Summary
Intravitreale injektioner blev udført i fåreøjet med det formål at levere viral-medieret genterapi til nethinden.
Abstract
Der er flere metoder til levering af terapeutiske midler til nethinden, herunder intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulær eller topisk administration. IVT-lægemiddellevering involverer en injektion i øjets glasagtige humor, et gelatinøst stof, der fylder øjets bageste kammer og opretholder formen på øjenkloden. Selvom IVT-ruten er mindre specifikt målrettet end subretinal levering, er den meget mindre invasiv og bruges i vid udstrækning i kliniske omgivelser til en række okulære sygdomme.
Vi har tidligere demonstreret effekten af intravitreal levering af et adeno-associeret virus (AAV)-medieret genterapiprodukt (AAV9). CLN5) hos får med en naturligt forekommende CLN5-form for neuronal ceroid lipofuscinose (NCL). Berørte får modtog IVT-genterapi på det ene øje, mens det andet ubehandlede øje fungerede som en intern kontrol. Retinal struktur og funktion blev opretholdt i det behandlede øje op til 15 måneder efter behandlingen, mens det ubehandlede øje viste gradvist faldende funktion og svær atrofi under postmortem undersøgelse. Baseret på fåreundersøgelserne blev CLN5-genterapiproduktet godkendt som et kandidatforsøgsnyt lægemiddel (IND) af United States Food and Drug Administration i september 2021. Dette papir beskriver den kirurgiske protokol for IVT-levering af en terapeutisk viral vektor til fåreøjet.
Introduction
Flere metoder kan bruges til at levere terapeutiske midler til nethinden, herunder intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulær eller topisk administration. Hver administrationsvej involverer overvindelse af barrierer såsom blod-nethindebarrieren eller de indre og ydre begrænsende membraner og har varierende effektivitetshastigheder afhængigt af det lægemiddel, der leveres, og det specifikke retinale mål 1,2.
IVT-lægemiddelafgivelse involverer en injektion i øjets glasagtige humor, et gelatinøst stof, der optager øjets bageste kammer. Den primære funktion af glasagtig humor er at opretholde formen på øjenkloden og holde okulært væv, såsom linsen og nethinden, på plads. Den glasagtige humor består stort set af vand med små mængder kollagen, hyaluronsyre og andre ikke-kollagenøse proteiner3. IVT-injektion er en enkel og almindelig procedure, der rutinemæssigt anvendes til behandling af en lang række okulære tilstande, herunder aldersrelateret makuladegeneration, diabetisk makulært ødem, diabetisk retinopati, retinal veneokklusion og flere arvelige retinale dystrofier 4,5.
Neuronale ceroid lipofuscinoser (NCL; Batten sygdom) er en gruppe af dødelige lysosomale opbevaringssygdomme, der forårsager alvorlig degeneration af hjernen og nethinden. Der er i øjeblikket 13 kendte varianter af NCL som følge af mutationer i forskellige gener (CLN1-8, CLN10-14), der overvejende påvirker børn, men har varierende debutalder og sygdommens sværhedsgrad6. NCL'erne deler almindelige progressive symptomer, herunder kognitiv og motorisk tilbagegang, anfald og tab af syn. Der er ingen kur mod NCL; imidlertid er hjernestyret enzymerstatningsterapi i øjeblikket i kliniske forsøg med CLN2-sygdom 7,8, og AAV-medieret genterapi har vist stort løfte i prækliniske undersøgelser, med et klinisk forsøg med CLN5-genterapi, der forventes at begynde i 2022 9,10.
Mange andre arter udvikler naturligt forekommende former for NCL, herunder katte, hunde, får og køer. To fåremodeller af NCL er i øjeblikket under aktiv undersøgelse i New Zealand: en CLN5-sygdomsmodel hos Borderdale-får og en CLN6-sygdomsmodel hos får i South Hampshire. Berørte får udviser mange af de kliniske og patologiske træk ved den menneskelige sygdom, herunder retinal atrofi og tab af syn10,11. Selvom hjernestyret CLN5-genterapi hos får med CLN5-sygdom kan forhindre eller standse hjerneatrofi og klinisk tilbagegang, mister de behandlede får stadig deres syn9. Dette fremhævede behovet for at behandle nethinden for at bevare synet og opretholde en bedre livskvalitet, hvilket førte til etablering af en protokol for okulær genterapi hos får.
Fåreøjet repræsenterer en god model af det menneskelige øje på grund af dets lighed i øjenglobens dimensioner, glaslegemevolumen og retinal struktur10,12,13. Dette papir beskriver den kirurgiske protokol for IVT-levering af et lille volumen (≤100 μL) terapeutisk viral vektor til fåreøjet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Lincoln University Animal Ethics Committee og er i overensstemmelse med US National Institutes of Health retningslinjer for pleje og brug af dyr i forskning og New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale får blev diagnosticeret ved fødslen14 og vedligeholdt på Lincoln University forskningsbedrifter. Tre 3 måneder gamle homozygote (CLN5-/-) moderfår fik en enkelt IVT-injektion på venstre øje, hvor det ubehandlede højre øje fungerede som en intern kontrol. Elektroretinografi og patologidata blev sammenlignet med historiske sunde og påvirkede kontroldata. Den virale vektor, der blev anvendt i denne undersøgelse, var en selvkomplementær adeno-associeret virusserotype 9, der indeholdt kylling beta-handling (CBh) promotor og kodonoptimeret får CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). Den virale vektor blev leveret af University of North Carolina Vector Core, NC, USA.
1. Foroperation
- Autoklave det kirurgiske sæt (figur 1).
- Hurtigt fårene i 24 timer før operationen.
- Optag levende vægte inden operationen.
Figur 1: Intravitreal kirurgi kit. Instrumenter, der kræves til IVT-kirurgi, omfatter (1) et spekulum til at holde øjenlågene åbne og (2) et par buede næsetang til at gribe fat i bulbar-bindehinden og rotere øjet. (3) En lige næse hæmostat er også inkluderet som et alternativt instrument til at gribe bulbar conjunctiva og holde øjet på plads, hvis det er rullet tilbage i øjets kredsløb. Dette sæt autoklaveres inden operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Kirurgisk procedure
- Begræns dyret, og barber ulden fra den ene side af halsen over halsvenen ved hjælp af elektroniske klippere.
- Okkluder halsvenen ved at lægge tryk i bunden af halsrillen og visualisere den hævede vene.
- Den passende mængde diazepam (0,3 mg/kg) og ketamin (7,5 mg/kg) trækkes op i en steril sprøjte, og der fastgøres en steril 20 G-nål. Indsæt nålen i halsvenen, og træk forsigtigt stemplet tilbage for at sikre, at blod kommer ind i navet, og nålen er inde i venen. Når det er bekræftet, induceres gennem intravenøs (jugular) administration.
- Umiddelbart efter induktion skal du placere dyret i dorsal recumbency, forlænge nakken og holde tungen op og fremad ved hjælp af et laryngoskop for at visualisere strubehovedet. Udfør endotracheal intubation ved forsigtigt at indsætte et endotracheal rør (størrelse 6,0-9,0 afhængigt af fårenes størrelse) mellem stemmebåndene, når dyret udånder. Pust straks den endotrachele manchet op, og fastgør røret med et slips omkring underkæben. Bekræft luftstrømmen gennem røret.
- Overfør fårene til operationsbordet og læg det i lateral recumbency.
- Tilslut straks endotrachealrøret til slangerne på bedøvelsesmaskinen til levering af isofluran i 100% ilt. Begynd først med 3% -4% isofluran og reducer derefter til 2% -3% til vedligeholdelse. Overhold fårets spontane ventilation.
- Overvåg hjerte (puls) hastighed, respirationsfrekvens, iltmætning, endetidende CO2 -niveauer og rektal kropstemperatur under hele proceduren. Se tabel 1 for fysiologiske værdier for disse parametre hos bedøvede får (variabel, men brug som vejledning).
- Placer en stor, steril, firkantet drapering på en kirurgisk operationsvogn efterfulgt af de sterile instrumenter.
- Placer en steril, fenestreret kirurgisk drapering over øjet, der skal injiceres.
- Desinficer øjet aseptisk ved hjælp af en steril 20 ml sprøjte til vanding af øjet med 1-5% povidon-jodopløsning.
- Påfør 1-2 dråber Alcaine 0,5% W / V oftalmisk opløsning, som lokalbedøvelse, til øjet.
- Monter et Nopa Barraquer-Colibri øjenspekulum (10 mm) på øjenlågene for at holde øjet åbent.
- Tag fat i bulbar conjunctiva på det dorsolaterale aspekt af øjet med tang, og drej øjenglobussen ventromedialt.
| Bevidst | Bedøvede | Anbefalet kritisk interventionspunkt | |
| Puls (slag/min) | 50-80 (hvile) til 280 (aktiv) | 50-80 | <50, >100 |
| Respirationsfrekvens (vejrtrækninger/min) | 15-40 (hvile) til 350 (overophedet) | 10-30 | <8, >40 |
| Iltmætning (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO2 i endetiden (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Kropstemperatur (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabel 1: Fysiologiske værdier af parametre, der skal overvåges hos bedøvede får.
3. Viral forberedelse
- Opbevar AAV-vektoralikvoter ved -80 °C indtil brug.
- På operationsdagen optøes det nødvendige antal hætteglas til levering af IVT på is.
- Umiddelbart før administration hvirvles den virale vektor aliquot og centrifuge ved 400 × g i 10 s for at indsamle indholdet.
- Fortynd hver viral vektor aliquot i sterilt filtreret 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) til den ønskede dosis i et endeligt volumen på 100 μL. Præparer vektorfortyndinger i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør med lavt proteinindhold ved hjælp af sterile filterpipettespidser. Bortskaf alle forbrugsstoffer, der har været i kontakt med den virale vektor i desinfektionsopløsning (se materialetabellen).
BEMÆRK: I den oprindelige publikation15 blev dosis af det terapeutiske middel (AAV9. CLN5) var 1,9 x 1010 virale genomer. Den anbefalede dosis vil variere afhængigt af det terapeutiske middel, der administreres; Derfor er en dosis ikke inkluderet i standardprotokollen, der præsenteres her. - Træk hele 100 μL af AAV-vektorpræparatet ind i en steril, lavdød 1 ml sprøjte med en permanent fastgjort 28 G x 1/2 i nål til øjeblikkelig injektion. Sørg for, at tiden fra forberedelse til injektion er mindre end 2 min.
4. Viral administration
- Nålen indsættes ca. 7 mm bagud på sclera på øjets laterale side og vinkles bagud for at undgå linsen (figur 2 og figur 3). Indfør den enkelte injektion på 100 μL som en bolus så tæt på nethinden som muligt uden at forstyrre nethinden.
- Skyl øjet med ca. 10-15 ml 1-5% povidon-jodopløsning efterfulgt af 10 ml saltvand inden fjernelse af spekulum og drapering.
- Vend fårene om og gentag med det andet øje, hvis det er nødvendigt.
Figur 2: Ventromedial rotation af øjenkloden . (A) Tag fat i bulbar-bindehinden med ikke-tandet tang og (B) drej ventromedialt (dvs. ned og mod snuden) for at udsætte øjets dorsolaterale overflade til injektion. Forkortelser: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Injektionssted og dybde. Nålen injiceres på det dorsolaterale aspekt af øjengloben, og nåleakslens fulde længde (0,5 tommer / 12,7 mm) indsættes i øjet. Bemærk nålens vinkel mod øjets bageste for at undgå linsen og injicere så tæt på nethinden som muligt. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Postoperativ forvaltning
- Efter afslutningen af proceduren skal du stoppe isoflurangasinindåndingsanæstesi, skylle linjen med 100% ilt, afbryde slangen fra endotrachealrøret og overføre fårene til genopretningsrummet.
- Placer fårene i sternal liggende med benene gemt nedenunder, og overvåg indtil fuld genopretning. Sørg for, at dyrets mund er fri for forhindringer.
- Når synkerefleksen observeres, skal manchetten på endotrachealrøret delvist tømmes manchetten og forsigtigt fjernes røret fra munden.
- Administrer en intramuskulær ikke-steroid antiinflammatorisk i biceps femoris muskel i bagbenet, subkutane antibiotika på siden af nakken eller bag skulderen og 0,5% chloramphenicol øjendråber til overfladen af øjenkloden.
- Sørg for vand og mad (lucernepiller og avner), når fårene kan stå uden hjælp.
- Administrer 0,5% chloramphenicol øjendråber 2-3 om dagen i 7 dage efter operationen.
- Hold fårene indendørs natten over, før de vender tilbage til den udendørs fold ca. 24 timer efter operationen.
- Optag rektale temperaturer dagligt i 3 uger. Overvåg for eventuelle ændringer i puls eller åndedrætsfrekvens, fødevareforbrug, neuroadfærd, kropstemperatur, vægt, kropsholdning, øjenhygiejne og kliniske tegn på dårligt helbred. Søg passende dyrlægebehandling, hvis der er tegn på bivirkninger.
6. Vurdering af effektiviteten in vivo
- Hvis målet med IVT-injektionen er at bevare synet, skal du overvåge effektiviteten in vivo ved hjælp af metoder som labyrinttest eller elektroretinografi (ERG) til vurdering af retinalcellefunktion eller optisk kohærenstomografi (OCT) til vurdering af retinal struktur.
BEMÆRK: Disse effektmål er velbeskrevet efter IVT-genterapi11,15,16.
7. Vævsanalyse efter døden
- Udføre fåreaflivning ved hjælp af en godkendt metode ved et passende endepunkt efter intravitreal injektionskirurgi.
BEMÆRK: Foreslåede eutanasimetoder, såsom intravenøs veterinær eutanasimedicin eller en penetrerende fangebolt til livmoderhalsryggen efterfulgt af hurtig ekssanguination, er beskrevet andetsteds15,16. - Høst fåreøjekugler ved hjælp af kirurgisk skarp / stump buet saks. Skær den laterale og mediale canthus for at øge øjenhuleåbningen og skær derefter systematisk gennem konjunktivale folder, bindevæv, muskler og synsnerve for at frigøre øjenkloden fra stikkontakten.
- Nedsænkningsfiksering intakte, enukleerede øjenkugler i 10% formalin i 2 timer, efterfulgt af efterfiksering i Bouins opløsning i 4 timer, hvilket gør et lille (0,5 cm) snit i sclera for at muliggøre tilstrækkelig perfusion. Alternativt kan du nedsænke øjenkuglerne i Davidsons løsning i 48 timer.
- Behandle sektioner af øjenvæv via rutinemæssig paraffinvoksindlejring og sektionering ved 3-5 μm.
BEMÆRK: Farvningsprocedurer for hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og immunohistokemisk analyse er beskrevet tidligere15,16. - Vurder effekten i postmortemvæv ved hjælp af målinger såsom total retinal tykkelse, retinal lagtykkelse, antal af ydre nukleare lag cellulære rækker og immunohistokemisk farvning for retinale celletyper, retinal glia eller proteiner af interesse.
BEMÆRK: For protokoller for disse analyser, se tidligere publikationer15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten af IVT-levering af en CLN5-genterapivektor til dæmpning af retinal dysfunktion og degeneration hos får med CLN5 NCL er tidligere blevet demonstreret af denne forskningsgruppe15. Berørte får fik en enkelt 100 μL IVT-injektion af CLN5 pakket i en AAV-serotype 9 (AAV9) vektor (AAV9). CLN5) ind i det ene øje, hvor det kontralaterale øje tjener som en ubehandlet intern kontrol. Synet blev vurderet månedligt fra injektionsalderen (3 måneder) til sygdommen i slutstadiet (18 måneder). Postmortem analyse af retinal histologi blev udført på behandlede og ubehandlede øjne, samt aldersmatchede sunde og CLN5-påvirkede kontroller.
Elektroretinografi (ERG) analyse viste bevaret retinal funktion i det behandlede øje, mens det ubehandlede øje faldt på samme måde som CLN5-ramte dyr (figur 4)15. Retinal histologi blev næsten normaliseret i det behandlede øje med en total retinal tykkelse, der kan sammenlignes med sunde kontroldyr i den centrale nethinde. I modsætning hertil var tykkelsen af den ubehandlede nethinde sammenlignelig med CLN5-ramte dyr (figur 5)15. Lysosomal opbevaring, et kendetegnende patologisk træk ved NCL, blev ikke observeret i det behandlede øje, men var til stede i det ubehandlede øje15. Disse resultater viser, at genterapivektoren leveret via IVT-injektion var i stand til at standse sygdomspatogenese i det CLN5-ramte fåreøje. Ekspressionen af glialfibrillært surt protein (GFAP), en markør for nethindestress og astroglia, var lavere i behandlede øjne end i ubehandlede øjne, hvilket indikerer, at sygdomsrelateret inflammation blev svækket efter behandling (figur 6)15.
Figur 4: Mørktilpassede ERG-reaktioner fra CLN5-/- får efter intravitreal levering af AAV9. København. (A) Gennemsnitlige (± SEM) ERG-amplituder over tid i de behandlede (mørkegrønne, n = 3) og ubehandlede (lysegrønne, n = 3) øjne hos CLN5-/- får samt sund kontrol (blå, n = 6) og CLN5-påvirkede (røde, n = 6) får. (B) Repræsentative ERG-spor fra behandlede og ubehandlede øjne og sunde kontroller og berørte får ved 5 (sort linje) og 17 (grå linje) måneder. * angiver P < 0,05. Denne figur gengivet er fra Murray et al.15 med tilladelse fra Elsevier. Forkortelser: ERG = elektroretinografi; AAV = adeno-associeret virus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Retinal tykkelse af CLN5-/- får efter intravitreal levering af AAV9. København. Repræsentative fotomikrografer af H&E histologisk farvning i de behandlede og ubehandlede øjne på CLN5-/- får sammenlignet med aldersmatchede kontroller. Billeder og tykkelsesmålinger blev taget to steder; central nethinde (A-E) og perifer nethinde (F-J). (E) Gennemsnitlig (± SEM) retinal tykkelse (μm) i den centrale nethinde i de behandlede (mørkegrønne, n = 3) og ubehandlede (lysegrønne, n = 3) øjne sammenlignet med sund kontrol (blå, n = 4) og CLN5-påvirket (rød, n = 4) nethinden. J) Gennemsnitlig (± SEM) retinal tykkelse (μm) i den perifere nethinde af de behandlede og ubehandlede øjne hos CLN5-/- får sammenlignet med sund kontrol og CLN5-påvirket nethinde. * angiver P < 0,05, **** angiver P < 0,0001. Skalastænger = 50 μm. Denne figur er gengivet fra Murray et al.15 med tilladelse fra Elsevier. Forkortelser: NFL = nervefiberlag; GCL = ganglioncellelag; IPL = indre plexiformlag; INL = indre nukleart lag; OPL = ydre plexiformlag; ONL = ydre nukleare lag; IS/OS = indre og ydre segmenter af fotoreceptorer; RPE = retinal pigmentepitel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: GFAP-immunreaktivitet i nethinden hos CLN5-/- får efter intravitreal levering af AAV9. København. Repræsentative konfokale billeder af GFAP-immunreaktivitet i CLN5-/- fårs behandlede og ubehandlede øjne sammenlignet med kontroller. (A-D) GFAP immunreaktivitet, (E-H) DAPI nuklear markør, (I-L) Flettede billeder af de to kanaler. Skala bar = 20 μm. Denne figur er gengivet fra Murray et al.15 med tilladelse fra Elsevier. Forkortelser: NFL = nervefiberlag; GCL = ganglioncellelag; INL = indre nukleart lag; ONL = ydre nukleare lag; IS/OS = indre og ydre segmenter af fotoreceptorer; GFAP = glialfibrillært surt protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitreale injektioner er en af de mest almindelige kirurgiske procedurer inden for human oftalmologi og har vist sig effektiv til at levere AAV-medierede genterapier til nethinden hos får. Vi havde tidligere demonstreret effekten af AAV9. CLN5 genterapi leveret intravitrealt i dæmpning af retinal dysfunktion og degeneration hos får med CLN5 NCL15. Det er håbet, at oversættelsen af denne administrationsvej til humane NCL-patienter også vil vise sig gavnlig.
Protokollen for små volumen IVT-injektioner i et fårøje er relativt ligetil og ikke-invasiv, let reproducerbar og let for en ikke-ekspert at lære. Succesen afhænger af målcellerne i nethinden, den terapi, der leveres, og placeringen og retningen af selve injektionen. Selvom IVT-injektioner ofte menes at være mest effektive til at målrette mod indre nethindelag, har mange forskere demonstreret effekten af IVT-injektioner i sygdomme, hvor den ydre nethinde er den primære placering af sygdomspatogenese15,17,18,19. Forskellene i funktionelle og patologiske resultater efter IVT-injektioner vedrører sandsynligvis også den type terapi, der gives. For eksempel har genterapi til at levere gener, der koder for opløselige proteiner (f.eks. CLN5), vist sig at være meget mere effektiv end genterapier til at levere gener, der koder for intracellulære eller membranbundne proteiner (f.eks. CLN6)15. Uanset mål og type behandling er det afgørende at få injektionsstedet og vinklen korrekt for at maksimere effektiviteten. Som beskrevet i protokollen skal injektionsstedet for får være ca. 7 mm bagud i forhold til sclera på øjets laterale aspekt og vinklet bagud for at målrette mod den bageste glaslegeme. Nålens lystfiskeri er både at undgå linsen og at rette det injicerede lægemiddel så tæt på nethinden som muligt. Brug af en sikkerhedssprøjte med en permanent fastgjort 28 G (eller mindre) x 0,5 i nål med lavt dødt rum er afgørende for at minimere injektionsrelateret ubehag og dødt volumen, der forbliver i nålen eller navet. Denne længde kanyle kan indsættes fuldt ud i fåreøjet i en bageste vinkel uden et kirurgisk mikroskop og / eller risikoen for punktering af nethinden. Forskere, der har adgang til et kirurgisk mikroskop, kan bruge dette til at give et ekstra niveau af sikkerhed omkring at undgå nethindeforstyrrelser. Ellers er det tilstrækkeligt at bruge sikkerhedssprøjter og være opmærksom på dimensionerne på fåreøjekloden i den alder, der behandles, for at udføre denne procedure sikkert15.
Når du griber fat i øjet for at rotere det medialt og udsætte injektionsstedet, er det vigtigt at bruge ikke-tandede atraumatiske instrumenter for at undgå at beskadige øjets sarte væv. Hvis øjet er placeret centralt, er det relativt ligetil at gribe fat i bulbar-bindehinden ved grænsen til sclera og iris og rotere med den ene hånd, mens du injicerer med den anden hånd. Men hvis øjet har roteret off-center, hvilket kan forekomme under generel anæstesi, er det ofte nødvendigt at bruge en hemostat til at klemme på bulbar conjunctiva og dreje øjet på plads, hvilket efterlader hæmostat på plads for at fortsætte med proceduren.
Fåreøjne er robuste og genoprettes godt efter IVT-behandling med AAV9, der bærer får CLN5, hvor kun et får udvikler uveitis i det behandlede øje 1 uge efter injektion15. I dette tilfælde forsvandt uveitis inden for 1 uge og havde ingen langsigtet indvirkning på synet. Bortset fra dette ene tilfælde blev der ikke rapporteret om negative virkninger af IVT-injektioner i den første offentliggjorte undersøgelse15 eller i de >30 yderligere dyr i forskningsprogrammet injiceret ved 3 måneder, 6 måneder eller 9 måneder efter protokollen beskrevet her. Der er dog yderligere kvantitative mål for injektionssikkerhed, som forskere måske vil overveje at tilføje til deres postoperative vurderinger. Disse omfatter målinger af intraokulært tryk (IOP), fundusbilleddannelse eller OCT. Billeder af fundus før og efter injektion kan fremhæve, om der har været nogen forstyrrelse af nethinden på grund af injektionen og på lang sigt kan give et overblik over nethindens sundhed generelt.
I det tilfælde, hvor en fluorescerende markør injiceres, kan fluorescensbilleddannelse af fundus hjælpe med at visualisere spredningen af den injicerede markør16,20. OCT kan bruges til at visualisere nethinden i tværsnit in vivo for at identificere eventuelle strukturelle skader efter injektion og måle tykkelsen af nethinden over tid som reaktion på behandlingen. Visuel funktion efter injektion kan også vurderes ved ERG eller labyrinttest15,16. I tilfælde af viral-medieret genterapi til erhvervsrettet erhvervsrettet brug bør virkningen af immunresponset og tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer mod AAV-vektorer overvejes. Selvom det ikke er en del af den protokol, der er skitseret her for får, foreslås det, at forsøgspersoner testes for tilstedeværelsen af anti-AAV-neutraliserende antistoffer før genterapi, uanset administrationsvej, for at øge transduktionseffektiviteten16,21. Læsere henvises til en mere omfattende diskussion af spørgsmålet om immunrespons på AAV af Whitehead et al.22.
En almindelig komplikation under IVT-procedurer er subkonjunktival blødning (SCH)23, som kan forekomme, hvis kapillærerne i bulbar-bindehinden punkteres under nåleindsættelse. Heldigvis er SCH generelt harmløs og løser inden for få dage; Det er dog bedst at undgå konjunktivale kapillærer, når nålen indsættes. Efter injektion med de erhvervsrettede ungdomsuddannelser er det vigtigt at behandle de injicerede øjne med antibiotiske øjendråber (f.eks. chloramphenicol) og overvåge øjnene for tegn på infektion eller betændelse (uveitis). En anden almindelig begivenhed under IVT-procedurer er en stigning i IOP. Disse stigninger er oftest forbigående trykspidser i minutterne efter injektion og forårsager ingen langvarig skade24,25. Der er dog tilfælde, hvor IOP bør overvejes og overvåges. Når allerede eksisterende okulære tilstande såsom glaukom er til stede, eller når højere volumener (≥100 μL) injiceres, bør IOP overvåges nøje, og profylaktisk anterior kammerparacentese bør overvejes for at reducere trykket i øjenkloden 4,16. Desuden kan gentagne stigninger i IOP i tilfælde af gentagne indsprøjtninger med de erhvervsrettede ungdomsuddannelser være et problem og bør dæmpes som ovenfor4. Her demonstrerer vi IVT med henblik på en enkelt AAV-medieret genterapi; Derfor er de langsigtede konsekvenser af gentagne injektioner ikke en stor overvejelse.
Begrænsninger af IVT-injektioner inkluderer behovet for at trænge ind i anatomiske barrierer og den lavere målspecificitet sammenlignet med mere invasive metoder. For det første fortyndes det injicerede stof i glaslegemet og har derefter en afstand til at diffundere gennem glaslegemet og retinalvævet til målcellerne. Det betyder, at den indre nethinde lettere transduceres end den ydre nethinde efter indsprøjtning med de indadaptive sygdomme, og højere doser kan være nødvendige for at modvirke fortynding26. Protokollen beskrevet her understreger vigtigheden af at injicere så tæt på nethinden som muligt for at afbøde virkningerne af fortynding og diffusion gennem glaslegemet. Derfor indsættes den fulde længde af 0,5 tommer / 12,7 mm nåleakslen i øjet. Den yderligere fordel ved at indsætte den fulde nålelængde er den reducerede chance for væskeopstød under injektion 4,27.
Selvom denne nuværende protokol udelader det, anbefales det at forsinke fjernelsen af nålen i flere minutter efter injektion for yderligere at reducere chancerne for væskeopstød. Derudover skal injektionen udføres langsomt for at sikre, at væskestrålen ikke forstyrrer nethinden eller forårsager en hurtig stigning i IOP, og en øget injektionshastighed påvirker ikke diffusionshastighederne gennem glaslegemet28,29. Den indre begrænsende membran (ILM) er den primære barriere mellem glaslegemet og nethinden, som fungerer til at begrænse molekylernes bevægelse ind i nethinden30. Imidlertid kan permeabiliteten af ILM øges ved fordøjelse eller kirurgisk skrælning og øges sandsynligvis i det syge øje, hvilket gør penetrationen af terapeutiske molekyler lettere.
Med hensyn til målspecificitet har administration af de erhvervsrettede ungdomsuddannelser mindst sammenlignet med andre intraokulære veje såsom subretinal og suprachoroidal, som diskuteret ovenfor og andetsteds10. Imidlertid udvikles nye generationer af AAV'er rutinemæssigt for at indeholde ændringer, som forbedrer målretningen mod bestemte celletyper eller mere effektivt overvinder barrierer som ILM31. Anvendelsen af sådanne modificerede capsider har øget transduktionseffektiviteten efter administration af de erhvervsrettede ungdomsuddannelser i en række modelarter 5,32,33.
Formålet med genterapien beskrevet af Murray et al.15 var at levere en funktionel kopi af CLN5-genet ; derfor er et mål for effektivitet tilstedeværelsen af transducerede celler, der udtrykker CLN5-protein. Vi har forsøgt at bruge immunhistokemi til at detektere CLN5-transducerede celler i nethinden, som vi rutinemæssigt gør i fårhjernevæv; Det antistof, som vi typisk bruger i fritsvævende hjernevæv, virker imidlertid ikke i paraffinindlejret nethindevæv. Fejlfinding og undersøgelse af alternative måder at detektere genet eller proteinet af interesse i nethinden er i gang for at tilføje til vurderingen af effektivitet. En potentiel måde at opnå dette på er ved at injicere en viral vektor indeholdende et reportergen (såsom grønt fluorescerende protein; Gfp) og vurdering af GFP-ekspression via immunhistokemi. En anden måde at vurdere effekten på er at bruge kvantitativ PCR til at vurdere niveauer af transgenekspression.
Udvikling af protokoller for IVT-injektioner hos store dyr er et afgørende skridt i retning af behandling af degenerative sygdomme i nethinden, især sygdomme med en genetisk komponent, da IVT-genterapi er en lovende potentiel terapeutisk. For degenerative sygdomme, hvor nethinden allerede er skrøbelig, udgør IVT-behandling mindre risiko for nethindeløsning eller rive. I betragtning af lighederne i størrelse og struktur af får og menneskelige øjne er optimering af dosis og volumen af IVT-injektioner hos får et relevant skridt i retning af oversættelse til klinikken. Dette papir beskriver protokollen for IVT-injektion i fåreøjet, hvilket er sikkert og viser en meget lav grad af okulære inflammatoriske reaktioner. Denne metode demonstrerer også effekten af AAV9-medieret okulær genterapi til at adressere nethindekomponenten i NCL hos får.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) for hans hjælp til at etablere denne protokol og udføre injektionerne beskrevet af Murray et al.15. Forfatterne anerkender også finansiering fra CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc og Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
