Summary
自己免疫性脳炎は、中枢神経系の抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーです。海馬ニューロンは、これらの抗体を発見し、特徴付けるために使用することができる。この記事では、患者の血清および脳脊髄液中の自己抗体を決定するための初代細胞培養および免疫染色のプロトコルを提供します。
Abstract
過去15年間で、中枢神経系(CNS)の抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーが特徴付けられ、現在は「自己免疫性脳炎」(AE)として定義されています。現在17の既知のAE症候群があり、すべてが神経細胞表面またはシナプスタンパク質に対する抗体に関連しています。臨床症候群は複雑であり、関連する抗体の種類によって異なります。これらの疾患の中で最もよく知られているのは、重度の記憶障害および行動障害に関連する顕著な神経精神障害である抗N-メチルD-アスパラギン酸受容体(NMDAR)脳炎です。会合抗体は、N末端ドメインでNMDARのGluN1サブユニットと反応します。AE抗体の発見と特性評価に最も頻繁に使用されるアプローチには、解離した胎児のげっ歯類の海馬ニューロンの培養が含まれます。抗体の特性評価の過程で、培養中の生きたニューロンが患者の血清またはCSFに曝露され、反応性の検出は、患者の血清またはCSFサンプルにニューロン表面抗原に対する抗体が含まれていることを示します。海馬培養物は、患者の抗体がニューロンの構造的または機能的変化を引き起こすかどうかを調べることによって、潜在的に病原性であるかどうかを判断するためにも使用できます。これらの研究の成功のレベルは、培養の質と、患者サンプルの反応性を取得および検出するために使用されるプロトコルによって異なります。この記事では、ラットの胎児海馬ニューロンの初代細胞培養と免疫染色を組み合わせて、患者の血清またはCSF中の抗体の存在を決定するための最適化されたプロトコルを提供します。培養ニューロンとカルシウムイメージングを使用してNMDAR抗体の潜在的な病原性効果を調べる方法の例も提示されます。
Introduction
自己免疫性脳炎(AE)は、ニューロン表面またはシナプスタンパク質を標的とする抗体によって媒介される中枢神経系(CNS)の疾患の最近発見されたカテゴリーである1,2。臨床的特徴は抗体によって異なりますが、一般的には記憶障害と認知障害、行動の変化と精神症状、異常な動き、睡眠機能障害、意識レベルの低下、発作が含まれます。これらの障害はすべての年齢の個人に影響を与える可能性があり、一部のタイプのAEは主に子供と若年成人に影響を及ぼします2。
過去15年間で、特定の神経表面/シナプスタンパク質に対する抗体を有する17のAE症候群が記載されている(表1)。ニューロン標的のいくつかの例には、シナプス興奮性受容体NMDAR 3,4およびAMPAR5、シナプス抑制受容体GABAbR6、ニューロン分泌タンパク質LGI17、および細胞接着分子IgLON58が含まれる。これらのAEのほとんどについて、抗体が標的抗原の構造または機能を破壊し、病原性の役割を強く支持することが研究によって示されています。例えば、抗NMDAR脳炎では、抗体はNMDARのGluN1サブユニットのN末端ドメインと反応し、これらの受容体の選択的かつ可逆的なインターナリゼーションを引き起こし、顕著な神経精神医学的変化をもたらす4,9,10,11。したがって、患者の血清またはCSF中の17の既知の抗体のいずれかの同定は、特定のAEの診断を確立する診断テストとしても使用できます。
これらの抗体の同定および特性評価のためにより頻繁に使用される技術の1つは、解離した、胎児、げっ歯類の海馬ニューロンの培養物の使用を含む。これらの培養はいくつかの理由で有用です:胚性脳は解離しやすく、神経培養における汚染の主な原因である低レベルのグリア細胞を含んでいます12;海馬の細胞集団は、CNSの他のほとんどの領域と比較して比較的均質であり、錐体細胞が大多数を占めています13,14。培養物は、錐体ニューロンの生成が完了したが顆粒細胞がまだ発達していない後期胚から調製され、培養の均質性をさらに高めます。培養すると、錐体ニューロンは主要な表現型の特徴のほとんどを発現し、よく発達した樹状突起を形成し、構造的および電気生理学的研究に使用できるシナプス的に接続されたネットワークを確立することができます12,13。抗体は生きたニューロンに浸透できないため、生きた培養物を使用すると、細胞表面に存在する抗原標的を同定することができます。神経細胞培養物からの抗体-抗原複合体の免疫沈降により、標的抗原5の同定が可能になります。
神経培養を用いた研究の成功は、培養物の質と、患者の血清または脳脊髄液(CSF)の免疫反応性を評価するために使用されるプロトコルに大きく依存します。培養物に影響を及ぼし得る変数には、培養開発前の海馬の単離の手順、組織の解離、めっき密度、使用される成長表面、および培地13、15、16の組成が含まれる。この記事では、既知のAE抗原および潜在的に新しい表面標的に対する抗体の存在を決定するために使用できる蛍光免疫染色と組み合わせた胎児ラット海馬ニューロンの初代細胞培養に最適化されたプロトコルを提供します。また、GCaMPファミリーGCaMP5Gの遺伝子コードカルシウム指標(GECI)を発現する培養海馬ニューロンを用いた生細胞イメージング技術により、NMDAR抗体の病原性効果を調べる方法の例も示します。
| 標的タンパク質 | タンパク質機能 | セルコンパートメント | 主な症候群 |
| NMDAR | イオンシャネル | シナプスタンパク質 | 抗NMDAR脳炎 |
| アンパー | イオンシャネル | シナプスタンパク質 | 大脳辺縁系脳炎 |
| グルク2 | イオンシャネル | シナプスタンパク質 | 脳炎 |
| ギャバアール | イオンシャネル | シナプスタンパク質 | 脳炎 |
| ギャバブル | 代謝型受容体 | シナプスタンパク質 | 大脳辺縁系脳炎 |
| mGluR1 | 代謝型受容体 | シナプスタンパク質 | 脳炎 |
| mGluR2 | 代謝型受容体 | シナプスタンパク質 | 脳炎 |
| mGluR5 | 代謝型受容体 | シナプスタンパク質 | 脳炎 |
| D2R | 代謝型受容体 | シナプスタンパク質 | 大脳基底核脳炎 |
| LGI1 | 接着分子 | 細胞表面タンパク質 | 大脳辺縁系脳炎 |
| CASPR2 | 接着分子 | 細胞表面タンパク質 | 大脳辺縁系脳炎 |
| イグロン5 | 接着分子 | 細胞表面タンパク質 | 抗IgLON5疾患 |
| ノイレキシン-3α | 接着分子 | 細胞表面タンパク質 | 脳炎 |
| DNER (Tr) | 膜貫通タンパク質 | 細胞表面タンパク質 | 脳炎 |
| セズ6L | 膜貫通タンパク質 | 細胞表面タンパク質 | 脳炎 |
| アンフィフィシン | 構造分子 | 細胞表面タンパク質 | 大脳辺縁系脳炎 |
| ティッカー | ペプチダーゼ | 細胞表面タンパク質 | 脳炎 |
表1:神経細胞表面およびシナプスタンパク質に対する抗体。
Protocol
すべての手順は、実験動物の使用と世話に関するヨーロッパ(2010/63 / UE)の規制に従って、バルセロナ大学の地元の倫理委員会によって承認されました。患者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、研究はヒトサンプルの使用について地元の施設内審査委員会によって承認されました(Hospital Clínic、HCB / 2018/0192)。
注: 現在のプロトコルには 3 つの部分があります。1つ目は神経細胞培養の確立、2つ目は神経細胞の生培養を用いた表面抗体の検出、3つ目はこれらの抗体の病原性の決定です。
第1部:解離性、胎児性、げっ歯類の海馬神経培養の確立
1.準備手順
- めっき表面のポリ-L-リジンコーティング(解剖の3日前)
- 500 mLの蒸留水に2.38 gのホウ酸と1.27 gのホウ砂を加え、溶解するまで15分間攪拌することにより、ホウ酸緩衝液を調製します。フードの下で、緩衝液をろ過(0.2 μmの孔径)で滅菌し、ラベルを付けて室温(RT)で保存します。
注:このソリューションは安定しており、6か月間使用できます。
注意: ホウ酸塩バッファーを準備するときは、推奨される個人用保護具を着用してください。 - 1 gのPLLを10 mLの蒸留水に加え、溶解するまで攪拌することにより、ポリ-L-リジン(PLL)ストック溶液(100 mg / mL)を調製します。500 μLのPLLストック溶液を調製します。最終濃度1 mg/mLに達するには、500 μLのPLLアリコートを50 mLのホウ酸緩衝液に加え、溶解するまで旋回させ、溶液をろ過して滅菌します(孔径0.2 μm)。
注:このソリューションは安定しており、6か月間使用できます。 - コーティングする表面を準備します。免疫染色手順には直径12 mmのカバーガラスを使用し、生きたニューロンのイメージングを含む研究にはガラス底皿を使用します。カバーガラスを使用する場合は、オートクレーブしてから、各皿(直径3.5 cm)に5つのカバーガラスを置きます。
注意: カバーガラスの厚さは、取得した画像の信号の品質と強度に影響します。ほとんどの顕微鏡対物レンズは、#1.5カバーガラス用に設計されています。イメージングのセットアップと技術に応じて適切なカバーガラスを選択してください。 - フードの下で、各皿に1.5 mLのPLL溶液を加えます(ガラス底の皿または5つのカバーガラスが付いた3.5 cmの皿)。すべてのカバーガラスが水没し、RTで24時間保管されていることを確認してください。
- 解剖の2日前に、PLL溶液を吸引し、滅菌したエンドトキシンフリー水で洗浄し、カバーガラスが水没していることを確認します。皿に水を入れ、RTで24時間保管します。
- 解剖の1日前に、水を吸引してNB + B27培地(下記参照)と交換し、皿を37°Cのインキュベーターに24時間入れます。
- 500 mLの蒸留水に2.38 gのホウ酸と1.27 gのホウ砂を加え、溶解するまで15分間攪拌することにより、ホウ酸緩衝液を調製します。フードの下で、緩衝液をろ過(0.2 μmの孔径)で滅菌し、ラベルを付けて室温(RT)で保存します。
- 培地および原液の調製(解剖の1日前)
- ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM):L-グルタミンとフェノールレッドを含まない500 mLのDMEM高グルコース(4.5 g / L)に、50 mLの馬血清、50 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのL-グルタミン(200 mM)、10 mLのピルビン酸ナトリウム(100 mM)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を追加します。フィルター(孔径0.2 μm)し、キャップを密閉した状態で4 oCで5 mLアリコートで保管します。
注:このソリューションは安定しており、1か月間使用できます。 - B27を添加したニューロバクサル(NB)培地(NB + B27):フェノールレッドを含まない50 mLのNB培地に、1 mLのB27サプリメントを追加します。
- B27を添加したHibernate-E培地(Hibernate + B27):50 mLのHibernate-E培地に、1 mLのB27サプリメントを加える。
- 細胞外生理溶液(EPS):滅菌水1Lに、指定された最終濃度で次のものを加えます:NaCl(140 mM)、KCl(3.5 mM)、HEPES(10 mM)、グルコース(20 mM)、およびCaCl 2(2 mM)。溶解するまで攪拌し、NaOH(0.5 M)またはHCl(0.5 M)を加えてpHを7.4に調整します。フードの下で、ろ過(孔径0.2μm)で滅菌し、4°Cで保管します。
- ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM):L-グルタミンとフェノールレッドを含まない500 mLのDMEM高グルコース(4.5 g / L)に、50 mLの馬血清、50 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのL-グルタミン(200 mM)、10 mLのピルビン酸ナトリウム(100 mM)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を追加します。フィルター(孔径0.2 μm)し、キャップを密閉した状態で4 oCで5 mLアリコートで保管します。
- 機器・その他実験材料(解剖当日)
- ウォーターバスを37°Cに設定します。 次のアリコートを加熱します:50 mLのHBSSおよび5 mLのDMEM。
- 無水エタノールを含むビーカーに浸して次のツールを滅菌します(図1B):鉗子、湾曲した鉗子、はさみ、細湾曲した鉗子、細い直線鉗子、手術用はさみ、細かい角度の鉗子、および精密ばねはさみ。
注意: ツールを保護するために、ビーカーの下部に柔らかい素材(科学精密ワイプなど)を配置します。 - 2つのトレイに氷を入れ、次のアイテムを置きます。
- アイストレイ1(図1C):無水エタノールを入れたビーカーに手術器具を入れ、手術器具をすすぐためのHBSSを入れたビーカー、胚を入れるためのHBSSを入れた10cmの皿、胚の頭を置くためのHBSSを入れた6cmの皿、胚の脳を置くためのHibernate + B27を入れた6cmの皿を置きます。
- アイストレイ2:解剖した海馬用に、トリプシン2.5%のアリコート1 mLと、休止状態+ B27を入れた3.5 cmの皿を置きます。
注:この手順に必要な時間は、研究者の経験と解剖する胚の数によって異なります。したがって、氷は必要な時間凍結したままでなければなりません。この目的にはポリスチレントレイをお勧めします。
2.解剖と播種(図1)
- 海馬隔離
注:E18で胚を持つ妊娠中のラットは、実験動物の使用と世話に関するヨーロッパ(2010/63 / UE)の規制に従って、バルセロナ大学の地元の倫理委員会に従ってプロトコルが始まる直前に安楽死させます。このプロトコルでは、安楽死の方法として二酸化炭素(CO2)吸入が使用されました。- 鉗子とはさみを使用して腹部腹膜のレベルでラットを解剖する。E18胚で子宮を抽出し、氷の上で冷やした10 cmの皿に入れます。
注:ラットの毛が胚に付着しないようにすることが重要です。腹部を消毒するために大量の70%エタノールを使用することをお勧めします。このステップ以降、製氷皿1のフード内で作業します。 - 胚嚢を開き、HBSSで10cmの皿に胚を移し、胚が完全に浸っていることを確認します。
- ハサミで胚の頭を取り除き、HBSSで6 cmの皿に入れます。すべての胚でこのプロセスを繰り返します。
注意: 汚染を避けるために、胚の頭を除くすべての組織はスクリューキャップ付きの容器に捨てる必要があります。 - 細かい湾曲した鉗子で胚の頭を持ち、45°の角度で入る一対の細かいまっすぐな鉗子で軌道を突き刺してから、細かく湾曲した鉗子を解放します。
注:鉗子は脳を通過してはならないため、入るときは角度を維持することが重要です。 - 後頭骨から前頭骨まで、手術用ハサミで皮膚と頭蓋骨を解剖します。一対の細かい湾曲した鉗子で脳を取り除き、冬眠+ B27で6 cmの皿に入れます。すべての脳が回復するまでこのプロセスを繰り返します。
- 末脳を細かいまっすぐな鉗子で矢状に分離します。
注:このステップ以降、海馬の解剖は実体顕微鏡下で行われます。光が解剖面を側面から照らすように、関節式ランプを使用することをお勧めします。また、黒の背景を使用するとコントラストが高くなり、海馬をよりよく区別できるため、黒の背景を使用することをお勧めします。 - Hibernate + B27の滴を1 cmの距離(円など)に置いて、10 cmの皿を準備します。Hibernate + B27の1滴あたり1つの終脳を置き、解剖スコープを通して視覚化します(1.25倍の対物倍率を推奨)。
- 髄膜を慎重に剥がし、視床を取り除き、海馬をよりよく視覚化します。
- 精密スプリングハサミで海馬を解剖し、氷皿2.5の冬眠+ B27を入れた2cmの皿に入れます。すべての海馬が収集されるまで、すべての終脳について繰り返します。
- パスツールピペットですべての海馬を注意深く集め、50 mLチューブに移します。
注:海馬を収集するときは、トリプシンを希釈しないように、休止状態+ B27の最小量を服用してください。
- 鉗子とはさみを使用して腹部腹膜のレベルでラットを解剖する。E18胚で子宮を抽出し、氷の上で冷やした10 cmの皿に入れます。
- 細胞解離
- 海馬の酵素的解離
- 海馬を含む50 mLチューブに、1 mLの2.5%トリプシンを加え、HBSSで5 mLの容量にします。37°Cの水浴中で15分間インキュベートします。
- トリプシンを希釈するには、予熱したHBSS10 mLを加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
- 粘液塊として現れた海馬を1,000 μLのマイクロピペットで50 mLのチューブに移し、6 mLの予熱したHBSSを加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
- 海馬の機械的解離
- 質量を円錐形の底部を有する2mLチューブに移し、最小容量を取る。予熱したDMEM培地を1mL加えます。ペレットを1,000 μLのマイクロピペットで穏やかに上下に吸引して均質化します。
注:気泡が細胞を溶解する可能性があるため、吸引するときは気泡の発生を避けることが重要です。 - 先端をチューブの円錐形の底に接触させた状態で、事前に引っ張られたガラスピペット(10x-20x)で上下の吸引を繰り返します。気泡の発生を避けてください。このステップの終わりに、混合物は半透明でなければなりません。
- 混合物が半透明になるように均一に混合したら、混合物を37°Cで4 mLのDMEM培地を含むチューブに移し、上下にピペッティングしてガラスピペットで均質化します。
- 質量を円錐形の底部を有する2mLチューブに移し、最小容量を取る。予熱したDMEM培地を1mL加えます。ペレットを1,000 μLのマイクロピペットで穏やかに上下に吸引して均質化します。
- 海馬の酵素的解離
- 細胞播種
- セルを数えます。溶液中のニューロンの数は、標準的な実験室手順に従って数えることができる。
注:抗体検出とカルシウム活性のイメージング実験では、3.5 cmディッシュあたり50,000細胞の濃度が最適です。 - 細胞を懸濁したまま、計算された容量を取り出し、PLLコーティングされたカバーガラスを含む3.5cmディッシュまたはPLLコーティングされたガラス底ディッシュにプレートします。
- 交差した動き(前後、次に左右、必要に応じて繰り返す)で静かに振ってセルを皿に均等に分配し、皿をCO2 (5%)インキュベーターに入れます。
注意: 細胞が皿の周辺に落ち着くのを避けるために、交差した動きを使用することが重要です。 - 毎週、約1 mLのNB + B27を追加して、培養物が乾かないようにします。
注:2週間後(in vitro [div]で14日間)、ニューロンは成熟し、実験に使用するすべての因子を発現します。このプロトコルを使用して得られたニューロンの総平均数は、妊娠中のラットあたり平均12個のE18胚に由来する約2.5 x 106 個のニューロンである。
- セルを数えます。溶液中のニューロンの数は、標準的な実験室手順に従って数えることができる。
パート2:神経細胞表面タンパク質の抗体検出のための海馬神経培養の使用
注:プロトコルのこの部分は、海馬培養を使用して、抗NMDAR脳炎患者の血清および/またはCSF中の抗NMDAR抗体を特定する方法を示しています。蛍光免疫染色は、生きたニューロンの反応性を視覚化するために使用されますが、他の視覚化方法も使用できます。この実験の適切な対照は、健康な個体からの血清またはCSFであろう。ヒトサンプルを使用する場合は、機関倫理委員会の承認が必要な場合があることに注意してください。
3. 生蛍光免疫染色
- カバーガラスで成長した14個のdivセルを使用します(5つのカバーガラスを含む3.5cmの皿あたり50,000個のセル)。
- フードの内側で、37°Cに予熱したNBでカバーガラスをすすぎます。
- この場合、血清の場合は1:200、CSFの場合は1:2でNB培地で希釈した抗NMDAR抗体(一次抗体として使用)を含むサンプルを追加し、37°Cで1時間インキュベートします(CO2 (5%)インキュベーター内)。
- RTでPBS3xで慎重にすすいでください。
- 固定液(PBS中の4%ホルムアルデヒド)を加え、RTで5分間インキュベートします。
注意: 4%ホルムアルデヒドを取り扱うときは、フード内で作業し、推奨される個人用保護具を着用してください。 - PBSで3回ずつ5分間洗浄します。
- 二次抗体ヤギ抗ヒトAF488を1:1000希釈で添加し、RTで1時間インキュベートします。
注意: インキュベーション中は、アルミホイルで覆って光にさらされないようにしてください。 - PBSで3回ずつ5分間洗浄します。蒸留水ですすぐ
- カバーガラスを液体封入剤(DAPIを使用した退色防止封入剤など、約7μL)で取り付け、残っている液体を吸引し、蒸留水ですすいでください。これで、ニューロンは蛍光イメージングの準備が整いました。
注意: 封入剤を取り扱うときは、推奨される個人用保護具を着用してください。
パート3:カルシウムイメージングを用いた抗体病原性効果の実証
注:プロトコルのこの部分は、患者の抗体が培養物に機能的な影響を及ぼし、病原性を示唆しているかどうかを判断する方法を示しています。効果の重要性を高めるために、8人の患者からのCSFのプールが使用されました。生培養物のカルシウム活性は、GECI蛍光カルシウム指示薬(GCaMP5G)を用いて化学刺激(NMDA+グリシン)で記録した。これらの研究では、ニューロンの必要な生理学的条件を維持できる細胞室を備えた倒立蛍光顕微鏡が必要です。
4. カルシウムイメージング
- カバーガラスで成長した14〜18個のdivセルを使用します(5つのカバーガラスで3.5 cmの皿あたり50,000セル)
- イメージングの1週間前に、ウイルスベクターpAAV2-CAG-GCaMP5Gを2.5 x 1010 GC / mLで細胞に加え、5〜7日間インキュベートします。
注:この市販のパッケージ済みAAV血清型2ベクターは、CAGプロモーター下で遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターGCaMP5Gを過剰発現します。 - イメージングの1日前に、患者サンプル(この例では、NB + B27で1:25に希釈したCSFのプール)を追加し、24時間インキュベートします。汚染を避けるために、使用前に必ず人間のサンプル(0.2 μmの細孔サイズ)をろ過してください。
注:これらの研究では、健康な被験者からのコントロールCSFを並行して実行する必要があります。 - イメージング当日、イメージングセットアップを準備し、顕微鏡セルチャンバーを37°Cに設定し、レーンに蒸留水を満たし、5%CO2 を注入して細胞の生理学的状態を維持します。
- フード内で、ステップ3の細胞を37°Cに予熱した3 mLのEPSで洗浄します。
- 細胞を2.45 mLのEPSで覆い、顕微鏡細胞チャンバーに移します。NBQX(10 μM)を追加してAMPA受容体とKA受容体をブロックし、NMDA受容体応答のみを視覚化します。
- 水銀灯とFITCフィルターキューブを備えた倒立蛍光顕微鏡で、100ms毎にフレームが記録された2分間の動画を取得します(自発活動)。
注:20x NA 0.75エア対物レンズを使用し、画像(512 x 512ピクセル、16ビットグレースケール)をsCMOSカメラで100ミリ秒ごとに撮影しました。 - 100ms毎にフレームを記録した4分の2本目の動画を撮影。取得を開始した直後に、刺激溶液(NMDA [100 μM] + グリシン[1 μM])を皿に加えます。
注意: ディッシュに培地を追加すると乱流が発生し、イメージング条件(フォーカス、蛍光強度、および/または非特異的バックグラウンドシグナル)が乱れる可能性があります。このような変化の可能性を減らすために、充填された2.5 mLディッシュに50 μLを超える溶液を追加しないでください。. - 画像処理ソフトウェア(ここではImageJを使用した)を使用して、刺激時に得られた経時的な蛍光シグナルを、患者および対照CSFサンプルと共にインキュベートした培養物から抽出する。
注:GCaMPプローブは、遊離カルシウムイオンに結合すると、立体構造が変化して明るくなります。したがって、蛍光強度の増加は、ニューロンの脱分極によるカルシウム流入と相関する。 - 分析する関心領域 (ROI) を決定します。ニューロンのソーマを手動でセグメント化し、ROIマネージャーにROIを追加します(ROIマネージャー>>ツールの分析>追加)。ROIマネージャーメニューからROIを保存します(詳細>保存)。
- 測定値を設定し(測定値を分析>設定)、[ 平均グレー値]を選択します。「 詳細>マルチメジャー」をクリックして細胞ソーマから平均蛍光強度プロファイルを抽出し、生成されたテーブルを.xlsスプレッドシートとして保存します。
- 統計解析を実行して、グループ間の蛍光を比較します(患者のCSFとコントロールのCSF)。
Representative Results
解離性、胎児、げっ歯類の海馬神経培養の確立
ここで紹介するプロトコルは、BankerとGoslin15によって行われた神経細胞培養に関する影響力のある研究に基づいています。プロトコルは、ニューロン表面抗体検出研究を実施するための最適な形態、密度、および純度を備えたニューロン培養物を取得するために改良されています。解剖と播種のプロトコルは3つの部分に分かれています(図1A)。最初の部分である海馬の隔離は、生体組織の外科的抽出で構成されています(図1A、左パネル)。図が示すように、E18胚を持つ妊娠中のWistarラットは、培養を成功させるための重要な出発物質です。E18胚から脳が抽出されたら、実体顕微鏡下で顕微手術が行われます。適切なツール(図1B)と正確な取り扱いにより、海馬を残りの神経組織から分離することが可能です。特定の培地における組織の配置を 図1Cに示す。プロトコルの2番目の部分は、海馬細胞の解離で構成されています。それは2つのステップ(図1A、中央のパネル)に細分されます:海馬の酵素的解離と機械的解離、それは無傷の、解離した、単一細胞をもたらします。この方法論を用いて、 図2A−Dに表されるように、細胞凝集物のない細胞培養物を得ることができる。プロトコルの3番目の部分は、細胞播種で構成されています(図1A、右パネル)。プロトコルのこの部分は、プレート内のニューロン培養の密度と均質性を調整するために重要です。細胞を数え、3.5 cmの皿の領域に50,000個のニューロンを播種すると、神経細胞表面タンパク質に対する抗体の存在を決定する実験(図3)だけでなく、カルシウムイメージングでこれらの抗体の病原性を分析するための最適な密度が得られます(図4)。
図1:海馬ニューロンの初代培養の視覚プロトコル。 (a)E18にて胚性ラットから海馬ニューロンの解離細胞培養物を調製するためのプロトコルの3つの部分を示すフローチャート。プロトコルは1に分割されます。海馬の隔離、2。細胞解離、および3.細胞播種。(B)海馬隔離の推奨ツールの選択は、胚採取用(1-鉗子、2-湾曲鉗子、3-はさみ)、脳摘出用(4-細湾曲鉗子、5-細直鉗子、6-手術用ハサミ)、海馬隔離用(7-細角鉗子、8-精密バネハサミ)の3つのカテゴリーに分類された。(C)海馬の隔離に必要なプレートと培地を備えた製氷皿1の概略図。胚と頭部はHBSSに配置されますが、脳は休止状態培地+ B27に配置されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
18 divの海馬ニューロンの培養は成熟し、相互接続されており、構造的および機能的タンパク質を発現しています
ニューロン培養の成長と成熟において、ニューロンの分極段階(図2A、B)と樹状突起の発達とシナプスネットワークの構築の段階(図2C、D)の2つの分化期が評価されます。1 div上の細胞は均等に分布し、プレートに接着し、細胞体の周りにラメラを発達させ、小神経突起が伸び始めています(図2A)。培養で数日後、神経突起は短い距離を伸ばします。細胞は有意な分極を示しますが、正味の成長はほとんどありません(図2B)。この段階の後、シナプス形成が顕著になり、ニューロンが相互接続し始めます。ニューロンネットワークは成長し続け、より複雑になります(図2C)。18 divでは、ニューロンは成熟し、相互に関連しています。ニューロンネットワークが構築されます(図2D)。シナプス棘が形成されて接続されると、ニューロンは完全に分極され、すべての機能的および構造的タンパク質を発現します。ここでは、成熟培養ニューロンによって発現される多くのタンパク質のうち、ニューロン受容体NMDA(図2E)とシナプスタンパク質PSD95(図2F)が代表的なマーカーとして選択されています。さらに、ニューロフィラメント(NF)を標識することで軸索を選択的に可視化し(図2G)、MAP2タンパク質を標的にすることで樹状突起を可視化することができます(図2H)。
図2:海馬ニューロンの解離細胞培養物の成熟の経時変化。 (A-D)培養の最初の18日間の海馬ニューロンの位相差画像。(A)PLLコーティングされた基質に付着した際の1divのニューロン。(B)5 divのニューロンにおける小さな神経突起の出現 (C)11 divのニューロンは、伸長して軸索特性を獲得する長い神経突起を発達させた。(D)18 divのニューロンは成熟しており、ニューラルネットワークを形成しています。スケールバー (A-D) = 40 μm. (E-H) 選択マーカーを用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影された代表的な蛍光画像で、18 divの成熟ニューロンを示す。神経細胞培養物を固定し、(E)神経受容体(NMDAR)、(F)シナプスマーカー(PSD95)、(G)軸索マーカー(ニューロフィラメント、NF)、および(H)樹状突起マーカー(MAP2)を選択的に染色する抗体で免疫染色した。スケールバー(E-H)= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
患者サンプル中の抗体は神経細胞表面抗原と反応する
抗NMDAR脳炎を有する患者から得られたサンプル(血清およびCSF)は、ニューロンの表面に存在するNMDARを認識する自己抗体を含有する。患者サンプルとの培養物のインキュベーションは、細胞表面と樹状突起に強い蛍光シグナルを生成します(図3A、C)。対照的に、対照サンプルは、ニューロン培養物に投与された場合、蛍光シグナルを生成しません(図3 B、D)。これらの知見は、培養物を使用して患者サンプルの抗体をスクリーニングし、神経細胞表面を標的とする新規抗体の同定につながる可能性があることを示しています。
患者からのCSFサンプルは、海馬ニューロンのNMDA誘発培養における細胞内カルシウム濃度を低下させます
神経活動(24時間処理後)に対する患者の抗体の影響を評価するために、NMDAを介した刺激を受けた培養ニューロンから細胞内カルシウム一過性をリアルタイムで光学的にモニターしました。NMDAの適用は、細胞内緑色蛍光の変化によって示されるように、蛍光強度の増加を生じる(図4Aおよび補足ビデオ1)。対照CSFサンプルで処理されたニューロンは、患者CSFサンプルで処理された細胞と比較して、刺激装置を適用した場合に蛍光強度のより高い差(56%)を示した。蛍光強度の違いを測定し、細胞の体細胞から抽出されたデータからのNMDA媒介刺激曲線を比較しました(図4B、C)。刺激曲線は、両方のシナリオでカルシウムの細胞内流入があったことを示していますが、患者のCSFで処理された培養物(灰色の線)は、対照で処理された培養物(黒い線)よりも低い反応を示しました。これらの結果は、患者のCSFに存在する抗体が、抗体とNMDARとの相互作用により細胞活性を低下させ、したがって病原性効果を引き起こすことを示しています。
図3:患者の抗体は神経培養物の表面と反応 します。 (A、E)抗NMDAR脳炎患者の血清およびCSFは、生きたラット海馬ニューロンの細胞表面と反応し、(B、F)対照被験者からの血清およびCSFは反応性を示さない。スケールバー(A、B、E、F)= 20μm。(C、G)患者の血清およびCSFおよび(D、H)対照に対する陰性の反応性の典型的な表面パターンを示す樹状突起(63x)の高倍率画像。画像は共焦点レーザー走査顕微鏡によって撮影された。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:患者の抗体は、GCaMP5Gを発現するラットニューロンへのカルシウム流入を減少させる。 (A)刺激液(NMDA[100μM]+グリシン[1μM])をニューロンの培養物に投与すると、刺激前(刺激前)の画像と比較して、細胞内の緑色蛍光(刺激ピーク)の増加によって示されるように、カルシウム流入が引き起こされました。120秒後、蛍光強度は減少し、安定します(刺激後)。患者のCSFで処理された培養物は、対照のCSFと比較して、NMDA媒介カルシウム増加の有意な減少(56%)を示しました。画像は蛍光顕微鏡で撮影した。スケールバー= 20μm。(B)NMDA刺激時のコントロールのCSF(黒い線)と患者のCSF(灰色の線)で処理された培養物の経時的な蛍光強度(180秒)を表す3つの独立した実験のうちの1つのプロット(青い矢印)。n(コントロールのCSF)= 20セル;n(患者のCSF)= 28細胞。データはSEM±平均値として表されます。 (C)箱ひげ図は、中央値、25パーセンタイル、および75パーセンタイルを示しています。ひげは最小値と最大値を示します。有意性の評価は、二元配置分散分析(ANOVA;p < 0.0001)およびマン・ホイットニーU検定(p < 0.0001)によって行った。p < 0.05の値は統計的に有意であると考えられた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1: GCaMP5Gを発現する2つの海馬ニューロンを並べて示すビデオ:コントロールのCSFで治療されたニューロン(左)と患者のCSFで治療されたニューロン(右)。NMDAR(刺激)の適用は、どちらの場合も細胞内蛍光強度の増加をもたらすが、対照のCSFで治療されたニューロンのレベルは、患者のCSFで治療されたものよりも有意に高いレベルを有する。画像は蛍光顕微鏡で撮影し、ルックアップテーブル(LUT)Fireを適用してImageJで編集しました。1700フレーム(170秒);5倍に加速しました。スケールバー = 10 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
抗体を介した自己免疫の分野の成長は、患者の診断と治療を改善するために使用できるニューロン自己抗体の同定の機会の窓を開きました。海馬ニューロンの培養は、抗体同定に不可欠なツールです。したがって、信頼性が高く再現性のある結果を得るには、標準化されたプロトコルを実行することが重要です。ここでは、考慮すべき最も重要な手順、制限事項、およびトラブルシューティングについて説明します。
このプロトコルの重要なステップは、海馬ニューロンの純度、均質性、または生存率に影響を与えるかどうかに応じて、3つのカテゴリに分類できます。
純度-最適な初代細胞培養を得るには、研究者は自信を持って訓練を受け、特に解剖時間を最小限に抑えるために迅速に作業できる必要があります。錐体ニューロンが主要な細胞型であっても、海馬には様々な介在ニューロン14が含まれている。最小限のグリア細胞で培養物を生成するには、海馬を最小限の周囲組織で抽出する必要があります。解剖中に黒い背景を使用すると、実体顕微鏡下で海馬の限界を特定するのに役立ちます。さらに、細胞密度が低いとパラクリンサポートが少なくなり、培養物の維持がより困難になることを考慮に入れる必要があります13。したがって、このバランスを念頭に置くことが重要です。これは、少数の細胞(3.5 cmディッシュあたり50,000ニューロン)を使用するイメージング研究において重要です。海馬摘出のための追加の時間を持つことができるようにするために、組織を保存する休止状態培地を使用する必要があります17。適切な手術器具での作業も不可欠です。高精度の工具はデリケートなので、慎重に保護することで技術の再現性を確保する必要があります。
均質性 - 細胞凝集体のない培養を開発するために、事前にプルされたガラスピペットと標準の1,000 μLピペットの使用を組み合わせることで、機械的な細胞解離がアップグレードされました。
生存率-このプロトコルでは、抗生物質はニューロンの興奮性に影響を与え、培養ニューロンの電気生理学的特性を変化させるため、添加されていません18。したがって、最高水準の無菌性が維持されない場合、汚染が非常に高くなります。温度も重要な要素です。海馬の分離中に組織を冷たく保つと、代謝が遅くなり、細胞の分解が減少します。したがって、組織は細胞解離プロセスまで氷上に保たれました。さらに、顕著な細胞溶解なしに細胞を分解する酵素細胞解離中に正しいバランスを見つけることが重要です。このプロトコルでは、トリプシンとのインキュベーションのタイミングとその後の洗浄ステップが最適化され、適切なニューロンネットワークの作成を可能にするのに十分なスペースを持つ個々の細胞が得られました。
重要なステップは、蛍光ライブ免疫染色および神経細胞培養からのカルシウム活性記録にも見られます。患者サンプル中の細胞表面タンパク質に対する抗体の存在を決定するためのライブ免疫染色を成功させるには、抗体が細胞内タンパク質にアクセスできるようにする細胞の透過処理を回避する必要があります。さらに、抗体の力価に基づいて、インキュベーション時間とサンプル希釈をそれに応じて調整する必要があります(たとえば、抗体価が非常に高いと、結果の解釈を困難にするバックグラウンド染色が発生する可能性があります)。カルシウムイメージングによる自己抗体の病原性評価を実施する場合、細胞活性測定に最適な培地を使用する必要があります(例えば、培地中のMg2+ 抑制は良好な性能のために重要です)。さらに、蛍光イメージングでは、フェノールレッドなどのpHインジケーターを含む培地は、非特異的なバックグラウンドシグナルを導入するため、避ける必要があります。
海馬神経培養の使用には2つの主な制限があります。第一に、安定した細胞株と比較して、初代培養は継続的に生成されなければならず、これは実験動物を定期的に使用することを意味する。人工多能性幹細胞(iPSC)株は、動物モデルを使用する必要性を置き換える可能性がありますが、iPS細胞の分化プロトコルはまだ最適ではありません。第二に、iPS細胞由来のニューロンは表面タンパク質の完全なスペクトルを発現しないため、使用された場合、反応性がないことは必ずしもサンプルの陰性性を意味するわけではありません19。
AEが疑われる患者の血清またはCSF中の自己抗体の存在をスクリーニングするには、ラット脳組織を用いた組織ベースのアッセイ(TBA)、ニューロンタンパク質を発現するためにトランスフェクトされたHEK細胞を用いた細胞ベースのアッセイ(CBA)、および海馬ニューロンの生培養を用いたアプリケーション19の3つの方法があります。培養海馬ニューロン法の重要性は、TBAでは容易に区別できない表面抗原や細胞内抗原との反応性を鑑別できることにあります。さらに、初代神経細胞培養は、HEKトランスフェクト細胞のCBAとは異なり、トランスフェクトされたタンパク質のレパートリーによって制限されません。さらに、培養海馬ニューロンは、免疫沈降法および質量分析と組み合わせることで、新規抗体とその標的抗原を同定するために使用でき、したがって、同定可能な抗体のスペクトルを広げることができます。最後に、細胞活動の変化をモニターできるライブイメージング法による自己抗体の病原性効果の評価を可能にします。結論として、新しい自己抗体の同定は、最終的に患者の転帰を改善するための特異的免疫療法の開始を可能にする。
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
メルシェ・リバス、マリア・マルサル、グスタボ・カストロ、ジョルディ・コルテス、アリーナ・ヒルシュマン、アンヘル・サンドバル(ICFO-Institut de Ciències Fotòniques)、メルセデス・アルバ、マリヤ・ラドセビッチ、デビッド・ソト、ザビエル・ガスル、マール・ガスプ、リディア・サバター(IDIBAPS、バルセロナ大学クリニック病院)の技術サポートと試薬の提供、ジョセップ・ダルマウとマーナ・R・ローゼンフェルド(IDIBAPS、 バルセロナ大学病院クリニック)原稿とメンターシップの批判的レビューに対して。この研究は、Instituto de Salud Carlos III(ISCIII)によって資金提供され、欧州連合、FIS(PI20/00280、JP)、Fundació CELLEX(P.L-A.)によって共同資金提供されました。Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa program for Centres of Excellence in R&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.);CERCAプログラムとレーザーラボ-ヨーロッパ(871124、PLA);Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.);フォンドソーシャルヨーロッパ(PRE2020-095721、MC)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
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