Summary
Koyun gözünde intravitreal enjeksiyonlar, retinaya viral aracılı gen tedavisi vermek amacıyla yapıldı.
Abstract
Terapötik ajanların retinaya verilmesi için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler vardır. IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını dolduran ve göz küresinin şeklini koruyan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına bir enjeksiyon içerir. IVT yolu subretinal doğumdan daha az spesifik olarak hedeflenmiş olmasına rağmen, çok daha az invazivdir ve bir dizi oküler hastalık için klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Daha önce adeno ilişkili virüs (AAV) aracılı bir gen terapisi ürününün (AAV9) intravitreal olarak verilmesinin etkinliğini göstermiştik. CLN5), doğal olarak oluşan CLN5 nöronal seroid lipofuscinosis (NCL) formuna sahip koyunlarda. Etkilenen koyunların bir gözünde IVT gen terapisi verilirken, diğer tedavi edilmeyen göz iç kontrol görevi gördü. Tedavi edilen gözde tedaviden 15 ay sonrasına kadar retinal yapı ve fonksiyon korunurken, tedavi edilmeyen gözde postmortem muayene sırasında giderek azalan fonksiyon ve ciddi atrofi görüldü. Koyun çalışmalarına dayanarak, CLN5 gen terapisi ürünü, Eylül 2021'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından aday bir araştırma yeni ilacı (IND) olarak temizlendi. Bu yazıda IVT'nin küçükbaş göze terapötik viral vektör verilmesi için cerrahi protokol detaylandırılmıştır.
Introduction
Retinaya terapötik ajanlar vermek için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılabilir. Her uygulama yolu, kan-retina bariyeri veya iç ve dış sınırlayıcı membranlar gibi engellerin aşılmasını içerir ve verilen ilaca ve spesifik retinal hedefe bağlı olarak değişen etkinlik oranlarına sahiptir 1,2.
IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını kaplayan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına enjeksiyonu içerir. Vitröz mizahın birincil işlevi, göz küresinin şeklini korumak ve lens ve retina gibi oküler dokuları yerinde tutmaktır. Vitröz mizah, az miktarda kollajen, hyaluronik asit ve diğer kollajenöz olmayan proteinler içeren büyük ölçüde sudan oluşur3. IVT enjeksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik makula ödemi, diyabetik retinopati, retinal ven tıkanıklığı ve çeşitli kalıtsal retina distrofileri dahil olmak üzere çok çeşitli oküler durumları tedavi etmek için rutin olarak kullanılan basit ve yaygın bir prosedürdür 4,5.
Nöronal seroid lipofussinozlar (NCL; Batten hastalığı), beyin ve retinada ciddi dejenerasyona neden olan ölümcül lizozomal depo hastalıkları grubudur. Şu anda, ağırlıklı olarak çocukları etkileyen, ancak farklı başlangıç yaşlarına ve hastalık şiddetine sahip olan farklı genlerdeki (CLN1-8, CLN10-14) mutasyonlardan kaynaklanan 13 bilinen NCL varyantı vardır6. NCL'ler, bilişsel ve motor gerileme, nöbetler ve görme kaybı gibi ortak ilerleyici semptomları paylaşır. NCL'nin tedavisi yoktur; Bununla birlikte, beyne yönelik enzim replasman tedavisi şu anda CLN2 hastalığı7,8 için klinik çalışmalardadır ve AAV aracılı gen terapisi, CLN5 gen terapisi için klinik bir araştırmanın 2022'de başlaması beklenen klinik çalışmalarla klinik öncesi çalışmalarda büyük umut vaat etmiştir 9,10.
Diğer birçok tür, kediler, köpekler, koyunlar ve inekler de dahil olmak üzere doğal olarak oluşan NCL formları geliştirir. NCL'nin iki küçükbaş hayvan modeli şu anda Yeni Zelanda'da aktif olarak çalışılmaktadır: Borderdale koyunlarında bir CLN5 hastalık modeli ve Güney Hampshire koyunlarında bir CLN6 hastalık modeli. Etkilenen koyunlar, retina atrofisi ve görme kaybı da dahil olmak üzere insan hastalığının klinik ve patolojik özelliklerinin çoğunu sergiler10,11. CLN5 hastalığı olan koyunlarda beyne yönelik CLN5 gen terapisi beyin atrofisini ve klinik düşüşü önleyebilse veya durdurabilse de, tedavi edilen koyunlar hala vizyonlarını kaybeder9. Bu, görüşü korumak ve daha iyi bir yaşam kalitesini korumak için retinayı tedavi etme ihtiyacını vurguladı ve koyunlarda oküler gen tedavisi için bir protokol oluşturulmasına yol açtı.
Koyun gözü, göz küre boyutları, vitreus hacmi ve retinal yapı10,12,13'teki benzerliği nedeniyle insan gözünün iyi bir modelini temsil eder. Bu yazıda IVT'nin küçükbaş göze küçük hacimli (≤100 μL) terapötik viral vektörün verilmesi için cerrahi protokol detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Lincoln Üniversitesi Hayvan Etiği komitesi tarafından onaylanmıştır ve araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımı için ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları ve Yeni Zelanda Hayvan Refahı Yasası (1999) ile uyumludur. Borderdale koyunlarıdoğum 14'te teşhis edildi ve Lincoln Üniversitesi araştırma çiftliklerinde tutuldu. 3 aylık üç homozigot (CLN5-/-) koyun, sol göze tek bir IVT enjeksiyonu yapıldı ve tedavi edilmeyen sağ göz iç kontrol görevi gördü. Elektroretinografi ve patoloji verileri tarihsel sağlıklı ve etkilenmiş kontrol verileriyle karşılaştırıldı. Bu çalışmada kullanılan viral vektör, tavuk beta etkisi (CBh) promotörü ve kodon ile optimize edilmiş küçükbaş hayvan CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt) içeren, kendi kendini tamamlayan adeno ilişkili bir virüs serotip 9 idi. Viral vektör, Kuzey Carolina Vector Core, NC, ABD Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.
1. Ameliyat öncesi
- Cerrahi kiti otoklav edin (Şekil 1).
- Koyunları ameliyattan önce 24 saat boyunca oruç tutun.
- Ameliyattan önce canlı ağırlıkları kaydedin.
Resim 1: İntravitreal cerrahi kit. IVT cerrahisi için gerekli aletler arasında (1) göz kapaklarını açık tutmak için bir spekulum ve (2) bulber konjonktivayı kavramak ve gözü döndürmek için bir çift kavisli burun forseps bulunur. (3) Düz bir burun hemostatı, bulber konjonktivayı kavramak ve göz yörüngesine geri dönmüşse gözü yerinde tutmak için alternatif bir araç olarak da dahil edilir. Bu kit ameliyattan önce otoklavlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Cerrahi prosedür
- Hayvanı kısıtlayın ve elektronik makaslar kullanarak, yünü boynun bir tarafından juguler damar üzerinde tıraş edin.
- Juguler oluğun tabanına basınç uygulayarak juguler veni tıkayın ve yükseltilmiş damarı görselleştirin.
- Uygun miktarda diazepam (0.3 mg / kg) ve ketamin (7.5 mg / kg) steril bir şırıngaya çekin ve steril bir 20 G iğne takın. İğneyi juguler damara yerleştirin ve kanın göbeğe girdiğinden ve iğnenin damarın içinde olduğundan emin olmak için yavaşça pistona geri çekin. Doğrulandıktan sonra, intravenöz (juguler) uygulama yoluyla indükleyin.
- İndüksiyondan hemen sonra, hayvanı dorsal yassılığa yerleştirin, boynu uzatın ve larinksi görselleştirmek için bir laringoskop kullanarak dili yukarı ve ileri doğru tutun. Hayvan nefes verirken ses telleri arasına nazikçe bir endotrakeal tüp (koyunun büyüklüğüne bağlı olarak 6.0-9.0 boyutu) yerleştirerek endotrakeal entübasyon yapın. Endotrakeal manşeti hemen şişirin ve tüpü alt çenenin etrafında bir bağ ile sabitleyin. Tüpten hava akışını onaylayın.
- Koyunları ameliyat masasına aktarın ve yanal yassılığa yerleştirin.
- Endotrakeal tüpü% 100 oksijende izofluran verilmesi için derhal anestezik makinenin hortumlarına bağlayın. Başlangıçta% 3 -% 4 izofluran ile başlayın ve daha sonra bakım için% 2 -% 3'e düşürün. Koyunların kendiliğinden havalandırılmasını gözlemleyin.
- İşlem boyunca kalp (nabız) hızını, solunum hızını, oksijen doygunluğunu, son gelgit CO2 seviyelerini ve rektal vücut ısısını izleyin. Anestezi uygulanan koyunlarda bu parametrelerin fizyolojik değerleri için Tablo 1'e bakınız (değişken, ancak kılavuz olarak kullanın).
- Cerrahi bir ameliyat arabasına büyük, steril, kare bir örtü yerleştirin, ardından steril aletler yerleştirin.
- Steril, federe bir cerrahi örtüyü enjekte edilecek gözün üzerine yerleştirin.
- Gözü% 1-5 povidon-iyot çözeltisi ile sulamak için steril bir 20 mL şırınga kullanarak gözü aseptik olarak dezenfekte edin.
- Göze lokal anestezik olarak 1-2 damla Alcaine% 0.5 W / V oftalmik solüsyon uygulayın.
- Gözü açık tutmak için göz kapaklarına bir Nopa Barraquer-Colibri göz spekulumu (10 mm) takın.
- Forseps ile gözün dorsolateral kısmındaki bulber konjonktivayı kavrayın ve göz küresini ventromedial olarak döndürün.
| Farkında | Anestezi uygulanmış | Önerilen kritik müdahale noktası | |
| Kalp atış hızı (atım/dak) | 50-80 (dinlenme) ila 280 (aktif) | 50-80 | <50, >100 |
| Solunum hızı (nefes/dk) | 15-40 (dinlenme) ila 350 (aşırı ısınmış) | 10-30 | <8, >40 |
| Oksijen doygunluğu (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| Son gelgit CO2 (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Vücut ısısı (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tablo 1: Anestezi uygulanan koyunlarda izlenecek parametrelerin fizyolojik değerleri.
3. Viral hazırlık
- AAV vektör alikotlarını kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Ameliyat gününde, buzda IVT teslimatı için gerekli sayıda şişeyi çözün.
- Uygulamadan hemen önce, viral vektör aliquot'u vorteksleyin ve içeriği toplamak için 10 s boyunca 400 × g'de santrifüj yapın.
- Her viral vektör aliquotunu steril filtrelenmiş 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde istenen doza 100 μL'lik son hacimde seyreltin. steril filtre pipet uçlarını kullanarak steril 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünde vektör seyreltmeleri hazırlayın. Viral vektörle temas eden tüm sarf malzemelerini dezenfektan çözeltisine atın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Orijinal yayında15 terapötik ajanın dozu (AAV9. CLN5) 1.9 x 1010 viral genom idi. Önerilen dozaj, uygulanan terapötik ajana bağlı olarak değişecektir; bu nedenle, burada sunulan standart protokole bir dozaj dahil edilmemiştir. - AAV vektör preparatının tam 100 μL'sini, derhal enjeksiyon için iğneye kalıcı olarak tutturulmuş 28 G x 1/2 ile steril, düşük ölü alanlı 1 mL şırıngaya çekin. Hazırlıktan enjeksiyona kadar geçen sürenin 2 dakikadan az olduğundan emin olun.
4. Viral uygulama
- İğneyi gözün lateral tarafındaki skleraya yaklaşık 7 mm posterior olarak yerleştirin ve lensten kaçınmak için posterioral olarak açılı olarak yerleştirin (Şekil 2 ve Şekil 3). 100 μL'lik tek enjeksiyonu, retina yüzeyini rahatsız etmeden retinaya mümkün olduğunca yakın bir bolus olarak uygulayın.
- Spekulum ve perdenin çıkarılmasından önce gözü yaklaşık 10-15 mL% 1-5 povidon-iyot çözeltisi ve ardından 10 mL salin ile durulayın.
- Koyunları ters çevirin ve gerekirse diğer gözle tekrarlayın.
Şekil 2: Göz küresinin ventromedial dönüşü. (A) Bulber konjonktivayı dişsiz forseps ile kavrayın ve (B) enjeksiyon için gözün dorsolateral yüzeyini açığa çıkarmak için ventromedial olarak (yani buruna doğru) döndürün. Kısaltmalar: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = yanal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Enjeksiyon yeri ve derinliği. İğne, göz küresinin dorsolateral yönüne enjekte edilir ve iğne milinin tam uzunluğu (0,5 inç / 12,7 mm) göze yerleştirilir. Lensten kaçınmak için iğnenin gözün arka tarafına doğru açısına dikkat edin ve retinaya mümkün olduğunca yakın enjekte edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Postoperatif yönetim
- İşlemin tamamlanması üzerine, izofluran gazı inhalasyon anestezisini durdurun, hattı% 100 oksijenle yıkayın, hortumu endotrakeal tüpten ayırın ve koyunları iyileşme odasına aktarın.
- Koyunları sternal yassılığa yerleştirin, bacaklar altına sıkışmış olarak ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Hayvanın ağzının herhangi bir tıkanıklıktan arındırıldığından emin olun.
- Yutma refleksi gözlendiğinde, endotrakeal tüpün manşetini kısmen söndürün ve tüpü ağızdan yavaşça çıkarın.
- Arka ekstremitenin biseps femoris kasına, boynun yan tarafında veya omzun arkasında deri altı antibiyotiklere intramüsküler bir nonsteroidal anti-enflamatuar uygulayın ve% 0.5 kloramfenikol göz küresinin yüzeyine düşer.
- Koyunlar yardımsız durabildiğinde su ve yiyecek (lucerne peletleri ve saman) sağlayın.
- Ameliyat sonrası 7 gün boyunca% 0.5 kloramfenikol göz damlası günde 2-3 damla uygulayın.
- Koyunları ameliyattan yaklaşık 24 saat sonra açık hava padokuna dönmeden önce gece boyunca içeride tutun.
- 3 hafta boyunca günlük rektal sıcaklıkları kaydedin. Nabız veya solunum hızı, gıda tüketimi, nörodavranış, vücut ısısı, kilo, duruş, göz sağlığı ve klinik hastalık belirtilerindeki değişiklikleri izleyin. Herhangi bir yan etki belirtisi varsa uygun veteriner tedavisi isteyin.
6. İn vivo etkinliğin değerlendirilmesi
- IVT enjeksiyonunun amacı görmeyi korumaksa, retina hücre fonksiyonunu değerlendirmek için labirent testi veya elektroretinografi (ERG) veya retina yapısını değerlendirmek için optik koherens tomografi (OCT) gibi yöntemlerle in vivo etkinliği izleyin.
NOT: Bu etkinlik ölçümleri IVT gen terapisi11,15,16'yı takiben iyi tanımlanmıştır.
7. Postmortem doku analizi
- İntravitreal enjeksiyon ameliyatını takiben uygun bir son noktada onaylanmış bir yöntemle koyun ötenazisi uygulayın.
NOT: İntravenöz veteriner ötenazi ilaçları veya servikal omurgaya nüfuz eden bir esir cıvata ve ardından hızlı ekssanguinasyon gibi önerilen ötenazi yöntemleri, başka bir yerde detaylandırılmıştır15,16. - Cerrahi keskin/künt kavisli makas kullanarak koyun gözü kürelerini hasat edin. Göz yuvası açıklığını arttırmak için lateral ve medial kanthus kesin ve daha sonra göz küresini soketten serbest bırakmak için konjonktival kıvrımları, bağ dokusunu, kasları ve optik siniri sistematik olarak kesin.
- Daldırma-sabitleme bozulmamış, enüklee göz küreleri 2 saat boyunca% 10 formalin içinde, ardından Bouin çözeltisinde 4 saat boyunca postfiksasyon ile yeterli perfüzyona izin vermek için sklerada küçük (0.5 cm) bir kesim yapılır. Alternatif olarak, göz kürelerini Davidson'un çözeltisine daldırarak 48 saat boyunca sabitleyin.
- Göz dokusunun kesitlerini rutin parafin balmumu gömme ve 3-5 μm'de kesitleme yoluyla işleyin.
NOT: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünohistokimyasal analiz için boyama prosedürleri daha önce15,16 olarak tanımlanmıştır. - Postmortem dokudaki etkinliği, toplam retina kalınlığı, retina tabakası kalınlığı, dış nükleer tabaka hücresel sıralarının sayıları ve retinal hücre tipleri, retinal glia veya ilgilenilen proteinler için immünohistokimyasal boyama gibi ölçümlerle değerlendirin.
NOT: Bu analizlere ilişkin protokoller için öncekiyayınlara bakınız 15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CLN5 NCL'li koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında bir CLN5 gen terapisi vektörünün IVT verilmesinin etkinliği daha önce bu araştırma grubu15 tarafından gösterilmiştir. Etkilenen koyunlara, bir AAV serotip 9 (AAV9) vektöründe (AAV9) paketlenmiş tek bir 100 μL IVT CLN5 enjeksiyonu yapıldı. CLN5) bir göze, kontralateral göz tedavi edilmemiş bir iç kontrol görevi görür. Görme, enjeksiyon yaşından (3 ay) son dönem hastalığına (18 ay) kadar aylık olarak değerlendirildi. Retinal histolojinin postmortem analizi, tedavi edilen ve edilmeyen gözlerin yanı sıra yaşa uygun sağlıklı ve CLN5'ten etkilenen kontroller üzerinde yapıldı.
Elektroretinografi (ERG) analizi, tedavi edilen gözde korunmuş retina fonksiyonunu gösterirken, tedavi edilmeyen göz CLN5'ten etkilenen hayvanlara benzer şekilde azalmıştır (Şekil 4)15. Retinal histoloji, tedavi edilen gözde neredeyse normalleştirildi ve toplam retina kalınlığı, merkezi retinadaki sağlıklı kontrol hayvanlarıyla karşılaştırılabilirdi. Buna karşılık, tedavi edilmemiş retinanın kalınlığı CLN5'ten etkilenen hayvanlarla karşılaştırılabilirdi (Şekil 5)15. NCL'nin ayırt edici bir patolojik özelliği olan lizozomal depolama, tedavi edilen gözde gözlenmedi, ancak tedavi edilmeyen gözde mevcuttu15. Bu sonuçlar, IVT enjeksiyonu yoluyla verilen gen terapisi vektörünün, CLN5'ten etkilenen koyun gözünde hastalık patogenezini durdurabildiğini göstermektedir. Retinal stres ve astroglianın bir belirteci olan glial fibriler asidik proteinin (GFAP) ekspresyonu, tedavi edilen gözlerde tedavi edilmeyen gözlere göre daha düşüktü, bu da hastalıkla ilişkili inflamasyonun tedaviden sonra azaldığını gösteriyor (Şekil 6)15.
Şekil 4: AAV9'un intravitreal doğumunu takiben CLN5-/- koyunlarının koyuğa adapte olmuş ERG yanıtları. CLN5. (A) CLN5-/- koyunların tedavi edilen (koyu yeşil, n = 3) ve tedavi edilmeyen (açık yeşil, n = 3) gözlerinde zaman içinde ortalama (± SEM) ERG genliklerinin yanı sıra sağlıklı kontrol (mavi, n = 6) ve CLN5'ten etkilenen (kırmızı, n = 6) koyunlar. (B) Temsili ERG, tedavi edilen ve edilmeyen gözlerden ve sağlıklı kontrollerden ve etkilenen koyunlardan 5 (siyah çizgi) ve 17 (gri çizgi) aylıkken izler. * P < 0,05'i gösterir. Bu rakam Elsevier'in izniyle Murray ve ark.15'e aittir. Kısaltmalar: ERG = elektroretinografi; AAV = adeno ilişkili virüs. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: AAV9'un intravitreal doğumunu takiben CLN5-/- koyunlarının retinal kalınlığı. CLN5. CLN5-/- koyunlarının tedavi edilen ve edilmeyen gözlerinde H&E histolojik boyamasının temsili fotomikrografileri, yaşa uygun kontrollere kıyasla. Görüntüler ve kalınlık ölçümleri iki yerde çekildi; merkezi retina (A-E) ve periferik retina (F-J). (E) Tedavi edilen (koyu yeşil, n = 3) ve tedavi edilmeyen (açık yeşil, n = 3) gözlerin merkezi retinasındaki ortalama (± SEM) retina kalınlığı (μm), sağlıklı kontrol (mavi, n = 4) ve CLN5'ten etkilenen (kırmızı, n = 4) retina ile karşılaştırıldığında. (J) CLN5-/- koyunlarının tedavi edilmiş ve edilmemiş gözlerinin periferik retinasındaki ortalama (± SEM) retina kalınlığı (μm), sağlıklı kontrol ve CLN5'ten etkilenen retina ile karşılaştırıldığında. * P'yi 0,05'<, **** P < 0,0001'i gösterir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakam Murray ve ark.15'ten Elsevier'in izniyle çoğaltılmıştır. Kısaltmalar: NFL = sinir lifi tabakası; GCL = ganglion hücre tabakası; IPL = iç pleksiform tabaka; INL = iç nükleer tabaka; OPL = dış pleksiform tabaka; ONL = dış nükleer tabaka; IS/OS = fotoreseptörlerin iç ve dış segmentleri; RPE = retinal pigment epiteli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: AAV9'un intravitreal doğumunu takiben CLN5-/- koyun retinasında GFAP immünoreaktivitesi. CLN5. Kontrollere kıyasla CLN5-/- koyunlarının tedavi edilen ve edilmeyen gözlerinde GFAP immünoreaktivitesinin temsili konfokal görüntüleri. (A-D) GFAP immünoreaktivitesi, (E-H) DAPI nükleer belirteci, (I-L) İki kanalın birleştirilmiş görüntüleri. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam Murray ve ark.15'ten Elsevier'in izniyle çoğaltılmıştır. Kısaltmalar: NFL = sinir lifi tabakası; GCL = ganglion hücre tabakası; INL = iç nükleer tabaka; ONL = dış nükleer tabaka; IS/OS = fotoreseptörlerin iç ve dış segmentleri; GFAP = glial fibriler asidik protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İntravitreal enjeksiyonlar, insan oftalmolojisinde en yaygın cerrahi prosedürlerden biridir ve koyunların retinasına AAV aracılı gen terapilerinin uygulanmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır. Daha önce AAV9'un etkinliğini göstermiştik. CLN5 gen tedavisi, CLN5 NCL15 ile koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında intravitreal olarak sağlandı. Bu uygulama yolunun insan NCL hastalarına çevrilmesinin de faydalı olacağı umulmaktadır.
Bir koyun gözüne küçük hacimli IVT enjeksiyonları için protokol nispeten basit ve invaziv değildir, kolayca tekrarlanabilir ve uzman olmayan birinin öğrenmesi kolaydır. Başarı, retinadaki hedef hücrelere, verilen tedaviye ve enjeksiyonun kendisinin konumuna ve yönüne bağlıdır. IVT enjeksiyonlarının genellikle iç retina tabakalarını hedeflemede en etkili olduğu düşünülse de, birçok araştırmacı dış retinanın hastalık patogenezinin birincil yeri olduğu hastalıklarda IVT enjeksiyonlarının etkinliğini göstermiştir15,17,18,19. IVT enjeksiyonlarını takiben fonksiyonel ve patolojik sonuçlardaki farklılıklar da muhtemelen verilen tedavinin türü ile ilgilidir. Örneğin, çözünür proteinleri kodlayan genleri (örneğin, CLN5) sağlayan gen terapisinin, hücre içi veya zara bağlı proteinleri (örneğin, CLN6) kodlayan genleri vermek için gen terapilerinden çok daha etkili olduğu gösterilmiştir15. Hedef ve tedavi türü ne olursa olsun, etkinliği en üst düzeye çıkarmak için enjeksiyon bölgesini ve açısını doğru yapmak çok önemlidir. Protokolde açıklandığı gibi, koyunlar için enjeksiyon bölgesi, gözün lateral yönündeki skleranın yaklaşık 7 mm posterior olması ve posterior vitreusu hedeflemek için posteriorda açılı olması gerekir. İğnenin açılması hem lensten kaçınmak hem de enjekte edilen ilacı retinaya mümkün olduğunca yakın yönlendirmektir. Düşük ölü alan iğnesinde kalıcı olarak tutturulmuş 28 G (veya daha küçük) x 0,5 olan bir güvenlik şırıngasının kullanılması, enjeksiyonla ilgili rahatsızlığı ve iğne veya göbeğinde kalan ölü hacmi en aza indirmek için çok önemlidir. Bu uzunluktaki iğne, cerrahi mikroskop olmadan ve / veya retinayı delme riski olmadan koyun gözüne arka açıyla tamamen yerleştirilebilir. Cerrahi bir mikroskopa erişimi olan araştırmacılar, retina bozulmasını önleme konusunda ek bir kesinlik seviyesi sağlamak için bunu kullanabilirler. Aksi takdirde güvenlik şırıngalarının kullanılması ve tedavi edilen yaşta koyun gözü küresinin boyutlarının farkında olunması bu işlemin güvenli bir şekilde yapılması için yeterlidir15.
Gözü medial olarak döndürmek ve enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için kavrarken, gözün hassas dokusuna zarar vermemek için dişsiz atravmatik aletler kullanmak önemlidir. Göz merkezi olarak konumlandırılmışsa, sklera ve iris sınırındaki bulber konjonktivayı kavramak ve diğer elle enjekte ederken bir elinizle döndürmek nispeten basittir. Bununla birlikte, eğer göz genel anestezi altında oluşabilecek merkez dışında dönmüşse, bulber konjonktiva üzerine kelepçelemek ve gözü pozisyona döndürmek için bir hemostat kullanmak ve hemostatı prosedüre devam etmek için yerinde bırakmak genellikle gereklidir.
Koyun gözleri sağlamdır ve AAV9 taşıyan küçükbaş hayvan CLN5 ile IVT tedavisini takiben iyi iyileşir, enjeksiyondan 1 hafta sonra tedavi edilen gözde sadece bir koyunda üveit gelişir15. Bu durumda, üveit 1 hafta içinde düzeldi ve görme üzerinde uzun vadeli bir etkisi olmadı. Bu vakanın yanı sıra, IVT enjeksiyonlarının ilk yayınlanan çalışma15'te veya burada açıklanan protokolü takiben 3 aylık, 6 aylık veya 9 aylıkken enjekte edilen araştırma programındaki >30 ek hayvanda olumsuz bir etkisi bildirilmemiştir. Bununla birlikte, araştırmacıların postoperatif değerlendirmelerine eklemeyi düşünmek isteyebilecekleri ek nicel enjeksiyon güvenliği önlemleri vardır. Bunlar arasında göz içi basıncı (GİB), fundus görüntüleme veya OCT ölçümleri bulunur. Enjeksiyondan önce ve sonra fundusun görüntüleri, enjeksiyon nedeniyle retinada herhangi bir bozulma olup olmadığını vurgulayabilir ve uzun vadede genel olarak retina sağlığına genel bir bakış sağlayabilir.
Bir floresan işaretleyicinin enjekte edilmesi durumunda, fundusun floresan görüntülemesi, enjekte edilen işaretleyicininyayılmasını görselleştirmeye yardımcı olabilir 16,20. OCT, enjeksiyon sonrası olası yapısal hasarları tanımlamak ve tedaviye yanıt olarak retinanın zaman içindeki kalınlığını ölçmek için retinayı in vivo kesitte görselleştirmek için kullanılabilir. Enjeksiyon sonrası görme fonksiyonu ERG veya labirent testi15,16 ile de değerlendirilebilir. IVT viral aracılı gen tedavisi durumunda, immün yanıtın etkisi ve AAV vektörlerine karşı nötralize edici antikorların varlığı göz önünde bulundurulmalıdır. Burada koyunlar için özetlenen protokolün bir parçası olmasa da, transdüksiyon verimliliğini artırmak için gen terapisinden önce anti-AAV nötralize edici antikorların varlığı açısından test edilmesi önerilmektedir16,21. Okuyucular, Whitehead ve ark.22 tarafından AAV'ye bağışıklık tepkileri konusunun daha kapsamlı bir tartışmasına yönlendirilmektedir.
IVT prosedürleri sırasında sık görülen bir komplikasyon, bulber konjonktivadaki kılcal damarların iğne yerleştirme sırasında delinmesi durumunda ortaya çıkabilen subkonjonktival kanamadır (SCH)23. Neyse ki, SCH genellikle zararsızdır ve birkaç gün içinde çözülür; Bununla birlikte, iğneyi yerleştirirken konjonktival kılcal damarlardan kaçınmak en iyisidir. IVT enjeksiyonunu takiben, enjekte edilen gözleri antibiyotik göz damlası (örneğin, kloramfenikol) ile tedavi etmek ve gözleri herhangi bir enfeksiyon veya iltihap belirtisi (üveit) açısından izlemek önemlidir. IVT prosedürleri sırasında bir diğer yaygın olay GİB'deki artıştır. Bu artışlar en sık enjeksiyonu takip eden dakikalarda basınçtaki geçici ani artışlardır ve uzun süreli hasara neden olmaz24,25. Bununla birlikte, GİB'nin dikkate alınması ve izlenmesi gereken durumlar vardır. Glokom gibi önceden var olan oküler durumlar mevcutken veya daha yüksek hacimler (≥100 μL) enjekte edildiğinde, GİB yakından izlenmeli ve göz küresindeki basıncı azaltmak için profilaktik ön kamara parasentezi düşünülmelidir 4,16. Ek olarak, tekrarlanan IVT enjeksiyonları durumunda GİB'de tekrarlanan ani artışlar bir endişe kaynağı olabilir ve yukarıdaki4 gibi zayıflatılmalıdır. Burada, tek bir AAV aracılı gen terapisinin amaçları için IVT'yi gösteriyoruz; Bu nedenle, tekrarlanan enjeksiyonların uzun vadeli sonuçları önemli bir husus değildir.
IVT enjeksiyonlarının sınırlamaları, anatomik bariyerlere nüfuz etme ihtiyacını ve daha invaziv yöntemlere kıyasla daha düşük hedef özgüllüğünü içerir. İlk olarak, enjekte edilen madde vitreusta seyreltilecek ve daha sonra vitreus boşluğu ve retina dokusundan hedef hücrelere yayılacak bir mesafeye sahip olacaktır. Bu, IVT enjeksiyonunu takiben iç retinanın dış retinadan daha kolay dönüştürüldüğü ve seyreltme26'ya karşı koymak için daha yüksek dozların gerekebileceği anlamına gelir. Burada açıklanan protokol, vitreus gövdesi boyunca seyreltme ve difüzyonun etkilerini hafifletmek için retinaya mümkün olduğunca yakın enjekte etmenin önemini vurgulamaktadır. Bu nedenle, 0,5 inç / 12,7 mm iğne milinin tam uzunluğu göze yerleştirilir. Tam iğne uzunluğunun yerleştirilmesinin ek avantajı, enjeksiyon 4,27 sırasında sıvı reflü şansının azalmasıdır.
Bu mevcut protokol bunu atlasa da, sıvı reflü olasılığını daha da azaltmak için enjeksiyondan sonra iğnenin çıkarılmasını birkaç dakika geciktirmeniz önerilir. Ek olarak, enjekte edilen sıvının jetinin retinayı bozmadığından veya GİB'de hızlı bir artışa neden olmadığından emin olmak için enjeksiyon yavaşça yapılmalıdır ve artan enjeksiyon hızı, vitreus28,29 boyunca difüzyon oranlarını etkilemez. İç sınırlayıcı membran (ILM), vitreus ve retina arasındaki birincil bariyerdir ve moleküllerin retinaya hareketini kısıtlamak için işlev görür30. Bununla birlikte, ILM'nin geçirgenliği sindirim veya cerrahi peeling ile arttırılabilir ve muhtemelen hastalıklı gözde artarak terapötik moleküllerin penetrasyonunu kolaylaştırır.
Hedef özgüllüğü ile ilgili olarak, IVT uygulaması, yukarıda ve başka yerlerde tartışıldığı gibi, subretinal ve suprakoroidal gibi diğer göz içi yollarına kıyasla en azolanıdır 10. Bununla birlikte, yeni nesil AAV'ler, belirli hücre tiplerine hedeflemeyi geliştiren veya ILM31 gibi engelleri daha verimli bir şekilde aşan modifikasyonları içerecek şekilde rutin olarak geliştirilmektedir. Bu tür modifiye kapsidlerin kullanımı, bir dizi model türünde IVT uygulamasını takiben transdüksiyon verimliliğini arttırmıştır 5,32,33.
Murray ve ark.15 tarafından detaylandırılan gen terapisinin amacı, CLN5 geninin fonksiyonel bir kopyasını sunmaktı; Bu nedenle, etkinliğin bir ölçüsü, CLN5 proteinini eksprese eden dönüştürülmüş hücrelerin varlığıdır. Koyun beyin dokusunda rutin olarak yaptığımız gibi, retinadaki CLN5 ile dönüştürülmüş hücreleri tespit etmek için immünohistokimyayı kullanmaya çalıştık; Bununla birlikte, tipik olarak serbest yüzen beyin dokusunda kullandığımız antikor, parafin gömülü retina dokusunda çalışmaz. Retinadaki ilgi çekici gen veya proteini tespit etmenin alternatif yollarını gidermek ve araştırmak, etkinliğin değerlendirilmesine katkıda bulunmak için devam etmektedir. Bunu başarmanın potansiyel bir yolu, bir muhabir geni (yeşil floresan proteini gibi; GFP) ve GFP ekspresyonunun immünohistokimya yoluyla değerlendirilmesi. Etkinliği değerlendirmenin bir başka yolu, transgen ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için kantitatif PCR kullanmaktır.
Büyük hayvanlarda IVT enjeksiyonları için protokoller geliştirmek, retinanın dejeneratif hastalıklarını, özellikle de genetik bir bileşene sahip hastalıkları tedavi etmek için çok önemli bir adımdır, çünkü IVT gen terapisi umut verici bir potansiyel terapötiktir. Retinanın zaten kırılgan olduğu dejeneratif hastalıklar için, IVT tedavisi retina dekolmanı veya yırtılması riskini azaltır. Koyunların ve insan gözlerinin büyüklüğü ve yapısındaki benzerlikler göz önüne alındığında, koyunlarda IVT enjeksiyonlarının dozunu ve hacmini optimize etmek, kliniğe çeviri için uygun bir adımdır. Bu yazıda, güvenli olan ve çok düşük oranda oküler inflamatuar yanıtlar gösteren koyun gözüne IVT enjeksiyonu protokolü detaylandırılmıştır. Bu yöntem aynı zamanda koyunlarda NCL'nin retinal bileşenini ele almak için AAV9 aracılı oküler gen tedavisinin etkinliğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bu protokolün oluşturulmasında ve Murray ve ark.15 tarafından tanımlanan enjeksiyonların gerçekleştirilmesinde Dr. Steve Heap'e (BVSc, CertVOphthal) verdiği yardım için teşekkür etmek ister. Yazarlar ayrıca CureKids New Zealand, Canterbury Tıbbi Araştırma Vakfı, Neurogene Inc ve Batten Hastalığı Destek ve Araştırma Derneği'nden gelen fonları da kabul ediyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
