Summary
ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एंटीबॉडी-मध्यस्थता रोगों की एक नई श्रेणी है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग इन एंटीबॉडी की खोज और लक्षण वर्णन करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख रोगियों के सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव में ऑटोएंटिबॉडी निर्धारित करने के लिए प्राथमिक सेल संस्कृति और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
पिछले 15 वर्षों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के एंटीबॉडी-मध्यस्थता रोगों की एक नई श्रेणी की विशेषता है और अब इसे "ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस" (एई) के रूप में परिभाषित किया गया है। वर्तमान में 17 ज्ञात एई सिंड्रोम हैं, और सभी न्यूरोनल सेल सतह या सिनैप्टिक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी से जुड़े हैं। नैदानिक सिंड्रोम जटिल हैं और संबंधित एंटीबॉडी के प्रकार के अनुसार भिन्न होते हैं। इन बीमारियों में से सबसे प्रसिद्ध एंटी-एन-मिथाइल डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर (एनएमडीएआर) एन्सेफलाइटिस है, जो गंभीर स्मृति और व्यवहार हानि से जुड़ा एक प्रमुख न्यूरोसाइकियाट्रिक विकार है। संबद्ध एंटीबॉडी एन-टर्मिनल डोमेन पर एनएमडीएआर के ग्लूएन 1 सबयूनिट के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। एई एंटीबॉडी की खोज और लक्षण वर्णन के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण में अलग, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति शामिल है। एंटीबॉडी लक्षण वर्णन की प्रक्रिया के दौरान, संस्कृति में जीवित न्यूरॉन्स रोगियों के सीरम या सीएसएफ के संपर्क में आते हैं, और प्रतिक्रियाशीलता का पता लगाने से संकेत मिलता है कि रोगी के सीरम या सीएसएफ नमूनों में न्यूरोनल सतह एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं। हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या रोगियों में एंटीबॉडी संभावित रूप से रोगजनक हैं, यह जांचकर कि क्या वे न्यूरॉन्स के संरचनात्मक या कार्यात्मक परिवर्तन का कारण बनते हैं। इन अध्ययनों की सफलता का स्तर संस्कृतियों की गुणवत्ता और रोगी के नमूनों की प्रतिक्रियाशीलता को प्राप्त करने और पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है। यह लेख रोगियों के सीरम या सीएसएफ में एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयुक्त भ्रूण चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता है। सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके एनएमडीएआर एंटीबॉडी के संभावित रोगजनक प्रभावों की जांच करने का एक उदाहरण भी प्रस्तुत किया गया है।
Introduction
ऑटोइम्यून एन्सेफलाइटिस (एई) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की बीमारियों की एक हाल ही में खोजी गई श्रेणी है जो एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता करती है जो न्यूरोनल सतह या सिनैप्टिक प्रोटीन 1,2 को लक्षित करती है। नैदानिक विशेषताएं एंटीबॉडी के अनुसार भिन्न होती हैं, लेकिन आमतौर पर बिगड़ा हुआ स्मृति और अनुभूति, परिवर्तित व्यवहार और मनोवैज्ञानिक लक्षण, असामान्य आंदोलनों, नींद की शिथिलता, चेतना के स्तर में कमी और दौरे शामिल होते हैं। ये विकार सभी उम्र के व्यक्तियों को प्रभावित कर सकते हैं, कुछ प्रकार के एई मुख्य रूप से बच्चों और युवा वयस्कों को प्रभावित करते हैं2.
पिछले 15 वर्षों में, विशिष्ट न्यूरोनल सतह / अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 17 एई सिंड्रोम का वर्णन किया गया है (तालिका 1)। न्यूरोनल लक्ष्यों के कुछ उदाहरणों में सिनैप्टिक उत्तेजक रिसेप्टर्स एनएमडीएआर 3,4 और एएमपीएआर5, सिनैप्टिक निरोधात्मक रिसेप्टर जीएबीएबीआर6, न्यूरोनल स्रावित प्रोटीन एलजीआई 17, और सेल आसंजन अणु इगलोन 5 8 शामिलहैं। इनमें से अधिकांश एई के लिए, अध्ययनों से पता चला है कि एंटीबॉडी अपने लक्ष्य एंटीजन की संरचना या कार्य को बाधित करते हैं, दृढ़ता से रोगजनक भूमिका का समर्थन करते हैं। उदाहरण के लिए, एंटी-एनएमडीएआर एन्सेफलाइटिस में, एंटीबॉडी एनएमडीएआर के ग्लूएन 1 सबयूनिट के एन-टर्मिनल डोमेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, इन रिसेप्टर्स के चयनात्मक और प्रतिवर्ती आंतरिककरण का उत्पादन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रमुख न्यूरोसाइकियाट्रिक परिवर्तन 4,9,10,11 होते हैं। इस प्रकार, एक रोगी के सीरम या सीएसएफ में 17 ज्ञात एंटीबॉडी में से किसी की पहचान का उपयोग नैदानिक परीक्षण के रूप में भी किया जा सकता है जो एक विशिष्ट एई के निदान को स्थापित करता है।
इन एंटीबॉडी की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए अधिक बार उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक में अलग, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृतियों का उपयोग शामिल है। ये संस्कृतियां कई कारणों से उपयोगी हैं: भ्रूण मस्तिष्क को अलग करना आसान है और इसमें ग्लियाल कोशिकाओं का निम्न स्तर होता है, जो न्यूरोनल संस्कृतियों में संदूषण का प्रमुख स्रोतहै 12; हिप्पोकैम्पस की कोशिका आबादी सीएनएस के अधिकांश अन्य क्षेत्रों की तुलना में अपेक्षाकृत सजातीय है, पिरामिड कोशिकाएं विशाल बहुमत13,14 का प्रतिनिधित्व करती हैं; संस्कृतियों को देर से चरण के भ्रूण से तैयार किया जाता है जब पिरामिड न्यूरॉन्स की पीढ़ी पूरी हो जाती है लेकिन ग्रेन्युल कोशिकाएं अभी तक विकसित नहीं हुई हैं, जिससे संस्कृति की एकरूपता में और वृद्धि हुई है; जब सुसंस्कृत, पिरामिड न्यूरॉन्स अपनी अधिकांश मुख्य फेनोटाइपिक विशेषताओं को व्यक्त करते हैं, अच्छी तरह से विकसित डेंड्राइट बनाने में सक्षम होते हैं, और सिनैप्टिक रूप से जुड़े नेटवर्क स्थापित करते हैं जिनका उपयोग संरचनात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच12,13 के लिए किया जा सकता है; चूंकि एंटीबॉडी जीवित न्यूरॉन्स में प्रवेश नहीं कर सकते हैं, इसलिए जीवित संस्कृतियों का उपयोग कोशिका की सतह पर रहने वाले एंटीजेनिक लक्ष्यों की पहचान करने की अनुमति देता है; और न्यूरोनल संस्कृतियों से एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स का इम्यूनोप्रेसिपिटेशन लक्ष्य एंटीजन 5 की पहचान के लिए अनुमति देताहै।
न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग करके अध्ययन की सफलता संस्कृतियों की गुणवत्ता और रोगी के सीरम या मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) की प्रतिरक्षात्मकता का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर अत्यधिक निर्भर है। संस्कृतियों को प्रभावित करने वाले चर में संस्कृति के विकास से पहले हिप्पोकैम्पस के अलगाव की प्रक्रियाएं, ऊतक का पृथक्करण, चढ़ाना घनत्व, उपयोग की जाने वाली विकास सतह और मीडिया 13,15,16 की संरचना शामिल है। यह लेख फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयुक्त भ्रूण चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसका उपयोग ज्ञात एई एंटीजन और संभावित उपन्यास सतह लक्ष्यों के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह जीसीएएमपी परिवार, जीसीएएमपी 5 जी से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) व्यक्त करने वाले सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग तकनीकों द्वारा एनएमडीएआर एंटीबॉडी के रोगजनक प्रभावों की जांच करने का एक उदाहरण भी प्रदान करता है।
| प्रोटीन को टारगेट करें | प्रोटीन फंक्शन | सेल डिब्बे | मेन सिंड्रोम |
| एनएमडीएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | एंटी-एनएमडीएआर इंसेफेलाइटिस |
| एएमपीएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
| ग्लूके 2 | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| जीएबीएएआर | आयन चैनल | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| गैबर | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
| एमग्लूआर1 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| एमग्लूआर 2 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| एमजीएलआर 5 | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| डी 2 आर | मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर | सिनैप्टिक प्रोटीन | बेसल गैन्ग्लिया एन्सेफलाइटिस |
| एलजीआई 1 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
| सीएएसपीआर 2 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
| इगलोन 5 | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | एंटी-इगलोन 5 रोग |
| न्यूरेक्सिन-3α | आसंजन अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| डीएनईआर (टीआर) | ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| एसईजेड 6 एल | ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
| एम्फीफिसिन | संरचनात्मक अणु | कोशिका की सतह प्रोटीन | लिम्बिक इंसेफेलाइटिस |
| डीपीपीएक्स | पेप्टिडेज़ | कोशिका की सतह प्रोटीन | मस्तिष्कशोथ |
तालिका 1: न्यूरोनल सेल सतह और सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी।
Protocol
प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग और देखभाल के बारे में यूरोपीय (2010/63 / यूई) नियमों के बाद बार्सिलोना विश्वविद्यालय की स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी। रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, और अध्ययन को मानव नमूनों (अस्पताल क्लिनिक, एचसीबी / 2018/0192) के उपयोग के लिए स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में तीन भाग हैं। पहला न्यूरोनल संस्कृतियों की स्थापना के लिए है, दूसरा न्यूरॉन्स की जीवित संस्कृतियों का उपयोग करके सतह एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए है, और तीसरा इन एंटीबॉडी की रोगजनकता निर्धारित करना है।
भाग 1: पृथक, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल संस्कृतियों की स्थापना
1. तैयारी कदम
- चढ़ाना सतहों के पॉली-एल-लाइसिन कोटिंग (विच्छेदन से 3 दिन पहले)
- 500 मिलीलीटर आसुत जल में 2.38 ग्राम बोरिक एसिड और 1.27 ग्राम बोरेक्स जोड़कर बोरेट बफर तैयार करें और भंग होने तक 15 मिनट के लिए सरगर्मी करें। एक हुड के तहत, फ़िल्टरिंग (0.2 μm ताकना आकार), लेबल, और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करके बफर समाधान को निष्फल करें।
नोट: यह समाधान स्थिर है और इसका उपयोग 6 महीने के लिए किया जा सकता है।
सावधानी: बोरेट बफर तैयार करते समय, अनुशंसित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। - आसुत जल के 10 मिलीलीटर में पीएलएल के 1 ग्राम जोड़कर और भंग होने तक सरगर्मी करके पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) स्टॉक समाधान (100 मिलीग्राम / पीएलएल स्टॉक समाधान के 500 μL विभाज्य तैयार करें। एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए, बोरेट बफर के 50 एमएल में पीएलएल विभाज्य के 500 μL जोड़ें और भंग होने तक घुमाएं, और फ़िल्टरिंग (0.2 μm ताकना आकार) द्वारा समाधान को निष्फल करें।
नोट: यह समाधान स्थिर है और इसका उपयोग 6 महीने के लिए किया जा सकता है। - कोटिंग के लिए सतहों को तैयार करें। अध्ययन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं और ग्लास-बॉटम व्यंजनों के लिए 12 मिमी व्यास कवरलिप्स का उपयोग करें जिसमें लाइव न्यूरॉन्स की इमेजिंग शामिल होगी। यदि कवरलिप्स का उपयोग कर रहे हैं, तो आटोक्लेव करें और फिर प्रत्येक डिश (3.5 सेमी व्यास) में पांच कवरलिप रखें।
नोट: कवरस्लिप की मोटाई अधिग्रहित छवियों के संकेत की गुणवत्ता और तीव्रता को प्रभावित करती है। अधिकांश माइक्रोस्कोप उद्देश्य # 1.5 कवरलिप्स के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इमेजिंग सेटअप और तकनीकों के अनुसार उपयुक्त कवरलिप्स चुनें। - एक हुड के तहत, प्रत्येक डिश (ग्लास-बॉटम डिश या पांच कवरलिप्स के साथ 3.5 सेमी डिश) में 1.5 एमएल पीएलएल समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि सभी कवरलिप्स जलमग्न हैं और 24 घंटे के लिए आरटी पर संग्रहीत हैं।
- विच्छेदन से 2 दिन पहले, पीएलएल समाधान की आकांक्षा करें और बाँझ एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी से धो लें, यह सुनिश्चित करें कि कवरलिप्स डूबे हुए हैं। व्यंजनों में पानी रखें और 24 घंटे के लिए आरटी पर स्टोर करें।
- विच्छेदन से 1 दिन पहले, पानी की आकांक्षा करें और इसे एनबी + बी 27 संस्कृति मीडिया (नीचे देखें) के साथ बदलें, और व्यंजनों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
- 500 मिलीलीटर आसुत जल में 2.38 ग्राम बोरिक एसिड और 1.27 ग्राम बोरेक्स जोड़कर बोरेट बफर तैयार करें और भंग होने तक 15 मिनट के लिए सरगर्मी करें। एक हुड के तहत, फ़िल्टरिंग (0.2 μm ताकना आकार), लेबल, और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करके बफर समाधान को निष्फल करें।
- संस्कृति मीडिया और स्टॉक समाधान की तैयारी (विच्छेदन से 1 दिन पहले)
- दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम): एल-ग्लूटामाइन और फिनोल लाल के बिना डीएमईएम उच्च ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल) के 500 मिलीलीटर तक, घोड़े के सीरम के 50 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल, एल-ग्लूटामाइन के 10 एमएल (200 एमएम), 10 एमएल सोडियम पाइरूवेट (100 एमएम), 10 एमएल पेनिसिलीन-स्ट्रेप्टोमिस (10 एमएल) जोड़ें फ़िल्टर (0.2 μm ताकना आकार) और एक कसकर बंद टोपी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल विभाज्य में स्टोर करें।
नोट: यह समाधान स्थिर है और इसका उपयोग 1 महीने के लिए किया जा सकता है। - बी 27 (एनबी + बी 27) के साथ पूरक न्यूरोबेसल (एनबी) माध्यम: फिनोल लाल के बिना एनबी माध्यम के 50 मिलीलीटर तक, बी 27 पूरक के 1 एमएल जोड़ें।
- बी 27 (हाइबरनेट + बी 27) के साथ पूरक हाइबरनेट-ई माध्यम: हाइबरनेट-ई माध्यम के 50 मिलीलीटर तक, बी 27 पूरक के 1 एमएल जोड़ें।
- बाह्य शारीरिक समाधान (ईपीएस): बाँझ पानी के 1 एल के लिए, निर्दिष्ट अंतिम सांद्रता में निम्नलिखित जोड़ें: एनएसीएल (140 एमएम), केसीएल (3.5 एमएम), एचईपीईएस (10 एमएम), ग्लूकोज (20 एमएम), और सीएसीएल2 (2 एमएम)। भंग होने तक हिलाओ और एनएओएच (0.5 एम) या एचसीएल (0.5 एम) जोड़कर पीएच को 7.4 में समायोजित करें। हुड के तहत, फ़िल्टरिंग (0.2 μm ताकना आकार) द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम): एल-ग्लूटामाइन और फिनोल लाल के बिना डीएमईएम उच्च ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल) के 500 मिलीलीटर तक, घोड़े के सीरम के 50 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल, एल-ग्लूटामाइन के 10 एमएल (200 एमएम), 10 एमएल सोडियम पाइरूवेट (100 एमएम), 10 एमएल पेनिसिलीन-स्ट्रेप्टोमिस (10 एमएल) जोड़ें फ़िल्टर (0.2 μm ताकना आकार) और एक कसकर बंद टोपी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल विभाज्य में स्टोर करें।
- उपकरण और अन्य प्रयोगशाला सामग्री (विच्छेदन का दिन)
- 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान सेट करें। निम्नलिखित विभाज्य को गर्म करें: एचबीएसएस के 50 एमएल, और डीएमईएम के 5 एमएल।
- निरपेक्ष इथेनॉल (चित्रा 1 बी) युक्त बीकर में विसर्जित करके निम्नलिखित उपकरण निष्फल करें: संदंश, घुमावदार संदंश, कैंची, ठीक घुमावदार संदंश, ठीक-सीधे संदंश, सर्जरी कैंची, ठीक कोण संदंश, और परिशुद्धता वसंत कैंची।
नोट: उपकरणों की रक्षा के लिए, बीकर के तल पर एक नरम सामग्री (जैसे, विज्ञान परिशुद्धता पोंछे) रखें। - बर्फ के साथ दो ट्रे भरें और निम्नलिखित वस्तुओं को रखें।
- आइस ट्रे 1 (चित्रा 1 सी): पूर्ण इथेनॉल के साथ बीकर में सर्जिकल टूल रखें, सर्जिकल टूल को धोने के लिए एचबीएसएस के साथ एक बीकर, भ्रूण को रखने के लिए एचबीएसएस के साथ 10 सेमी डिश, भ्रूण के सिर रखने के लिए एचबीएसएस के साथ 6 सेमी डिश, और भ्रूण के दिमाग को रखने के लिए हाइबरनेट + बी 27 के साथ 6 सेमी पकवान।
- आइस ट्रे 2: विच्छेदित हिप्पोकैम्पस के लिए ट्रिप्सिन 2.5% का 1 एमएल विभाज्य और हाइबरनेट + बी 27 के साथ 3.5 सेमी पकवान रखें।
नोट: इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय अन्वेषक के अनुभव और विच्छेदित किए जाने वाले भ्रूण की संख्या पर निर्भर करता है। इसलिए, बर्फ को आवश्यक समय के लिए जमे रहना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए पॉलीस्टाइनिन ट्रे की सिफारिश की जाती है।
2. विच्छेदन और बोने (चित्रा 1)
- हिप्पोकैम्पस अलगाव
नोट: E18 में भ्रूण के साथ गर्भवती चूहों तुरंत बार्सिलोना विश्वविद्यालय की स्थानीय नैतिकता समिति के अनुसार प्रोटोकॉल शुरू होने से पहले इच्छामृत्यु कर रहे हैं, प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग और देखभाल के बारे में यूरोपीय (2010/63/UE) नियमों का पालन। इस प्रोटोकॉल में, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) साँस लेना इच्छामृत्यु की विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया था।- संदंश और कैंची का उपयोग पेट पेरिटोनियम के स्तर पर चूहे विच्छेदन। ई 18 भ्रूण के साथ गर्भाशय निकालें और इसे 10 सेमी पकवान में रखें जिसे बर्फ पर ठंडा किया गया है।
नोट: भ्रूण से जुड़े चूहे के बाल से बचना महत्वपूर्ण है। पेट को निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल की प्रचुर मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इस कदम से, आइस ट्रे पर हुड के अंदर काम करें 1. - भ्रूण की थैली खोलें और भ्रूण को एचबीएसएस के साथ 10 सेमी पकवान में स्थानांतरित करें, जिससे भ्रूण पूरी तरह से डूबे हुए हों।
- कैंची के साथ भ्रूण के सिर को निकालें और इसे एचबीएसएस के साथ 6 सेमी पकवान में रखें। सभी भ्रूणों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: संदूषण से बचने के लिए, भ्रूण के सिर को छोड़कर सभी ऊतकों को एक स्क्रू कैप के साथ एक कंटेनर में त्याग दिया जाना चाहिए। - ठीक घुमावदार संदंश के साथ भ्रूण सिर पकड़ो और ठीक सीधे संदंश की एक जोड़ी के साथ कक्षाओं छेद, एक 45 ° कोण पर प्रवेश, और फिर ठीक घुमावदार संदंश जारी।
नोट: संदंश मस्तिष्क के माध्यम से जाना चाहिए, इसलिए प्रवेश करते समय कोण को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। - सर्जरी कैंची के साथ त्वचा और खोपड़ी को विच्छेदित करें, पश्चकपाल हड्डी से ललाट की हड्डी तक शुरू करें। ठीक घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ मस्तिष्क निकालें और इसे हाइबरनेट + बी 27 के साथ 6 सेमी पकवान में रखें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी दिमाग ठीक न हो जाएं।
- धनु रूप से ठीक-सीधे संदंश के साथ टेलेन्सेफेलॉन को अलग करें।
नोट: इस चरण से, हिप्पोकैम्पस का विच्छेदन एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है। व्यक्त लैंप का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है ताकि प्रकाश पक्षों से विच्छेदन सतह को रोशन करे। एक काली पृष्ठभूमि का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है क्योंकि यह अधिक विपरीत प्रदान करता है, जिससे हिप्पोकैम्पस को बेहतर ढंग से अलग किया जा सकता है। - 1 सेमी दूरी पर हाइबरनेट + बी 27 की बूंदें रखकर 10 सेमी पकवान तैयार करें (उदाहरण के लिए, एक सर्कल में)। हाइबरनेट + बी 27 की प्रति बूंद एक टेलेन्सेफेलॉन रखें और विदारक गुंजाइश के माध्यम से कल्पना करें (1.25x उद्देश्य आवर्धन की सिफारिश की जाती है)।
- ध्यान से मेनिन्जेस को छीलें और हिप्पोकैम्पस को बेहतर ढंग से कल्पना करने के लिए थैलेमस को हटा दें।
- सटीक वसंत कैंची के साथ हिप्पोकैम्पस को विच्छेदित करें और इसे बर्फ ट्रे 2 में हाइबरनेट + बी 27 के साथ 3.5 सेमी पकवान में रखें। सभी हिप्पोकैम्पी एकत्र होने तक प्रत्येक टेलेन्सेफेलॉन के लिए दोहराएं।
- ध्यान से एक पाश्चर विंदुक के साथ सभी हिप्पोकैम्पी इकट्ठा और उन्हें एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए हस्तांतरण।
नोट: हिप्पोकैम्पी इकट्ठा करते समय हाइबरनेट + बी 27 की न्यूनतम मात्रा लें ताकि ट्रिप्सिन को पतला न किया जा सके।
- संदंश और कैंची का उपयोग पेट पेरिटोनियम के स्तर पर चूहे विच्छेदन। ई 18 भ्रूण के साथ गर्भाशय निकालें और इसे 10 सेमी पकवान में रखें जिसे बर्फ पर ठंडा किया गया है।
- सेल पृथक्करण
- हिप्पोकैम्पस का एंजाइमी पृथक्करण
- हिप्पोकैम्पी युक्त 50 एमएल ट्यूब में, 2.5% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें और इसे एचबीएसएस के साथ 5 एमएल वॉल्यूम में लाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- ट्रिप्सिन को पतला करने के लिए, पूर्व-गर्म एचबीएसएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- हिप्पोकैम्पी को स्थानांतरित करें जो अब 1,000 μL माइक्रोपिपेट के साथ 50 एमएल ट्यूब में बलगम द्रव्यमान के रूप में दिखाई देता है, पूर्व-गर्म एचबीएसएस के 6 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- हिप्पोकैम्पस का यांत्रिक पृथक्करण
- शंक्वाकार तल के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए द्रव्यमान स्थानांतरण, न्यूनतम मात्रा ले रही है। पूर्व-गर्म डीएमईएम मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे आकांक्षा करके 1,000 μL माइक्रोपिपेट के साथ गोली को समरूप करें।
नोट: बुलबुले के रूप में आकांक्षा करते समय बुलबुले उत्पन्न करने से बचना महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को लाइज कर सकता है। - ट्यूब के शंक्वाकार तल के संपर्क में अपनी नोक के साथ, एक पूर्व खींचा ग्लास विंदुक (10x-20x) के साथ ऊपर और नीचे आकांक्षा दोहराएँ। बुलबुले पैदा करने से बचें। इस चरण के अंत में, मिश्रण पारदर्शी होना चाहिए।
- एक बार समरूप रूप से मिश्रित होने के बाद जैसे कि मिश्रण पारदर्शी है, मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर डीएमईएम मीडिया के 4 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ग्लास पिपेट के साथ समरूप करें।
- शंक्वाकार तल के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए द्रव्यमान स्थानांतरण, न्यूनतम मात्रा ले रही है। पूर्व-गर्म डीएमईएम मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे आकांक्षा करके 1,000 μL माइक्रोपिपेट के साथ गोली को समरूप करें।
- हिप्पोकैम्पस का एंजाइमी पृथक्करण
- सेल बोना
- कोशिकाओं की गिनती करें। समाधान में न्यूरॉन्स की संख्या मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार गिनी जा सकती है।
नोट: एंटीबॉडी का पता लगाने और कैल्शियम गतिविधि के लिए इमेजिंग प्रयोगों में, 3.5 सेमी पकवान प्रति 50,000 कोशिकाओं की एकाग्रता इष्टतम है। - कोशिकाओं को निलंबित रखते हुए, गणना की गई मात्रा को वापस लें, और पीएलएल-लेपित कवरलिप्स युक्त 3.5 सेमी व्यंजनों में या पीएलएल-लेपित ग्लास-बॉटम व्यंजनों में प्लेट करें।
- समान रूप से पार किए गए आंदोलनों (आगे और पीछे, फिर साइड टू साइड; आवश्यकतानुसार दोहराएं) में धीरे-धीरे मिलाते हुए व्यंजनों पर कोशिकाओं को वितरित करें और व्यंजनों को सीओ2 (5%) इनक्यूबेटर में रखें।
नोट: पकवान की परिधि में बसने वाली कोशिकाओं से बचने के लिए पार किए गए आंदोलनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। - हर हफ्ते, एनबी + बी 27 के लगभग 1 एमएल जोड़ें, ताकि संस्कृति सूख न जाए।
नोट: 2 सप्ताह ( इन विट्रो [डिव] में 14 दिन) के बाद, न्यूरॉन्स परिपक्व होते हैं और प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी कारकों को व्यक्त करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त न्यूरॉन्स की कुल औसत संख्या लगभग 2.5 x 106 न्यूरॉन्स प्रति गर्भवती चूहे प्रति 12 E18 भ्रूण की एक औसत से आ रहा है।
- कोशिकाओं की गिनती करें। समाधान में न्यूरॉन्स की संख्या मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार गिनी जा सकती है।
भाग 2: न्यूरोनल सेल सतह प्रोटीन में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग करना
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा दर्शाता है कि हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों का उपयोग एंटी-एनएमडीएआर एन्सेफलाइटिस वाले रोगियों के सीरम और / या सीएसएफ में एंटी-एनएमडीएआर एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए कैसे किया जाता है। फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग लाइव न्यूरॉन्स में प्रतिक्रियाशीलता की कल्पना करने के लिए किया जाता है, लेकिन अन्य विज़ुअलाइज़ेशन विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है। इस प्रयोग के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण एक स्वस्थ व्यक्ति से सीरम या सीएसएफ होगा। मानव नमूनों का उपयोग करते समय, ध्यान रखें कि संस्थागत नैतिक समिति से अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है।
3. लाइव फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग
- कवरलिप्स (पांच कवरलिप्स युक्त 3.5 सेमी डिश प्रति 50,000 कोशिकाओं) पर उगाए गए 14 डिव कोशिकाओं का उपयोग करें।
- हुड के अंदर, 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म एनबी के साथ कवरलिप्स कुल्ला।
- नमूना जोड़ें कि इस मामले में एंटी-एनएमडीएआर एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में उपयोग किया जाता है) सीरम के लिए 1:200 या सीएसएफ के लिए 1: 2 पर एनबी मीडिया में पतला होता है और 37 डिग्री सेल्सियस (सीओ 2 (5%) इनक्यूबेटर के अंदर) पर 1 घंटे सेते हैं।
- आरटी पर पीबीएस 3 एक्स के साथ सावधानी से कुल्ला।
- निर्धारण समाधान (पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड) जोड़ें और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
सावधानी: 4% फॉर्मलाडेहाइड को संभालते समय, हुड के अंदर काम करें और अनुशंसित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। - प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धो लें।
- 1:1000 कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी एंटी-ह्यूमन एएफ 488 जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
नोट: इनक्यूबेशन के दौरान, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश जोखिम से बचाएं। - प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धो लें। आसुत जल से कुल्ला
- एक तरल बढ़ते माध्यम के साथ कवरलिप्स माउंट करें (उदाहरण के लिए, डीएपीआई के साथ एंटीफेडिंग बढ़ते मीडिया; लगभग 7 μL), किसी भी शेष तरल की आकांक्षा करें और आसुत जल से कुल्ला करें। न्यूरॉन्स अब प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
सावधानी: बढ़ते माध्यम को संभालते समय, अनुशंसित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
भाग 3: कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबॉडी रोगजनक प्रभाव का प्रदर्शन
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा दर्शाता है कि यह निर्धारित करने के लिए कि रोगियों में एंटीबॉडी का संस्कृतियों पर कार्यात्मक प्रभाव पड़ता है, जो रोगजनकता का सुझाव देगा। प्रभावों के महत्व को बढ़ाने के लिए, आठ रोगियों से सीएसएफ के एक पूल का उपयोग किया गया था। जीईसीआई प्रतिदीप्ति कैल्शियम संकेतक (जीसीएएमपी 5 जी) का उपयोग करके रासायनिक उत्तेजना (एनएमडीए + ग्लाइसिन) पर जीवित संस्कृतियों की कैल्शियम गतिविधि दर्ज की गई थी। इन अध्ययनों के लिए एक सेल चैंबर के साथ एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है जो न्यूरॉन्स की आवश्यक शारीरिक स्थितियों को बनाए रख सकती है।
4. कैल्शियम इमेजिंग
- कवरलिप्स पर उगाए गए 14-18 डिव कोशिकाओं का उपयोग करें (पांच कवरलिप्स के साथ 3.5 सेमी पकवान प्रति 50,000 कोशिकाएं)
- इमेजिंग से 1 सप्ताह पहले, कोशिकाओं में 2.5 x10 10 जीसी / एमएल पर वायरल वेक्टर पीएएवी 2-सीएजी-जीसीएएमपी 5 जी जोड़ें और 5-7 दिनों के लिए सेते हैं।
नोट: यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व-पैक एएवी सीरोटाइप 2 वेक्टर सीएजी प्रमोटर के तहत आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक जीसीएएमपी 5 जी को ओवर-एक्सप्रेस करता है। - इमेजिंग से 1 दिन पहले, रोगी के नमूने को जोड़ें (इस उदाहरण में, एनबी + बी 27 में सीएसएफ पतला 1:25 का एक पूल) और 24 घंटे के लिए सेते हैं। संदूषण से बचने के लिए उपयोग करने से पहले हमेशा मानव नमूने (0.2 μm ताकना आकार) छानना।
नोट: इन अध्ययनों के लिए, स्वस्थ विषयों से नियंत्रण सीएसएफ समानांतर में चलाने की जरूरत है। - इमेजिंग के दिन, इमेजिंग सेटअप तैयार करें और माइक्रोस्कोप सेल चैंबर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, आसुत जल के साथ लेन भरें, और सेल शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए 5% सीओ2 के साथ संक्रमित करें।
- हुड में, ईपीएस के 3 एमएल के साथ चरण 3 से कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें
- ईपीएस के 2.45 एमएल के साथ कोशिकाओं को कवर करें और उन्हें माइक्रोस्कोप सेल कक्ष में स्थानांतरित करें। एनएमडीए रिसेप्टर प्रतिक्रिया की विशेष रूप से कल्पना करने के लिए एएमपीए और केए रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करने के लिए एनबीक्यूएक्स (10 μM) जोड़ें।
- एक पारा दीपक और एक एफआईटीसी फिल्टर घन से लैस उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में, हर 100 एमएस (सहज गतिविधि) दर्ज किए गए फ्रेम के साथ 2 मिनट की फिल्म प्राप्त करें।
नोट: एक 20x NA 0.75 वायु उद्देश्य का उपयोग किया गया था, और छवियों (512 x 512 पिक्सेल, 16-बिट ग्रेस्केल) को एससीएमओएस कैमरे के साथ हर 100 एमएस लिया गया था। - हर 100 एमएस दर्ज फ्रेम के साथ 4 मिनट की दूसरी फिल्म प्राप्त करें। अधिग्रहण शुरू करने के कुछ ही समय बाद, पकवान में उत्तेजना समाधान (एनएमडीए [100 μM] + ग्लाइसिन [1 μM]) जोड़ें।
नोट: पकवान में मीडिया के अलावा अशांति उत्पन्न होगी जो इमेजिंग स्थितियों (फोकस, प्रतिदीप्ति तीव्रता, और / या अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत) को बाधित कर सकती है। इस तरह के परिवर्तनों की संभावना को कम करने के लिए भरे हुए 2.5 एमएल डिश में 50 μL से अधिक समाधान न जोड़ें। - छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना (इमेजजे का उपयोग यहां किया गया था), रोगी और नियंत्रण सीएसएफ नमूनों के साथ ऊष्मायन संस्कृतियों से उत्तेजना पर प्राप्त समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत निकालें।
नोट: जीसीएएमपी जांच, जब मुक्त कैल्शियम आयनों के लिए बाध्यकारी, एक विरूपण परिवर्तन से गुजरती है जिससे वे उज्ज्वल हो जाते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि न्यूरोनल विध्रुवण के कारण कैल्शियम प्रवाह के साथ सहसंबंधित है। - विश्लेषण करने के लिए ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का निर्धारण करें। मैन्युअल रूप से न्यूरॉन्स के सोमस को खंडित करें और आरओआई प्रबंधक में आरओआई जोड़ें (आरओआई प्रबंधक > जोड़ें > > उपकरणों का विश्लेषण करें)। आरओआई प्रबंधक मेनू से आरओआई सहेजें (अधिक > सहेजें)।
- माप सेट करें (माप सेट > विश्लेषण करें) और माध्य ग्रे मान का चयन करें। अधिक > मल्टी माप पर क्लिक करके सेल सोमास से मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल निकालें, और फिर .xls स्प्रेडशीट के रूप में उत्पन्न तालिका को सहेजें।
- समूहों (रोगियों के सीएसएफ बनाम नियंत्रण के सीएसएफ) के बीच प्रतिदीप्ति की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
Representative Results
पृथक, भ्रूण, कृंतक हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल संस्कृतियों की स्थापना
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बैंकर और गोस्लिन15 द्वारा किए गए तंत्रिका कोशिका संवर्धन पर प्रभावशाली अध्ययनों पर आधारित है। प्रोटोकॉल को न्यूरोनल सतह एंटीबॉडी का पता लगाने के अध्ययन के लिए इष्टतम आकृति विज्ञान, घनत्व और शुद्धता के साथ न्यूरोनल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए परिष्कृत किया गया है। विच्छेदन और बोने के प्रोटोकॉल को तीन भागों (चित्रा 1 ए) में विभाजित किया गया है। पहला भाग, हिप्पोकैम्पस अलगाव, जीवित ऊतक (चित्रा 1 ए, बाएं पैनल) के सर्जिकल निष्कर्षण के होते हैं। जैसा कि आंकड़े से संकेत मिलता है, ई 18 भ्रूण के साथ गर्भवती विस्टार चूहे एक सफल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण प्रारंभिक सामग्री हैं। एक बार मस्तिष्क को ई 18 भ्रूण से निकालने के बाद, माइक्रोसर्जरी एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत की जाती है। उपयुक्त उपकरण (चित्रा 1 बी) और सटीक हैंडलिंग के साथ, हिप्पोकैम्पस को तंत्रिका ऊतक के बाकी हिस्सों से अलग करना संभव है। विशिष्ट मीडिया में ऊतकों के स्वभाव को चित्रा 1 सी में दर्शाया गया है। प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में हिप्पोकैम्पस सेल पृथक्करण होता है। इसे दो चरणों (चित्रा 1 ए, मध्य पैनल) में विभाजित किया गया है: हिप्पोकैम्पस के एंजाइमी पृथक्करण और यांत्रिक पृथक्करण, जिसके परिणामस्वरूप बरकरार, पृथक, एकल कोशिकाएं होती हैं। इस पद्धति का उपयोग करके, सेल समुच्चय के बिना सेल संस्कृतियों को प्राप्त करना संभव है, जैसा कि चित्रा 2 ए-डी में दर्शाया गया है। प्रोटोकॉल के तीसरे भाग में सेल सीडिंग (चित्रा 1 ए, सही पैनल) शामिल हैं। प्लेट में न्यूरोनल संस्कृति के घनत्व और एकरूपता को समायोजित करने के लिए प्रोटोकॉल का यह हिस्सा महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं की गिनती और एक 3.5 सेमी पकवान के एक क्षेत्र में 50,000 न्यूरॉन्स बोने न केवल न्यूरोनल सेल सतह प्रोटीन (चित्रा 3) के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए प्रयोगों को पूरा करने के लिए एक इष्टतम घनत्व प्रदान करता है, लेकिन यह भी कैल्शियम इमेजिंग (चित्रा 4) के साथ इन एंटीबॉडी की रोगजनकता का विश्लेषण करने के लिए।
चित्रा 1: हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों के लिए दृश्य प्रोटोकॉल। (ए) ई 18 में भ्रूण चूहों से हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की अलग-अलग सेल संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल के तीन हिस्सों को दिखाने वाले फ्लोचार्ट। प्रोटोकॉल को 1 में विभाजित किया गया है। हिप्पोकैम्पस अलगाव, 2. सेल पृथक्करण, और 3. सेल बोना। (बी) हिप्पोकैम्पस अलगाव के लिए अनुशंसित उपकरणों का चयन तीन श्रेणियों में वर्गीकृत: (1- संदंश, 2- घुमावदार संदंश, 3- कैंची) भ्रूण संग्रह के लिए, (4- ठीक घुमावदार संदंश, 5- ठीक सीधे संदंश, 6- सर्जरी कैंची) मस्तिष्क निष्कर्षण के लिए, और (7- ठीक कोण संदंश, 8- परिशुद्धता वसंत कैंची) हिप्पोकैम्पस अलगाव के लिए। (सी) हिप्पोकैम्पस अलगाव के लिए आवश्यक प्लेटों और मीडिया के साथ बर्फ ट्रे 1 का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। भ्रूण और सिर को एचबीएसएस में रखा जाता है, जबकि दिमाग को हाइबरनेट माध्यम + बी 27 में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
18 डिव पर हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृतियां परिपक्व, परस्पर जुड़ी हुई हैं, और संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन व्यक्त करती हैं
न्यूरोनल संस्कृतियों के विकास और परिपक्वता में, दो विभेदित चरणों की सराहना की जा सकती है: न्यूरॉन (चित्रा 2 ए, बी) का ध्रुवीकरण चरण और सिनैप्टिक नेटवर्क (चित्रा 2 सी, डी) के डेंड्राइटिक विकास और निर्माण का चरण। 1 डिव पर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाता है और प्लेट का पालन किया जाता है, सेल शरीर के चारों ओर एक लैमेला विकसित करना मामूली न्यूराइट्स का विस्तार करना शुरू कर देता है (चित्रा 2 ए)। संस्कृति में कुछ दिनों के बाद, न्यूराइट्स थोड़ी दूरी का विस्तार करते हैं। कोशिकाएं एक महत्वपूर्ण ध्रुवीकरण दिखाती हैं, लेकिन थोड़ा शुद्ध विकास (चित्रा 2 बी) है। इस चरण के बाद, सिनैप्टोजेनेसिस प्रमुख है, और न्यूरॉन्स इंटरकनेक्ट करना शुरू कर देते हैं। न्यूरोनल नेटवर्क बढ़ता रहता है और अधिक जटिल हो जाता है (चित्रा 2 सी)। 18 डिव पर, न्यूरॉन्स परिपक्व और परस्पर जुड़े हुए हैं; न्यूरोनल नेटवर्क बनाया गया है (चित्रा 2 डी)। एक बार जब सिनैप्टिक स्पाइन बन जाते हैं और जुड़े होते हैं, तो न्यूरॉन्स पूरी तरह से ध्रुवीकृत होते हैं और सभी कार्यात्मक और संरचनात्मक प्रोटीन व्यक्त करते हैं। परिपक्व सुसंस्कृत न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त कई प्रोटीनों में से, न्यूरोनल रिसेप्टर एनएमडीए (चित्रा 2 ई) और सिनैप्टिक प्रोटीन पीएसडी 95 (चित्रा 2 एफ) को प्रतिनिधि मार्करों के रूप में यहां चुना गया है। इसके अलावा, न्यूरोफिलामेंट (एनएफ) (चित्रा 2 जी) लेबलिंग और एमएपी 2 प्रोटीन (चित्रा 2 एच) को लक्षित करके डेंड्राइट्स की कल्पना करके चुनिंदा रूप से अक्षतंतु की कल्पना करना संभव है।
चित्रा 2: हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की पृथक-कोशिका संस्कृतियों की परिपक्वता का समय पाठ्यक्रम (ए-डी) संस्कृति के पहले 18 दिनों के दौरान हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की चरण-विपरीत छवियां। (ए) पीएलएल-लेपित सब्सट्रेट से लगाव पर 1 डिव पर न्यूरॉन्स। (बी) 5 डिव पर न्यूरॉन्स में छोटे न्यूराइट्स का उद्भव 11 डिव पर न्यूरॉन्स ने लंबे न्यूराइट्स विकसित किए हैं जो एक्सोनल विशेषताओं को बढ़ाते हैं और प्राप्त करते हैं। (डी) 18 डिव पर न्यूरॉन्स परिपक्व हैं और एक तंत्रिका नेटवर्क का गठन किया है। स्केल बार (ए-डी) = 40 μm(ई-एच) 18 डिव पर परिपक्व न्यूरॉन्स दिखाने के लिए चयनात्मक मार्करों का उपयोग करके कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा ली गई प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां। न्यूरोनल संस्कृतियों को एंटीबॉडी के साथ तय और इम्यूनोस्टेन किया गया था जो चुनिंदा रूप से (ई) न्यूरोनल रिसेप्टर (एनएमडीएआर), (एफ) सिनैप्टिक मार्कर (पीएसडी 95), (जी) एक्सोनल मार्कर (न्यूरोफिलामेंट, एनएफ), और (एच) डेंड्राइटिक मार्कर (एमएपी 2) के लिए दाग देते हैं। स्केल बार (ई-एच) = 20 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
रोगी के नमूनों में एंटीबॉडी न्यूरोनल सेल सतह एंटीजन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं
एंटी-एनएमडीएआर एन्सेफलाइटिस वाले रोगियों से प्राप्त नमूनों (सीरम और सीएसएफ) में ऑटोएंटिबॉडी होते हैं जो न्यूरॉन्स की सतह पर मौजूद एनएमडीएआर को पहचानते हैं। रोगी के नमूनों के साथ संस्कृतियों का इनक्यूबेशन सेल सतह और डेंड्राइट्स (चित्रा 3 ए, सी) पर एक तीव्र प्रतिदीप्ति संकेत पैदा करता है। इसके विपरीत, नियंत्रण नमूने न्यूरोनल संस्कृतियों (चित्रा 3 बी, डी) को प्रशासित होने पर कोई प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न नहीं करते हैं। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि एंटीबॉडी के लिए रोगी के नमूनों की जांच के लिए संस्कृतियों का उपयोग कैसे किया जा सकता है और न्यूरोनल सेल सतह को लक्षित करने वाले उपन्यास एंटीबॉडी की पहचान कर सकता है।
रोगी से सीएसएफ नमूना हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के एनएमडीए-प्रेरित संस्कृतियों में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता को कम करता है
तंत्रिका गतिविधि (24 घंटे के उपचार के बाद) पर रोगियों के एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम ट्रांजिएंट्स को एनएमडीए-मध्यस्थता उत्तेजना पर वास्तविक समय में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स से ऑप्टिकल रूप से निगरानी की गई थी। एनएमडीए का आवेदन प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि उत्पन्न करता है, जैसा कि इंट्रासेल्युलर ग्रीन फ्लोरेसेंस (चित्रा 4 ए और पूरक वीडियो 1) में बदलाव से संकेत मिलता है। नियंत्रण सीएसएफ नमूने के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन्स ने प्रतिदीप्ति तीव्रता (56%) में उच्च अंतर दिखाया जब उत्तेजक रोगी सीएसएफ नमूने के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की तुलना में लागू किया गया था। प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर मापा गया था, और कोशिकाओं के सोमा से निकाले गए डेटा से एनएमडीए-मध्यस्थता उत्तेजना घटता की तुलना की गई थी (चित्रा 4 बी, सी)। उत्तेजना घटता से पता चलता है कि दोनों परिदृश्यों में कैल्शियम का एक इंट्रासेल्युलर प्रवाह था, लेकिन रोगियों के सीएसएफ (ग्रे लाइन) के साथ इलाज की गई संस्कृतियों ने नियंत्रण-उपचारित संस्कृतियों (काली रेखा) की तुलना में कम प्रतिक्रिया दिखाई। इन परिणामों से पता चलता है कि रोगियों के सीएसएफ में मौजूद एंटीबॉडी एनएमडीएआर के साथ एंटीबॉडी की बातचीत के कारण सेलुलर गतिविधि को कम करते हैं, और इस प्रकार रोगजनक प्रभाव का कारण बनते हैं।
(ए, ई) एंटी-एनएमडीएआर एन्सेफलाइटिस वाले रोगियों से सीरम और सीएसएफ जीवित चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स, (बी, एफ) की कोशिका सतह के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, जबकि नियंत्रण विषयों से सीरम और सीएसएफ कोई प्रतिक्रियाशीलता नहीं दिखाते हैं। स्केल बार (ए, बी, ई, एफ) = 20 μm। एक डेंड्राइट (63x) की उच्च आवर्धन छवि (सी, जी) रोगी के सीरम और सीएसएफ के लिए प्रतिक्रियाशीलता के विशिष्ट सतह पैटर्न को दिखाती है और (डी, एच) नियंत्रण के लिए नकारात्मक है। छवियों को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा लिया गया था। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: रोगी एंटीबॉडी जीसीएएमपी 5 जी व्यक्त करने वाले चूहे न्यूरॉन्स में कैल्शियम की आमद को कम करते हैं। (ए) न्यूरॉन्स की संस्कृतियों में उत्तेजना समाधान (एनएमडीए [100 μM] + ग्लाइसिन [1 μM]) के प्रशासन ने कैल्शियम प्रवाह को ट्रिगर किया, जैसा कि उत्तेजना (पूर्व-उत्तेजना) से पहले ली गई छवि की तुलना में इंट्रासेल्युलर ग्रीन फ्लोरेसेंस (उत्तेजना शिखर) को बढ़ाकर इंगित किया गया है। 120 एस के बाद, प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती है और स्थिर हो जाती है (उत्तेजना के बाद)। रोगियों के सीएसएफ के साथ इलाज की गई संस्कृतियों ने नियंत्रण के सीएसएफ की तुलना में एनएमडीए-मध्यस्थता कैल्शियम वृद्धि में महत्वपूर्ण कमी (56%) दिखाई। छवियों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लिया गया था। स्केल बार = 20 μm। (बी) एनएमडीए उत्तेजना (नीले तीर) पर नियंत्रण के सीएसएफ (काली रेखा) और रोगियों के सीएसएफ (ग्रे लाइन) के साथ इलाज की गई संस्कृतियों के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता (180 एस) का प्रतिनिधित्व करने वाले तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से एक का एक भूखंड। एन (नियंत्रण ' सीएसएफ) = 20 कोशिकाएं; एन (रोगियों का सीएसएफ) = 28 कोशिकाएं। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है( सी) बॉक्स प्लॉट माध्यिका, 25 वें और 75 वें प्रतिशतक दिखाते हैं। मूंछें न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों को इंगित करती हैं। महत्व का आकलन विचरण के दो-तरफा विश्लेषण (एनोवा; पी < 0.0001) और मान-व्हिटनी यू परीक्षण (पी < 0.0001) द्वारा किया गया था। 0.05 < पी का मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 1: जीसीएएमपी 5 जी को कंधे से कंधा मिलाकर व्यक्त करने वाले दो हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स दिखाने वाले वीडियो: नियंत्रण के सीएसएफ (बाएं) बनाम न्यूरॉन के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन का इलाज रोगियों के सीएसएफ (दाएं) के साथ किया जाता है। एनएमडीएआर (उत्तेजना) का आवेदन दोनों मामलों में इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि उत्पन्न करता है, लेकिन रोगियों के सीएसएफ के साथ इलाज किए गए एक पर नियंत्रण के सीएसएफ के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन में काफी उच्च स्तर के साथ। छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लिया गया था और लुकअप टेबल (एलयूटी) फायर को लागू करने वाले इमेजजे के साथ संपादित किया गया था। 1700 फ्रेम (170 एस); 5 बार त्वरित। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
एंटीबॉडी-मध्यस्थता ऑटोइम्यूनिटी के बढ़ते क्षेत्र ने न्यूरोनल ऑटोएंटिबॉडी की पहचान के लिए अवसर की एक खिड़की खोल दी है जिसका उपयोग रोगियों के निदान और उपचार में सुधार के लिए किया जा सकता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृतियां एंटीबॉडी पहचान के लिए एक आवश्यक उपकरण हैं; इसलिए, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल करना महत्वपूर्ण है। विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम, सीमाएं और समस्या निवारण, यहां चर्चा की गई है।
इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों को तीन श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है कि क्या वे शुद्धता, एकरूपता, या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं।
शुद्धता - इष्टतम प्राथमिक सेल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, अन्वेषक को आत्मविश्वास, प्रशिक्षित और जल्दी से काम करने में सक्षम होना चाहिए, खासकर विच्छेदन के समय को कम करने के लिए। यहां तक कि अगर पिरामिड न्यूरॉन्स प्रमुख कोशिका प्रकार हैं, तो हिप्पोकैम्पस में विभिन्न प्रकार के इंटरन्यूरॉन्स14 होते हैं। न्यूनतम ग्लियाल कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए, हिप्पोकैम्पस को न्यूनतम आसपास के ऊतकों के साथ निकाला जाना चाहिए। विच्छेदन के दौरान एक काली पृष्ठभूमि का उपयोग स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत हिप्पोकैम्पस की सीमाओं की पहचान करने में मदद करता है। इसके अलावा, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कम सेल घनत्व के परिणामस्वरूप कम पैराक्राइन समर्थन होता है और संस्कृति को बनाए रखना अधिक कठिन हो जाता है13. इसलिए इस संतुलन को ध्यान में रखना जरूरी है। यह इमेजिंग अध्ययनों में महत्वपूर्ण है जो कोशिकाओं की कम संख्या (50,000 न्यूरॉन्स प्रति 3.5 सेमी डिश) का उपयोग करते हैं। हिप्पोकैम्पस निष्कर्षण के लिए अतिरिक्त समय होने में सक्षम होने के लिए, ऊतक को संरक्षित करने वाले हाइबरनेट मीडिया का उपयोग किया जाना चाहिए17. पर्याप्त सर्जिकल उपकरणों के साथ काम करना भी आवश्यक है। उच्च परिशुद्धता उपकरण नाजुक हैं, इसलिए तकनीक की प्रजनन क्षमता को सावधानीपूर्वक संरक्षित करके सुनिश्चित किया जाना चाहिए।
समरूपता - सेल समुच्चय के बिना एक संस्कृति विकसित करने के लिए, यांत्रिक सेल पृथक्करण एक मानक 1,000 μL विंदुक के साथ एक पूर्व खींचा ग्लास पिपेट के उपयोग के संयोजन से उन्नत किया गया है।
व्यवहार्यता - इस प्रोटोकॉल में, कोई एंटीबायोटिक्स नहीं जोड़ा गया था क्योंकि वे न्यूरोनल उत्तेजना को प्रभावित करते हैं और सुसंस्कृत न्यूरॉन्स18 के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को बदलते हैं। इसलिए, संदूषण बहुत संभावना है यदि बाँझपन के उच्चतम मानकों को बनाए नहीं रखा जाता है। तापमान भी एक महत्वपूर्ण कारक है। हिप्पोकैम्पस अलगाव के दौरान ऊतक को ठंडा रखने से चयापचय धीमा हो जाता है और कोशिका क्षरण कम हो जाता है। इसलिए, ऊतक को कोशिका पृथक्करण प्रक्रिया तक बर्फ पर रखा गया था। इसके अलावा, एंजाइमी सेल पृथक्करण के दौरान सही संतुलन खोजना महत्वपूर्ण है जो चिह्नित सेल लिसिस के बिना कोशिकाओं को अलग करता है। इस प्रोटोकॉल में, ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेशन के समय और बाद में धोने के चरणों को एक उपयुक्त न्यूरोनल नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त स्थान के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
न्यूरोनल संस्कृतियों से फ्लोरोसेंट लाइव इम्यूनोस्टेनिंग और कैल्शियम गतिविधि रिकॉर्डिंग में महत्वपूर्ण कदम भी पाए जाते हैं। रोगी के नमूनों में सेल सतह प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए सफल लाइव इम्यूनोस्टेनिंग करने के लिए, किसी को कोशिकाओं के पारगम्यीकरण से बचना चाहिए जो एंटीबॉडी को इंट्रासेल्युलर प्रोटीन तक पहुंचने की अनुमति देगा। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी के टिटर के आधार पर, इनक्यूबेशन समय और नमूना कमजोर पड़ने को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, बहुत उच्च टिटर एंटीबॉडी पृष्ठभूमि धुंधला दे सकते हैं जो परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल बनाता है)। कैल्शियम इमेजिंग के साथ ऑटोएंटिबॉडी के रोगजनकता मूल्यांकन को पूरा करते समय, किसी को एक मीडिया का उपयोग करने की आवश्यकता होती है जो सेलुलर गतिविधि माप के लिए इष्टतम है (उदाहरण के लिए, संस्कृति माध्यम में एमजी2 + दमन अच्छे प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है)। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, पीएच संकेतक जैसे फिनोल लाल के साथ मीडिया से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह एक गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत का परिचय देता है।
हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल संस्कृतियों के उपयोग की दो मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, स्थिर सेल लाइनों की तुलना में, प्राथमिक संस्कृतियों को लगातार उत्पन्न किया जाना चाहिए, और इसका तात्पर्य नियमित रूप से प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग से है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) लाइनें पशु मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता को प्रतिस्थापित कर सकती हैं, लेकिन आईपीएससी के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल अभी भी इष्टतम नहीं हैं। दूसरे, आईपीएससी से प्राप्त न्यूरॉन्स सतह प्रोटीन के पूर्ण स्पेक्ट्रा को व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए, यदि उपयोग किया जाता है, तो प्रतिक्रियाशीलता की अनुपस्थिति आवश्यक रूप से नमूना19 की नकारात्मकता का संकेत नहीं देती है।
एई होने के संदेह वाले रोगियों के सीरम या सीएसएफ में ऑटोएंटिबॉडी की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के तीन तरीके हैं: चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करके ऊतक-आधारित परख (टीबीए), न्यूरोनल प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एचईके कोशिकाओं का उपयोग करके सेल-आधारित परख (सीबीए), और हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स19 की लाइव संस्कृतियों का उपयोग करके यहां रिपोर्ट किया गया आवेदन। सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन विधि का महत्व सतह और इंट्रासेल्युलर एंटीजन के साथ प्रतिक्रियाशीलता को अलग करने की क्षमता में निहित है जिसे टीबीए द्वारा आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियां, एचईके ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में सीबीए के विपरीत, ट्रांसफेक्टेड प्रोटीन के प्रदर्शनों की सूची तक सीमित नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग उपन्यास एंटीबॉडी और उनके लक्ष्य एंटीजन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जब इम्यूनोप्रेसिपिटेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त किया जाता है और इसलिए, पहचानने योग्य एंटीबॉडी के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाता है। अंत में, यह लाइव इमेजिंग विधियों द्वारा ऑटोएंटिबॉडी के रोगजनक प्रभावों के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो सेलुलर गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं। अंत में, नए ऑटोएंटिबॉडी की पहचान अंततः रोगी के परिणामों में सुधार करने के लिए विशिष्ट इम्यूनोथेरेपी की दीक्षा को सक्षम बनाती है।
Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम मर्चे रिवास, मारिया मार्सल, गुस्तावो कास्त्रो, जॉर्डी कोर्टेस, अलीना हिर्शमैन और एंजेल सैंडोवल (आईसीएफओ-इंस्टीट्यूट डी सिएन्सीज़ फोटोनिक्स) और मर्सिडीज अल्बा, मारिजा राडोसेविक, डेविड सोटो, जेवियर गसुल, मार गुआस्प और लिडिया सबेटर (आईडीआईबीपीएस, अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। अस्पताल क्लिनिक, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) पांडुलिपि और सलाह की उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए। इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो डी सालुद कार्लोस III (आईएससीआईआईआई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और यूरोपीय संघ, एफआईएस (पीआई 20/00280, जेपी), फंडासियो सेलेक्स (पीएल-ए) द्वारा सह-वित्त पोषित किया गया था; मंत्री डी इकोनोमिया वाई कॉम्पिटिटिविडेड - आर एंड डी में उत्कृष्टता केंद्रों के लिए सेवेरो ओचोआ कार्यक्रम (सीईएक्स 2019-000910-एस, पीएल-ए); सीईआरसीए कार्यक्रम और लेजरलैब-यूरोप (871124, पी.एल.-ए.); मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया और इनोवासियोन (एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033, पीएल-ए); और फोंडो सोशल यूरोपो (पीआरई 2020-095721, एमसी)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
