso, a injeção deve ser feita lentamente para garantir que o jato de líquido injetado não atrapalhe a retina ou cause um rápido pico de PIO, e um aumento da velocidade de injeção não afete as taxas de difusão através do vítreo28,29. A membrana limitante interna (ILM) é a principal barreira entre o vítreo e a retina, que funciona para restringir o movimento de moléculas para a retina30. No entanto, a permeabilidade da ILM pode ser aumentada pela digestão ou peeling cirúrgico e é provavelmente aumentada no olho doente, facilitando a penetração de moléculas terapêuticas.
Em relação à especificidade do alvo, a administração da TVI é a menor em comparação com outras vias intraoculares, como sub-retiniana e supracoroidal, como discutido acima e em outros lugares10. No entanto, novas gerações de AAVs estão sendo rotineiramente desenvolvidas para conter modificações, que melhoram o direcionamento para tipos específicos de células ou superam barreiras de forma mais eficiente, como o ILM31. O uso desses capsídeos modificados aumentou a eficiência da transdução após a administração de TVI em várias espécies-modelo 5,32,33.
O objetivo da terapia gênica detalhada por Murray et al.15 foi fornecer uma cópia funcional do gene CLN5 ; portanto, uma medida de eficácia é a presença de células transduzidas expressando a proteína CLN5. Tentamos usar a imuno-histoquímica para detectar células transduzidas por CLN5 na retina, como fazemos rotineiramente no tecido cerebral de ovinos; no entanto, o anticorpo que normalmente usamos no tecido cerebral flutuante não funciona no tecido retiniano incorporado à parafina. Solução de problemas e investigação de formas alternativas de detectar o gene ou proteína de interesse na retina estão em andamento para aumentar a avaliação da eficácia. Uma maneira potencial de conseguir isso é injetando um vetor viral contendo um gene repórter (como a proteína fluorescente verde; GFP) e avaliar a expressão da GFP via imuno-histoquímica. Outra maneira de avaliar a eficácia é usando a PCR quantitativa para avaliar os níveis de expressão transgênica.
O desenvolvimento de protocolos para injeções de TVI em animais de grande porte é um passo crucial para o tratamento de doenças degenerativas da retina, particularmente doenças com um componente genético, já que a terapia genética com TVI é uma terapêutica potencial promissora. Para doenças degenerativas em que a retina já é frágil, o tratamento com TVI representa menos risco de descolamento ou ruptura da retina. Dadas as semelhanças no tamanho e estrutura dos olhos de ovelha e humanos, otimizar a dose e o volume de injeções de TVI em ovinos é um passo relevante para a tradução para a clínica. Este artigo detalha o protocolo para injeção de TVI no olho de ovelha, que é seguro e mostra uma taxa muito baixa de respostas inflamatórias oculares. Este método também demonstra a eficácia da terapia genética ocular mediada por AAV9 para abordar o componente retiniano da NCL em ovinos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por sua assistência no estabelecimento desse protocolo e na realização das injeções descritas por Murray et al.15. Os autores também reconhecem o financiamento da CureKids New Zealand, da Canterbury Medical Research Foundation, da Neurogene Inc e da Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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