Summary
Encefalite autoimune é uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos do sistema nervoso central. Neurônios hipocampais podem ser usados para descobrir e caracterizar esses anticorpos. Este artigo fornece um protocolo para a cultura celular primária e imunostenção para determinar autoanticorpos no soro e fluido cefalorraquidiano dos pacientes.
Abstract
Nos últimos 15 anos, uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos do sistema nervoso central (SNC) tem sido caracterizada e agora é definida como "encefalite autoimune" (EA). Existem atualmente 17 síndromes conhecidas de EA, e todas estão associadas a anticorpos contra a superfície celular neuronal ou proteínas sinápticas. As síndromes clínicas são complexas e variam de acordo com o tipo de anticorpo associado. A mais conhecida dessas doenças é a encefalite do receptor anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), que é uma desordem neuropsiquiátrica proeminente associada a prejuízos graves de memória e comportamento. Os anticorpos associados reagem com a subunidade GluN1 do NMDAR no domínio do terminal N. A abordagem mais usada para a descoberta e caracterização de anticorpos AE inclui a cultura de neurônios hipocampais dissociados, fetais, roedores. Durante o processo de caracterização de anticorpos, os neurônios vivos na cultura são expostos ao soro ou CSF dos pacientes, e a detecção de reatividade indica que as amostras de soro ou CSF do paciente contêm anticorpos contra antígenos da superfície neuronal. Culturas hipocampais também podem ser usadas para determinar se os anticorpos em pacientes são potencialmente patogênicos examinando se causam alterações estruturais ou funcionais dos neurônios. O nível de sucesso desses estudos depende da qualidade das culturas e dos protocolos utilizados para a obtenção e detecção da reatividade das amostras de pacientes. Este artigo fornece um protocolo otimizado para a cultura celular primária de neurônios hipocampais de ratos fetais combinados com a imunostaining para determinar a presença de anticorpos no soro ou CSF de pacientes. Um exemplo de como examinar os potenciais efeitos patogênicos dos anticorpos NMDAR usando neurônios cultivados e imagens de cálcio também é apresentado.
Introduction
Encefalite autoimune (AE) é uma categoria recentemente descoberta de doenças do sistema nervoso central (SNC) mediadas por anticorpos que visam a superfície neuronal ou proteínas sinápticas 1,2. As características clínicas variam de acordo com o anticorpo, mas geralmente incluem memória e cognição prejudicadas, comportamento alterado e sintomas psiquiátricos, movimentos anormais, disfunção do sono, diminuição do nível de consciência e convulsões. Esses transtornos podem afetar indivíduos de todas as idades, com alguns tipos de EA afetando predominantemente crianças e adultos jovens2.
Nos últimos 15 anos, foram descritas 17 síndromes de EA com anticorpos contra superfície neuronal específica/proteínas sinápticas (Tabela 1). Alguns exemplos dos alvos neuronais incluem os receptores excitatórios sinápticos NMDAR 3,4 e AMPAR5, o receptor inibitório sináptico GABAbR6, a proteína secreta neuronal LGI17, e a molécula de adesão celular IgLON58. Para a maioria destes AE, estudos têm mostrado que os anticorpos interrompem a estrutura ou função de seu antígeno alvo, apoiando fortemente um papel patogênico. Por exemplo, na encefalite anti-NMDAR, os anticorpos reagem com o domínio n-terminal da subunidade GluN1 do NMDAR, produzindo uma internalização seletiva e reversível desses receptores que resulta em alterações neuropsiquiátricas proeminentes 4,9,10,11. Assim, a identificação de qualquer um dos 17 anticorpos conhecidos no soro ou CSF de um paciente também pode ser utilizada como um teste diagnóstico que estabelece o diagnóstico de um AE específico.
Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação e caracterização desses anticorpos inclui o uso de culturas de neurônios hipocampais dissociados, fetais, roedores. Essas culturas são úteis por várias razões: o cérebro embrionário é fácil de dissociar e contém um baixo nível de células gliais, a principal fonte de contaminação nas culturas neuronais12; a população celular do hipocampo é relativamente homogênea em comparação com a maioria das outras regiões do SNC, com células piramida representando a grande maioria13,14; culturas são preparadas a partir de embriões em estágio final quando a geração de neurônios piramihários está completa, mas as células de grânulo ainda não se desenvolveram, aumentando ainda mais a homogeneidade da cultura; quando os neurônios piramidais cultos expressam a maioria de suas principais características fenotípicas, são capazes de formar dendritos bem desenvolvidos e estabelecer redes sináticamente conectadas que podem ser usadas para investigações estruturais e eletrofisiológicas12,13; como os anticorpos não podem penetrar neurônios vivos, o uso de culturas vivas permite a identificação de alvos antigênicos que residem na superfície celular; e a imunoprecipitação do complexo anticorpo-antígeno de culturas neuronais permite a identificação do antígenoalvo 5.
O sucesso dos estudos utilizando culturas neuronais é altamente dependente da qualidade das culturas e dos protocolos utilizados para avaliar a imunoreatividade do soro ou fluido cefalorraquidiano (CSF) do paciente. Variáveis que podem afetar as culturas incluem os procedimentos de isolamento do hipocampo antes do desenvolvimento cultural, a dissociação do tecido, a densidade de revestimento, a superfície de crescimento utilizada e a composição da mídia 13,15,16. Este artigo fornece um protocolo otimizado para a cultura celular primária de neurônios hipocampais de ratos fetais combinados com imunossagens fluorescentes que podem ser usados para determinar a presença de anticorpos contra antígenos AE conhecidos e alvos de superfície potencialmente novos. Ele também fornece um exemplo de como examinar os efeitos patogênicos dos anticorpos NMDAR por técnicas de imagem de células vivas usando neurônios hipocampais cultivados expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI) da família GCaMP, GCaMP5G.
| Proteína-alvo | Função proteica | Compartimento celular | Síndrome principal |
| NMDAR | Íon Chanel | Proteína sináptica | Encefalite anti-NMDAR |
| AMPAR | Íon Chanel | Proteína sináptica | Encefalite límbica |
| GluK2 | Íon Chanel | Proteína sináptica | Encefalite |
| GABAAR | Íon Chanel | Proteína sináptica | Encefalite |
| GABAbR | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalite límbica |
| mGluR1 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalite |
| mGluR2 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalite |
| mGluR5 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalite |
| D2R | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalite gânglio basal |
| LGI1 | Molécula de adesão | Proteína da superfície celular | Encefalite límbica |
| CASPR2 | Molécula de adesão | Proteína da superfície celular | Encefalite límbica |
| IgLON5 | Molécula de adesão | Proteína da superfície celular | Doença anti-IgLON5 |
| Neurexin-3α | Molécula de adesão | Proteína da superfície celular | Encefalite |
| DNER (Tr) | Proteína transmembrana | Proteína da superfície celular | Encefalite |
| SEZ6L | Proteína transmembrana | Proteína da superfície celular | Encefalite |
| Anfífisina | Molécula estrutural | Proteína da superfície celular | Encefalite límbica |
| DPPX | Peptidase | Proteína da superfície celular | Encefalite |
Tabela 1: Anticorpos à superfície celular neuronal e proteínas sinápticas.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética local da Universidade de Barcelona seguindo regulamentos europeus (2010/63/UE) sobre o uso e cuidado de animais experimentais. O consentimento por escrito foi obtido dos pacientes, e o estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional local para o uso de amostras humanas (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
NOTA: Há três partes no protocolo atual. A primeira é para estabelecer as culturas neuronais, a segunda é para a detecção de anticorpos superficiais usando culturas vivas de neurônios, e a terceira é determinar a patogenicidade desses anticorpos.
PARTE 1: Estabelecimento de culturas neuronais hipocampais dissociadas, fetais e roedores
1. Etapas preparatórias
- Revestimento poli-L-lysine das superfícies de revestimento (3 dias antes da dissecação)
- Prepare o tampão de borate adicionando 2,38 g de ácido bórico e 1,27 g de bórax a 500 mL de água destilada e mexendo por 15 minutos até dissolver. Sob um capô, esterilize a solução tampão filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm), etiqueta e armazenar à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses.
ATENÇÃO: Ao preparar o tampão de borate, use equipamentos de proteção individual recomendados. - Prepare a solução de estoque Poly-L-Lysine (PLL) (100 mg/mL) adicionando 1 g de PLL a 10 mL de água destilada e mexendo até dissolver. Prepare 500 alíquotas μL da solução de estoque PLL. Para alcançar uma concentração final de 1 mg/mL, adicione 500 μL de alíquota PLL a 50 mL de tampão de borate e redemoinho até dissolver, e esterilizar a solução filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm).
NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses. - Prepare as superfícies para revestimento. Use tampas de 12 mm de diâmetro para procedimentos de imunossuagem e pratos de fundo de vidro para estudos que incluirão a imagem de neurônios vivos. Se usar tampas, autoclave e, em seguida, coloque cinco tampas em cada prato (3,5 cm de diâmetro).
NOTA: A espessura do deslizamento afeta a qualidade e intensidade do sinal das imagens adquiridas. A maioria dos objetivos do microscópio são projetados para deslizamentos de cobertura #1.5. Escolha as tampas apropriadas de acordo com a configuração e técnicas de imagem. - Sob um capô, adicione 1,5 mL de solução PLL a cada prato (prato de fundo de vidro ou prato de 3,5 cm com cinco tampas). Certifique-se de que todas as tampas estão submersas e armazenadas em RT por 24 horas.
- 2 dias antes da dissecção, aspire a solução PLL e lave com água endotoxina estéril, certificando-se de que as tampas estão submersas. Mantenha a água nos pratos e guarde na RT por 24 horas.
- 1 dia antes da dissecação, aspire a água e substitua-a por mídia cultural NB + B27 (veja abaixo), e coloque os pratos em uma incubadora a 37 °C por 24 h.
- Prepare o tampão de borate adicionando 2,38 g de ácido bórico e 1,27 g de bórax a 500 mL de água destilada e mexendo por 15 minutos até dissolver. Sob um capô, esterilize a solução tampão filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm), etiqueta e armazenar à temperatura ambiente (RT).
- Preparação de mídia cultural e solução de estoque (1 dia antes da dissecação)
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): A 500 mL de DMEM High Glicose (4,5 g/L) sem L-Glutamina e vermelho fenol, adicionar 50 mL de soro de cavalo, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sódio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazenar em alíquotas de 5 mL a 4 oC com uma tampa bem fechada.
NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 1 mês. - Neurobásal (NB) médio suplementado com B27 (NB + B27): A 50 mL de meio NB sem vermelho fenol, adicione 1 mL de suplemento B27.
- Hibernar-E médio suplementado com B27 (Hibernar + B27): A 50 mL de meio Hibernar-E, adicione 1 mL de suplemento B27.
- Solução Fisiológica Extracelular (EPS): A 1 L de água estéril, adicione o seguinte nas concentrações finais especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glicose (20 mM) e CaCl2 (2 mM). Mexa até dissolver e ajuste o pH para 7,4 adicionando NaOH (0,5 M) ou HCl (0,5 M). Sob o capô, esterilize filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazene a 4 oC.
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): A 500 mL de DMEM High Glicose (4,5 g/L) sem L-Glutamina e vermelho fenol, adicionar 50 mL de soro de cavalo, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sódio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazenar em alíquotas de 5 mL a 4 oC com uma tampa bem fechada.
- Equipamentos e outros materiais de laboratório (dia de dissecção)
- Coloque um banho de água para 37 °C. Aqueça as seguintes alíquotas: 50 mL de HBSS e 5 mL de DMEM.
- Esterilize as seguintes ferramentas, imerso em um béquer contendo etanol absoluto (Figura 1B): fórceps, fórceps curvos, tesouras curvadas, fórceps finos, tesouras de cirurgia, fórceps de ângulo fino e tesoura de mola de precisão.
NOTA: Para proteger as ferramentas, coloque um material macio (por exemplo, lenços de precisão científica) na parte inferior do béquer. - Encha duas bandejas com gelo e coloque os seguintes itens.
- Bandeja de gelo 1 (Figura 1C): Coloque ferramentas cirúrgicas no béquer com etanol absoluto, um béquer com HBSS para enxaguar as ferramentas cirúrgicas, um prato de 10 cm com HBSS para colocar os embriões, um prato de 6 cm com HBSS para colocar as cabeças dos embriões, e um prato de 6 cm com Hibernate + B27 para colocar os cérebros dos embriões.
- Bandeja de gelo 2: Coloque uma alíquota de 1 mL de trippsina 2,5% e um prato de 3,5 cm com Hibernar + B27 para o hipocampo dissecado.
NOTA: O tempo necessário para este procedimento depende da experiência do investigador e do número de embriões a serem dissecados. Portanto, o gelo deve permanecer congelado pelo tempo necessário. Bandejas de poliestireno são recomendadas para este fim.
2. Dissecção e semeadura (Figura 1)
- Isolamento hipocampal
NOTA: Ratos gestantes com embriões no E18 são eutanizados imediatamente antes do início do protocolo de acordo com o comitê de ética local da Universidade de Barcelona, seguindo regulamentos europeus (2010/63/UE) sobre o uso e cuidado de animais experimentais. Neste protocolo, a inalação de dióxido de carbono (CO2) foi utilizada como método de eutanásia.- Disseca o rato ao nível do peritônio abdominal usando fórceps e tesouras. Extrair o útero com os embriões E18 e colocá-lo em um prato de 10 cm que foi refrigerado no gelo.
NOTA: É importante evitar que os pelos de rato se anexem aos embriões. Recomenda-se o uso de quantidades abundantes de 70% de etanol para esterilizar o abdômen. A partir deste passo em diante, trabalhe dentro do capô na bandeja de gelo 1. - Abra os sacos embrionários e transfira os embriões para o prato de 10 cm com HBSS, certificando-se de que os embriões estejam totalmente imersos.
- Retire a cabeça do embrião com uma tesoura e coloque-a no prato de 6 cm com HBSS. Repita este processo com todos os embriões.
NOTA: Para evitar contaminação, todos os tecidos, exceto as cabeças de embrião, devem ser descartados em um recipiente com tampa de parafuso. - Segure a cabeça do embrião com fórceps finos e perfure as órbitas com um par de fórceps finos, entrando em um ângulo de 45° e, em seguida, solte os fórceps finos.
NOTA: Os fórceps não devem passar pelo cérebro, por isso é importante manter o ângulo ao entrar. - Dissecar a pele e o crânio com a tesoura da cirurgia, desde o osso occipital até o osso frontal. Remova o cérebro com um par de fórceps finos e coloque-o no prato de 6 cm com Hibernar + B27. Repita este processo até que todos os cérebros sejam recuperados.
- Separar os teleencefalos com os fórceps finos.
NOTA: A partir deste passo em diante, a dissecção do hipocampo é realizada sob um estereótipo. Recomenda-se o uso de lâmpadas articuladas para que a luz ilumine a superfície de dissecção dos lados. Também é recomendado usar um fundo preto, pois isso proporciona mais contraste, permitindo distinguir melhor o hipocampo. - Prepare um prato de 10 cm colocando gotas de Hibernar + B27 a distâncias de 1 cm (por exemplo, em círculo). Coloque um telencephalon por gota de Hibernar + B27 e visualize através do escopo de dissecação (recomenda-se ampliação objetiva de 1,25x).
- Descasque cuidadosamente as meninges e remova o tálamo para melhor visualizar o hipocampo.
- Disseca o hipocampo com a tesoura de mola de precisão e coloque-o no prato de 3,5 cm com Hibernar + B27 na bandeja de gelo 2. Repita para cada teleencefalo até que todos os hipocampos sejam coletados.
- Colete cuidadosamente todo o hipocampi com uma pipeta Pasteur e transfira-os para um tubo de 50 mL.
NOTA: Tome o volume mínimo de Hibernar + B27 ao coletar o hipocampi para não diluir a trippsina.
- Disseca o rato ao nível do peritônio abdominal usando fórceps e tesouras. Extrair o útero com os embriões E18 e colocá-lo em um prato de 10 cm que foi refrigerado no gelo.
- Dissociação celular
- Dissociação enzimática do hipocampo
- No tubo de 50 mL contendo o hipocampi, adicione 1 mL de trippsina de 2,5% e leve-o a um volume de 5 mL com HBSS. Incubar por 15 min no banho de água a 37 °C.
- Para diluir a trippsina, adicione 10 mL de HBSS pré-aquecido e incubar por 5 min no banho de água a 37 °C.
- Transfira o hipocampi que agora aparece como massa de muco para um tubo de 50 mL com uma micropipette de 1.000 μL, adicione 6 mL de HBSS pré-aquecido e incuba por 5 minutos no banho de água a 37 °C.
- Dissociação mecânica do hipocampo
- Transfira a massa para um tubo de 2 mL com fundo cônico, levando o volume mínimo. Adicione 1 mL de mídia DMEM pré-aquecida. Homogeneize a pelota com uma micropipette de 1.000 μL aspirando suavemente para cima e para baixo.
NOTA: É fundamental evitar gerar bolhas ao aspirar, pois as bolhas podem lise as células. - Repita a aspiração para cima e para baixo com uma pipeta de vidro pré-puxada (10x-20x), com sua ponta em contato com a parte inferior cônica do tubo. Evite gerar bolhas. No final desta etapa, a mistura deve ser translúcida.
- Uma vez misturado de forma homogênea, de tal forma que a mistura seja translúcida, transfira a mistura para um tubo contendo 4 mL de mídia DMEM a 37 °C e homogeneize com uma pipeta de vidro por pipetar para cima e para baixo.
- Transfira a massa para um tubo de 2 mL com fundo cônico, levando o volume mínimo. Adicione 1 mL de mídia DMEM pré-aquecida. Homogeneize a pelota com uma micropipette de 1.000 μL aspirando suavemente para cima e para baixo.
- Dissociação enzimática do hipocampo
- Semeadura celular
- Conte as células. O número de neurônios na solução pode ser contado de acordo com procedimentos laboratoriais padrão.
NOTA: Em experimentos de imagem para detecção de anticorpos e atividade de cálcio, uma concentração de 50.000 células por prato de 3,5 cm é ótima. - Mantendo as células suspensas, retire o volume calculado e a placa em pratos de 3,5 cm contendo tampas revestidas de PLL ou nos pratos de fundo de vidro revestidos de PLL.
- Distribua uniformemente as células nos pratos tremendo suavemente em movimentos cruzados (para frente e para trás, depois lado a lado; repita conforme necessário) e coloque os pratos na incubadora de CO2 (5%)
NOTA: É importante usar movimentos cruzados para evitar que as células se instalem na periferia do prato. - Toda semana, adicione aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que a cultura não seque.
NOTA: Após 2 semanas (14 dias in vitro [div]), os neurônios são maduros e expressam todos os fatores a serem usados para experimentação. O número médio total de neurônios obtidos usando este protocolo é de aproximadamente 2,5 x 106 neurônios provenientes de uma média de 12 embriões E18 por rato grávida.
- Conte as células. O número de neurônios na solução pode ser contado de acordo com procedimentos laboratoriais padrão.
PARTE 2: Utilização de culturas neuronais hipocampais para detecção de anticorpos em proteínas da superfície celular neuronal
NOTA: Esta parte do protocolo demonstra como culturas hipocampais são usadas para identificar anticorpos anti-NMDAR no soro e/ou CSF de pacientes com encefalite anti-NMDAR. A imunossuagem fluorescente é usada para visualizar a reatividade nos neurônios vivos, mas outros métodos de visualização também podem ser usados. Um controle apropriado para este experimento seria soro ou CSF de um indivíduo saudável. Ao usar amostras humanas, tenha em mente que a aprovação do comitê de ética institucional pode ser necessária.
3. Imunostaining fluorescente ao vivo
- Use 14 células div que foram cultivadas em deslizamentos de cobertura (50.000 células por prato de 3,5 cm contendo cinco tampas).
- Dentro do capô, enxágue as tampas com NB pré-aquecido a 37 °C.
- Adicione a amostra que neste caso contém anticorpos anti-NMDAR (usados como anticorpo primário) diluídos em mídia NB às 1:200 para soro ou 1:2 para CSF e incubar 1 h a 37 °C (dentro da incubadora de CO2 (5%).
- Enxágüe cuidadosamente com PBS 3x em RT.
- Adicione a solução de fixação (4% de formaldeído em PBS) e incubar em RT por 5 min.
ATENÇÃO: Ao manusear 4% de formaldeído, trabalhe dentro do capô e use equipamentos de proteção individual recomendados. - Lave 3x com PBS por 5 min cada.
- Adicione anticorpo secundário Anti-Humano AF488 a 1:1000 diluição e incubar na RT por 1 h.
NOTA: Durante a incubação, proteja-se da exposição à luz cobrindo com papel alumínio. - Lave 3x com PBS por 5 min cada. Enxágüe com água destilada
- Monte as tampas com um meio de montagem líquida (por exemplo, mídia de montagem antifrápida com DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire qualquer líquido restante e enxágue com água destilada. Os neurônios estão prontos para a fluorescência.
ATENÇÃO: Ao manusear o meio de montagem, use o equipamento de proteção individual recomendado.
PARTE 3: Demonstração de efeitos patogênicos de anticorpos usando imagem de cálcio
NOTA: Esta parte do protocolo demonstra como determinar se os anticorpos em pacientes têm um efeito funcional sobre as culturas, o que sugere patogenicidade. Para aumentar a significância dos efeitos, utilizou-se um pool de CSF de oito pacientes. A atividade de cálcio das culturas vivas foi registrada mediante estimulação química (NMDA + Glycine) utilizando o indicador de cálcio de fluorescência GECI (GCaMP5G). Estes estudos requerem um microscópio de fluorescência invertida com uma câmara celular que pode manter as condições fisiológicas necessárias dos neurônios.
4. Imagem de cálcio
- Use células div de 14 a 18 que foram cultivadas em deslizamentos de cobertura (50.000 células por prato de 3,5 cm com cinco tampas)
- 1 semana antes da imagem, adicione o vetor viral pAAV2-CAG-GCaMP5G a 2,5 x 1010 GC/mL às células e incubar por 5-7 dias.
NOTA: Este sorotipo AAV pré-embalado, pré-embalado, sobre-expressa o indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP5G sob um promotor cag. - 1 dia antes da imagem, adicione a amostra do paciente (neste exemplo, um pool de CSF diluído 1:25 em NB + B27) e incubar por 24 h. Filtrar sempre amostras humanas (0,2 μm de tamanho de poros) antes de ser usado para evitar contaminação.
NOTA: Para esses estudos, o controle do CSF de indivíduos saudáveis precisa ser executado em paralelo. - No dia da imagem, prepare a configuração da imagem e coloque a câmara celular do microscópio para 37 °C, encha a pista com água destilada e infundir com 5% de CO2 para manter as condições fisiológicas celulares.
- No capô, lave as células do Passo 3 com 3 mL de EPS pré-aquecido a 37 °C
- Cubra as células com 2,45 mL de EPS e transfira-as para a câmara celular do microscópio. Adicione NBQX (10 μM) para bloquear os receptores AMPA e KA para visualizar exclusivamente a resposta do receptor NMDA.
- No microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lâmpada de mercúrio e um cubo de filtro FITC, adquira um filme de 2 minutos com quadros gravados a cada 100 ms (atividade espontânea).
NOTA: Um objetivo de ar 20x NA 0,75 foi usado, e imagens (512 x 512 pixels, escala de cinza de 16 bits) foram tiradas a cada 100 ms com uma câmera sCMOS. - Adquira o segundo filme de 4 minutos com quadros gravados a cada 100 ms. Logo após o início da aquisição, adicione a solução de estimulação (NMDA [100 μM] + Glycine [1 μM]) ao prato.
NOTA: A adição de mídia no prato gerará turbulência que pode interromper as condições de imagem (foco, intensidade de fluorescência e/ou sinal de fundo inespecífico). Não adicione mais de 50 μL de solução no prato cheio de 2,5 mL para diminuir a probabilidade de tais alterações. - Utilizando-se o software de processamento de imagens (ImageJ foi utilizado aqui), extrair o sinal de fluorescência ao longo do tempo, obtido após a estimulação, a partir das culturas incubadas com o paciente e controlar amostras de CSF.
NOTA: As sondas GCaMP, ao se ligarem a íons de cálcio livres, sofrem uma mudança conformacional fazendo com que fiquem mais brilhantes. Portanto, o aumento da intensidade da fluorescência se correlaciona com um influxo de cálcio devido à despolarização neuronal. - Determine as regiões de interesse (ROI) para analisar. Segmente manualmente as somas dos neurônios e adicione os ROIs ao gerenciador de ROI (Analisar ferramentas > > gerente de ROI > Add). Salve o ROI do menu ROI Manager (Mais > Salvar).
- Defina as medidas (Analisar > definir medidas) e selecione o valor cinza Médio. Extrair o perfil médio de intensidade de fluorescência das somas celulares clicando em Mais > Multi Medida e, em seguida, salve a tabela gerada como uma planilha .xls.
- Realizar análises estatísticas para comparar a fluorescência entre grupos (CSF vs. control's CSF dos pacientes).
Representative Results
Estabelecimento de culturas neuronais hipocampais dissociadas, fetais e roedores
O protocolo aqui apresentado baseia-se nos estudos influentes sobre cultivo de células nervosas realizados por Banker e Goslin15. O protocolo foi refinado para obter culturas neuronais com morfologia, densidade e pureza ideais para a realização de estudos de detecção de anticorpos da superfície neuronal. O protocolo de dissecção e semeadura é dividido em três partes (Figura 1A). A primeira parte, o isolamento hipocampal, consiste na extração cirúrgica do tecido vivo (Figura 1A, painel esquerdo). Como indicado pela figura, ratos Wistar grávidas com embriões E18 são o material de partida chave para uma cultura de sucesso. Uma vez que o cérebro é extraído dos embriões E18, a microcirurgia é realizada sob um estereótipo. Com ferramentas apropriadas (Figura 1B) e manuseio preciso, é possível separar o hipocampo do resto do tecido nervoso. A disposição dos tecidos na mídia específica é retratada na Figura 1C. A segunda parte do protocolo consiste na dissociação celular hipocampal. É subdividida em duas etapas (Figura 1A, painel médio): dissociação enzimática e dissociação mecânica do hipocampo, que resultam em células intactas, dissociadas e únicas. Utilizando essa metodologia, é possível obter culturas celulares sem agregados celulares, conforme representado na Figura 2A-D. A terceira parte do protocolo consiste na semeadura celular (Figura 1A, painel direito). Esta parte do protocolo é crucial para ajustar a densidade e homogeneidade da cultura neuronal na placa. Contar as células e semear 50.000 neurônios em uma área de um prato de 3,5 cm fornece uma densidade ideal para realizar não apenas experimentos para determinar a presença de anticorpos às proteínas da superfície celular neuronal (Figura 3), mas também para analisar a patogenicidade desses anticorpos com imagem de cálcio (Figura 4).
Figura 1: Protocolo visual para culturas primárias de neurônios hipocampais. (A) Fluxograma mostrando as três partes do protocolo para preparar culturas de células dissociadas de neurônios hipocampais de ratos embrionários no E18. O protocolo é dividido em 1. Isolamento hipocampal, 2. Dissociação celular, e 3. Semeadura de células. (B) Seleção de ferramentas recomendadas para isolamento hipocampal agrupadas em três categorias: (1- Fórceps, 2- Fórceps curvos, 3- Tesoura) para coleta de embriões, (4- Fórceps finos, 5- Fórceps finos, 6- Tesouras de cirurgia) para extração cerebral, e (7- Fórceps finos, 8- Molas de precisão) para isolamento hipocampal. (C) Representação esquemática da bandeja de gelo 1 com placas e mídia necessária para o isolamento do hipocampo. Embriões e cabeças são colocados no HBSS, enquanto os cérebros são colocados em nível hibernado + B27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Culturas de neurônios hipocampais a 18 div são maduras, interconectadas e expressam proteínas estruturais e funcionais
No crescimento e maturação das culturas neuronais, duas fases diferenciadas podem ser apreciadas: a fase de polarização do neurônio (Figura 2A,B) e a fase de desenvolvimento dendrático e construção da rede sináptica (Figura 2C,D). As células em 1 div são distribuídas uniformemente e aderiram à placa, desenvolvendo uma lamella ao redor do corpo celular com neurites menores começando a se estender (Figura 2A). Depois de alguns dias na cultura, os neurites se estendem por uma curta distância. As células apresentam uma polarização significativa, mas há pouco crescimento líquido (Figura 2B). Após esta fase, a sinápsigogênese é proeminente, e os neurônios começam a se interligar. A rede neuronal continua crescendo e se torna mais complexa (Figura 2C). Aos 18 div, os neurônios são maduros e interligados; a rede neuronal é construída (Figura 2D). Uma vez que as espinhas sinápticas são formadas e conectadas, os neurônios são totalmente polarizados e expressam todas as proteínas funcionais e estruturais. Das muitas proteínas expressas por neurônios cultivados maduros, o receptor neuronal NMDA (Figura 2E) e a proteína sináptica PSD95 (Figura 2F) foram escolhidos aqui como marcadores representativos. Além disso, é possível visualizar seletivamente axônios rotulando neurofilamento (NF) (Figura 2G) e visualizando dendritos mirando a proteína MAP2 (Figura 2H).
Figura 2: Curso temporal do amadurecimento das culturas dissociadas das neurônios hipocampais. (A-D) Imagens de contraste de fase de neurônios hipocampais durante os primeiros 18 dias de cultura. (A) Neurônios a 1 div após o apego ao substrato revestido de PLL. (B) O surgimento de pequenos neurites em neurônios a 5 div. (C) Neurônios a 11 div desenvolveram neurites longos que alongam e adquirem características axonais. (D) Os neurônios a 18 div são maduros e formaram uma rede neural. Barra de escala (A-D) = 40 μm. (E-H) Imagens fluorescentes representativas tiradas por microscopia de varredura a laser confocal usando marcadores seletivos para mostrar neurônios maduros a 18 div. As culturas neuronais foram fixadas e imunossurgiram com anticorpos que mancham seletivamente para (E) receptor neuronal (NMDAR), (F) marcador sináptico (PSD95), (G) marcador axonal (neurofilamento, NF) e (H) marcador dendrático (MAP2). Barra de escala (E-H) = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Anticorpos em amostras de pacientes reagem com antígenos da superfície celular neuronal
As amostras (soro e CSF) obtidas de pacientes com encefalite anti-NMDAR contêm autoanticorpos que reconhecem o NMDAR presente na superfície dos neurônios. A incubação das culturas com as amostras do paciente produz um sinal intenso de fluorescência na superfície celular e dendritos (Figura 3A,C). Em contraste, as amostras de controle não produzem sinal de fluorescência quando administradas às culturas neuronais (Figura 3B,D). Esses achados mostram como as culturas podem ser usadas para rastrear amostras de pacientes para anticorpos e podem levar à identificação de novos anticorpos que visam a superfície celular neuronal.
A amostra de CSF do paciente diminui a concentração intracelular de cálcio em culturas induzidas pelo NMDA de neurônios hipocampais
Para avaliar o efeito dos anticorpos dos pacientes na atividade neural (após o tratamento de 24 horas), os transitórios intracelulares de cálcio foram monitorados opticamente a partir dos neurônios cultivados em tempo real após a estimulação mediada pelo NMDA. A aplicação do NMDA gera um aumento na intensidade da fluorescência, como indicado por uma mudança na fluorescência verde intracelular (Figura 4A e Vídeo Suplementar 1). Os neurônios tratados com a amostra de CSF de controle apresentaram maior diferença na intensidade da fluorescência (56%) quando o estimulador foi aplicado em comparação com as células tratadas com a amostra de CSF do paciente. As diferenças na intensidade da fluorescência foram medidas, e as curvas de estimulação mediadas pelo NMDA dos dados extraídos da soma das células foram comparadas (Figura 4B,C). As curvas de estimulação mostram que houve um fluxo intracelular de cálcio em ambos os cenários, mas as culturas tratadas com o CSF (linha cinza) dos pacientes apresentaram uma resposta menor do que as culturas tratadas pelo controle (linha preta). Esses resultados demonstram que os anticorpos presentes no CSF dos pacientes diminuem a atividade celular devido à interação dos anticorpos com o NMDAR e, assim, causam um efeito patogênico.
Figura 3: Os anticorpos do paciente reagem com a superfície das culturas neuronais. (A,E) Soro e CSF de pacientes com encefalite anti-NMDAR reagem com a superfície celular de neurônios hipocampais de ratos vivos, (B,F) enquanto o soro e o CSF dos sujeitos de controle não mostram reatividade. Barra de escala (A, B,E,F) = 20 μm. Imagem de ampliação mais elevada de um dendrite (63x) mostrando o padrão típico de reatividade da superfície para (C,G) o soro e CSF do paciente e (D,H) negativo para controles. As imagens foram tiradas por microscopia de varredura a laser confocal. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os anticorpos do paciente reduzem o fluxo de cálcio em neurônios de ratos expressando GCaMP5G. (A) A administração da solução de estimulação (NMDA [100 μM] + Glycine [1 μM]) em culturas de neurônios desencadeou um fluxo de cálcio, como indicado pelo aumento da fluorescência verde intracelular (pico de estimulação), em comparação com a imagem tirada antes da estimulação (pré-estimulação). Após os 120 anos, a intensidade da fluorescência diminui e estabiliza (pós-estimulação). As culturas tratadas com o CSF dos pacientes apresentaram redução significativa (56%) no aumento de cálcio mediado pelo NMDA em comparação com o CSF do controle. As imagens foram tiradas por microscopia de fluorescência. Barra de escala = 20 μm. (B) Um enredo de um dos três experimentos independentes representando a intensidade da fluorescência ao longo do tempo (180 s) para as culturas tratadas com csf (linha preta) do controle e CSF (linha cinza) dos pacientes sobre a estimulação NMDA (seta azul). n (Controles' CSF) = 20 células; n (CSF dos pacientes) = 28 células. Os dados são representados como média ± AS parcelas da Caixa mostram a mediana, 25ª e 75ª percentis. Os bigodes indicam os valores mínimos e máximos. A avaliação da significância foi realizada por análise bidirecional de variância (ANOVA; p < 0,0001) e testes mann-whitney u (p < 0,0001). O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Vídeo mostrando dois neurônios hipocampais expressando GCaMP5G lado a lado: neurônio tratado com CSF (esquerda) do controle vs. neurônio tratado com CSF (direita) dos pacientes. A aplicação de NMDAR (estimulação) gera um aumento na intensidade de fluorescência intracelular em ambos os casos, mas com um nível significativamente maior no neurônio tratado com o CSF do controle sobre aquele tratado com o CSF dos pacientes. As imagens foram tiradas por microscopia de fluorescência e editadas com ImageJ aplicando a tabela de procuração (LUT) Fire. 1700 quadros (170 s); acelerado 5 vezes. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Discussion
O crescente campo da autoimunidade mediada por anticorpos abriu uma janela de oportunidade para a identificação de autoanticorpos neuronais que podem ser usados para melhorar o diagnóstico e o tratamento dos pacientes. Culturas de neurônios hipocampais são uma ferramenta essencial para a identificação de anticorpos; portanto, é importante realizar um protocolo padronizado para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Os passos mais importantes a serem considerados, limitações e solução de problemas, são discutidos aqui.
As etapas críticas deste protocolo podem ser agrupadas em três categorias, dependendo se afetam a pureza, a homogeneidade ou a viabilidade dos neurônios hipocampais.
Pureza - Para obter culturas celulares primárias ideais ideais, o pesquisador deve ser confiante, treinado e capaz de trabalhar rapidamente, especialmente para minimizar o tempo da dissecação. Mesmo que os neurônios piramihários sejam o tipo principal de células, o hipocampo contém uma variedade de interneurons14. Para gerar culturas com células gliais mínimas, o hipocampo deve ser extraído com o tecido mínimo circundante. O uso de um fundo preto durante a dissecção ajuda a identificar os limites do hipocampo sob o estereóscópio. Além disso, deve-se levar em conta que densidades celulares mais baixas resultam em menos suporte paracrino e dificultam a manutenção da cultura13. Então, é importante ter esse equilíbrio em mente. Isso é importante em estudos de imagem que usam um baixo número de células (50.000 neurônios por prato de 3,5 cm). Para ter tempo adicional para a extração hipocampal, a mídia hibernar que preserva o tecido deve ser usada17. Trabalhar com ferramentas cirúrgicas adequadas também é essencial. Ferramentas de alta precisão são delicadas, por isso a reprodutibilidade da técnica deve ser garantida protegendo-as cuidadosamente.
Homogeneidade - Para desenvolver uma cultura sem agregados celulares, a dissociação de células mecânicas foi atualizada combinando o uso de uma pipeta de vidro pré-puxada com uma pipeta padrão de 1.000 μL.
Viabilidade - Neste protocolo, nenhum antibiótico foi adicionado porque influenciam a excitabilidade neuronal e alteram as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios cultivados18. Portanto, a contaminação é muito provável se os mais altos padrões de esterilidade não forem mantidos. A temperatura também é um fator chave. Manter o tecido frio durante o isolamento hipocampal retarda o metabolismo e diminui a degradação celular. O tecido foi, portanto, mantido no gelo até o processo de dissociação celular. Além disso, é crucial encontrar o equilíbrio correto durante a dissociação celular enzimática que desagrega as células sem lise celular marcada. Neste protocolo, os tempos de incubação com trippsina e as etapas subsequentes de lavagem foram otimizados para obter células individuais com espaço suficiente para permitir a criação de uma rede neuronal adequada.
Passos críticos também são encontrados em registros de imunostaining ao vivo fluorescente e atividade de cálcio das culturas neuronais. Para realizar uma imunostaining ao vivo bem-sucedida para determinar a presença de anticorpos às proteínas da superfície celular em amostras de pacientes, é preciso evitar a permeabilização das células que permitiriam aos anticorpos acesso a proteínas intracelulares. Além disso, com base no título dos anticorpos, o tempo de incubação e a diluição amostral devem ser ajustados em conformidade (por exemplo, anticorpos de titer muito altos podem dar coloração de fundo que dificulta a interpretação dos resultados). Ao realizar a avaliação da patogenicidade dos autoanticorpos com imagem de cálcio, é preciso utilizar uma mídia ideal para medições de atividade celular (por exemplo, a supressão mg2+ no meio da cultura é importante para um bom desempenho). Além disso, para a imagem de fluorescência, a mídia com indicadores de pH, como o vermelho fenol, deve ser evitada, pois introduz um sinal de fundo não específico.
Existem duas limitações principais do uso de culturas neuronais hipocampais. Em primeiro lugar, em comparação com linhas de células estáveis, as culturas primárias devem ser geradas continuamente, o que implica o uso regular de animais de laboratório. As linhas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) poderiam substituir a necessidade de usar modelos animais, mas os protocolos de diferenciação para iPSC ainda não são ideais. Em segundo lugar, os neurônios derivados do iPSC não expressam o espectro completo das proteínas superficiais e, portanto, se utilizados, a ausência de reatividade não implica necessariamente a negatividade da amostra19.
Existem três métodos para triagem para a presença de autoanticorpos no soro ou CSF de pacientes suspeitos de ter AE: ensaio baseado em tecido (TBA) usando tecido cerebral de rato, ensaio baseado em células (CBA) usando células HEK transfectadas para expressar proteínas neuronais, e a aplicação relatada aqui usando culturas vivas de neurônios hipocampais19. A importância do método de neurônio hipocampal cultivado reside em sua capacidade de diferenciar a reatividade com antígenos superficiais e intracelulares que não podem ser facilmente distinguidos pela TBA. Além disso, as culturas neuronais primárias, ao contrário da CBA nas células transfetizadas hek, não são limitadas pelo repertório de proteínas transfectadas. Além disso, neurônios hipocampais cultivados podem ser usados para identificar novos anticorpos e seus antígenos alvo quando combinados com imunoprecipitação e espectrometria de massa e, portanto, ampliar o espectro de anticorpos identificáveis. Por fim, permite a avaliação dos efeitos patogênicos dos autoanticorpos por métodos de imagem ao vivo que podem monitorar alterações na atividade celular. Em conclusão, a identificação de novos autoanticorpos eventualmente permite o início de imunoterápicos específicos para melhorar os resultados dos pacientes.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann e Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) e Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp e Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Universidade de Barcelona) por seu apoio técnico e por fornecer reagentes, e Josep Dalmau Hospital Clínic, Universidade de Barcelona) por sua revisão crítica do manuscrito e mentoria. Este estudo foi financiado pelo Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) e cofinanciado pela União Europeia, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa programa para Centros de Excelência em P&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Programa CERCA e Laserlab-Europa (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Inovação (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); e Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
