Summary
Auto-immune encefalitis is een nieuwe categorie van antilichaam-gemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel. Hippocampusneuronen kunnen worden gebruikt om deze antilichamen te ontdekken en te karakteriseren. Dit artikel biedt een protocol voor primaire celkweek en immunostaining om auto-antilichamen in het serum en cerebrospinale vloeistof van patiënten te bepalen.
Abstract
In de afgelopen 15 jaar is een nieuwe categorie van antilichaamgemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) gekarakteriseerd en wordt nu gedefinieerd als "auto-immune encefalitis" (AE). Er zijn momenteel 17 bekende AE-syndromen en ze zijn allemaal geassocieerd met antilichamen tegen het neuronale celoppervlak of synaptische eiwitten. De klinische syndromen zijn complex en variëren afhankelijk van het type geassocieerd antilichaam. De bekendste van deze ziekten is anti-N-methyl D-aspartaatreceptor (NMDAR) encefalitis, een prominente neuropsychiatrische aandoening geassocieerd met ernstige geheugen- en gedragsstoornissen. De geassocieerde antilichamen reageren met de GluN1-subeenheid van de NMDAR op het N-terminale domein. De aanpak die het meest wordt gebruikt voor de ontdekking en karakterisering van AE-antilichamen omvat de cultuur van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampale neuronen. Tijdens het proces van antilichaamkarakterisering worden levende neuronen in cultuur blootgesteld aan het serum of de liquor van patiënten, en de detectie van reactiviteit geeft aan dat het serum of de liquormonsters van de patiënt antilichamen bevatten tegen neuronale oppervlakteantigenen. Hippocampusculturen kunnen ook worden gebruikt om te bepalen of de antilichamen bij patiënten potentieel pathogeen zijn door te onderzoeken of ze structurele of functionele veranderingen van de neuronen veroorzaken. De mate van succes van deze studies hangt af van de kwaliteit van de culturen en van de protocollen die worden gebruikt om de reactiviteit van patiëntmonsters te verkrijgen en te detecteren. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd protocol voor primaire celkweek van foetale rat hippocampus neuronen in combinatie met immunostaining om de aanwezigheid van antilichamen in het serum of csf van patiënten te bepalen. Een voorbeeld van hoe de potentiële pathogene effecten van NMDAR-antilichamen kunnen worden onderzocht met behulp van gekweekte neuronen en calciumbeeldvorming wordt ook gepresenteerd.
Introduction
Auto-immune encefalitis (AE) is een recent ontdekte categorie ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) gemedieerd door antilichamen die zich richten op neuronale oppervlakte- of synaptische eiwitten 1,2. De klinische kenmerken variëren afhankelijk van het antilichaam, maar omvatten gewoonlijk een verminderd geheugen en cognitie, veranderd gedrag en psychiatrische symptomen, abnormale bewegingen, slaapstoornissen, verminderd bewustzijnsniveau en epileptische aanvallen. Deze aandoeningen kunnen van invloed zijn op personen van alle leeftijden, waarbij sommige soorten LR voornamelijk kinderen en jonge volwassenen treffen2.
In de afgelopen 15 jaar zijn 17 AE-syndromen met antilichamen tegen specifieke neuronale oppervlakte-/synaptische eiwitten beschreven (tabel 1). Enkele voorbeelden van de neuronale doelwitten zijn de synaptische excitatorische receptoren NMDAR 3,4 en AMPAR5, de synaptische remmende receptor GABAbR6, het neuronale uitgescheiden eiwit LGI17 en het celadhesiemolecuul IgLON58. Voor de meeste van deze LR hebben studies aangetoond dat de antilichamen de structuur of functie van hun doelantigeen verstoren, waardoor een pathogene rol sterk wordt ondersteund. Bijvoorbeeld, bij anti-NMDAR encefalitis reageren de antilichamen met het N-terminale domein van de GluN1-subeenheid van de NMDAR, waardoor een selectieve en omkeerbare internalisatie van deze receptoren ontstaat die resulteert in prominente neuropsychiatrische veranderingen 4,9,10,11. De identificatie van een van de 17 bekende antilichamen in het serum of de liquor van een patiënt kan dus ook worden gebruikt als een diagnostische test die de diagnose van een specifieke LR vaststelt.
Een van de technieken die vaker worden gebruikt voor de identificatie en karakterisering van deze antilichamen omvat het gebruik van culturen van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampus neuronen. Deze culturen zijn om verschillende redenen nuttig: embryonale hersenen zijn gemakkelijk te dissociëren en bevatten een laag niveau van gliacellen, de belangrijkste bron van besmetting in neuronale culturen12; de celpopulatie van de hippocampus is relatief homogeen in vergelijking met de meeste andere regio's van het CZS, met piramidale cellen die de overgrote meerderheid13,14 vertegenwoordigen; culturen worden bereid uit embryo's in een laat stadium wanneer de generatie van piramidale neuronen is voltooid, maar korrelcellen zich nog niet hebben ontwikkeld, wat verder bijdraagt aan de homogeniteit van de cultuur; wanneer gekweekt, piramidale neuronen drukken de meeste van hun belangrijkste fenotypische kenmerken uit, zijn in staat om goed ontwikkelde dendrieten te vormen en synaptisch verbonden netwerken tot stand te brengen die kunnen worden gebruikt voor structureel en elektrofysiologisch onderzoek12,13; aangezien antilichamen geen levende neuronen kunnen binnendringen, maakt het gebruik van levende culturen de identificatie mogelijk van antigene doelen die zich op het celoppervlak bevinden; en immunoprecipitatie van het antilichaam-antigeencomplex uit neuronale culturen maakt identificatie van het doelantigeen5 mogelijk.
Het succes van studies met neuronale culturen is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de culturen en de protocollen die worden gebruikt om de immunoreactiviteit van het serum of cerebrospinale vloeistof (CSF) van een patiënt te beoordelen. Variabelen die de culturen kunnen beïnvloeden, zijn onder meer de procedures voor isolatie van de hippocampus voorafgaand aan de cultuurontwikkeling, de dissociatie van het weefsel, de platingdichtheid, het gebruikte groeioppervlak en de samenstelling van de media 13,15,16. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd protocol voor primaire celkweek van foetale rat hippocampus neuronen in combinatie met fluorescerende immunostaining die kan worden gebruikt om de aanwezigheid van antilichamen tegen bekende AE-antigenen en mogelijk nieuwe oppervlaktedoelen te bepalen. Het biedt ook een voorbeeld van hoe de pathogene effecten van NMDAR-antilichamen kunnen worden onderzocht door live-cell imaging-technieken met behulp van gekweekte hippocampale neuronen die een genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) uit de GCaMP-familie, GCaMP5G, tot expressie brengen.
| Doeleiwit | Eiwitfunctie | Celcompartiment | Hoofdsyndroom |
| Nmdar | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Anti-NMDAR encefalitis |
| Ampar | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Limbische encefalitis |
| Gluk2 | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
| GABAaR | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
| GabAbr | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Limbische encefalitis |
| mGluR1 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
| mGluR2 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
| mGluR5 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
| D2R | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Basale ganglia-encefalitis |
| LGI1 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
| CASPR2 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
| IgLON5 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Anti-IgLON5 ziekte |
| Neurexin-3α | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
| DNER (Tr) | Transmembraaneiwit | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
| SEZ6L | Transmembraaneiwit | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
| Amfifysine | Structureel molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
| DPPX | Peptidase | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
Tabel 1: Antilichamen tegen het neuronale celoppervlak en synaptische eiwitten.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Barcelona volgens de Europese (2010/63/UE) voorschriften over het gebruik en de verzorging van proefdieren. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten en de studie werd goedgekeurd door de lokale institutionele beoordelingscommissie voor het gebruik van menselijke monsters (Hospital Clínic, HCB / 2018/0192).
OPMERKING: Het huidige protocol bestaat uit drie delen. De eerste is voor het vaststellen van de neuronale culturen, de tweede is voor de detectie van oppervlakte-antilichamen met behulp van levende culturen van neuronen, en de derde is om de pathogeniciteit van deze antilichamen te bepalen.
DEEL 1: Oprichting van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampale neuronale culturen
1. Voorbereidende stappen
- Poly-L-Lysine coating van de plating oppervlakken (3 dagen voor dissectie)
- Bereid de boraatbuffer door 2,38 g boorzuur en 1,27 g borax toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water en gedurende 15 minuten te roeren tot het is opgelost. Steriliseer de bufferoplossing onder een kap door te filteren (0,2 μm poriegrootte), etiketteer en bewaar bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Deze oplossing is stabiel en kan 6 maanden worden gebruikt.
LET OP: Draag bij het bereiden van boraatbuffer de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen. - Bereid de Poly-L-Lysine (PLL) stamoplossing (100 mg/ml) door 1 g PLL toe te voegen aan 10 ml gedestilleerd water en roer tot het is opgelost. Bereid 500 μL aliquots PLL-stamoplossing. Om een eindconcentratie van 1 mg /ml te bereiken, voegt u 500 μL aliquot toe aan 50 ml boraatbuffer en wervelt u totdat deze is opgelost en steriliseert u de oplossing door te filteren (poriegrootte van 0,2 μm).
OPMERKING: Deze oplossing is stabiel en kan 6 maanden worden gebruikt. - Bereid de oppervlakken voor op coating. Gebruik coverslips met een diameter van 12 mm voor immunostainingprocedures en glazen bodemschalen voor studies die de beeldvorming van levende neuronen omvatten. Als u coverslips gebruikt, autoclaaf dan en plaats vervolgens vijf coverslips in elke schaal (3,5 cm diameter).
OPMERKING: De dikte van de coverslip beïnvloedt de kwaliteit en intensiteit van het signaal van de verkregen beelden. De meeste microscoopdoelen zijn ontworpen voor #1.5 coverslips. Kies de juiste coverslips op basis van de beeldvormingsinstellingen en -technieken. - Voeg onder een kap 1,5 ml PLL-oplossing toe aan elke schotel (schaal met glazen bodem of schaal van 3,5 cm met vijf coverslips). Zorg ervoor dat alle coverslips worden ondergedompeld en 24 uur bij RT worden bewaard.
- 2 dagen voor de dissectie, aspirateer de PLL-oplossing en was met steriel endotoxinevrij water, zorg ervoor dat de coverslips worden ondergedompeld. Houd water in de afwas en bewaar het bij RT gedurende 24 uur.
- Zuig het water 1 dag voor de dissectie aan en vervang het door NB + B27-kweekmedia (zie hieronder) en plaats de gerechten gedurende 24 uur in een incubator bij 37 °C.
- Bereid de boraatbuffer door 2,38 g boorzuur en 1,27 g borax toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water en gedurende 15 minuten te roeren tot het is opgelost. Steriliseer de bufferoplossing onder een kap door te filteren (0,2 μm poriegrootte), etiketteer en bewaar bij kamertemperatuur (RT).
- Bereiding van kweekmedia en stockoplossing (1 dag vóór dissectie)
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Tot 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) zonder L-Glutamine en fenolrood, voeg 50 ml paardenserum, 50 ml foetaal runderserum (FBS), 10 ml L-glutamine (200 mM), 10 ml natriumpyruvaat (100 mM), 10 ml penicilline-streptomycine (10.000 U / ml) toe. Filter (0,2 μm poriegrootte) en bewaar in 5 ml aliquots bij 4 oC met een goed gesloten dop.
OPMERKING: Deze oplossing is stabiel en kan 1 maand worden gebruikt. - Neurobasaal (NB) medium aangevuld met B27 (NB + B27): Voeg aan 50 ml NB-medium zonder fenolrood 1 ml B27-supplement toe.
- Hibernate-E medium aangevuld met B27 (Hibernate + B27): Voeg aan 50 mL Hibernate-E medium 1 ml B27-supplement toe.
- Extracellulaire fysiologische oplossing (EPS): Voeg aan 1 l steriel water het volgende toe bij de gespecificeerde eindconcentraties: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glucose (20 mM) en CaCl2 (2 mM). Roer tot het opgelost is en breng de pH op 7,4 door NaOH (0,5 M) of HCl (0,5 M) toe te voegen. Steriliseer onder de motorkap door te filteren (poriegrootte van 0,2 μm) en bewaar bij 4 oC.
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Tot 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) zonder L-Glutamine en fenolrood, voeg 50 ml paardenserum, 50 ml foetaal runderserum (FBS), 10 ml L-glutamine (200 mM), 10 ml natriumpyruvaat (100 mM), 10 ml penicilline-streptomycine (10.000 U / ml) toe. Filter (0,2 μm poriegrootte) en bewaar in 5 ml aliquots bij 4 oC met een goed gesloten dop.
- Apparatuur en andere laboratoriummaterialen (dag van de dissectie)
- Stel een waterbad in op 37 °C. Verwarm de volgende aliquots: 50 ml HBSS en 5 ml DMEM.
- Steriliseer de volgende gereedschappen door onder te dompelen in een bekerglas dat absolute ethanol bevat (figuur 1B): tang, gebogen tang, schaar, fijngebogen tang, fijn-rechte tang, operatieschaar, fijnzijdige tang en precisieveerschaar.
OPMERKING: Om het gereedschap te beschermen, plaatst u een zacht materiaal (bijv. wetenschappelijke precisiedoekjes) op de bodem van het bekerglas. - Vul twee trays met ijs en plaats de volgende items.
- IJsbak 1 (figuur 1C): Plaats chirurgisch gereedschap in het bekerglas met absolute ethanol, een bekerglas met HBSS voor het spoelen van de chirurgische gereedschappen, een schaal van 10 cm met HBSS om de embryo's te plaatsen, een schaal van 6 cm met HBSS om de hoofden van de embryo's te plaatsen en een schaal van 6 cm met Hibernate + B27 om de hersenen van de embryo's te plaatsen.
- IJsbak 2: Leg een 1 ml aliquot trypsine 2,5% en een schaal van 3,5 cm met Hibernate + B27 voor de ontleedde hippocampus.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor deze procedure hangt af van de ervaring van de onderzoeker en het aantal embryo's dat moet worden ontleed. Daarom moet het ijs de benodigde tijd bevroren blijven. Polystyreen trays worden aanbevolen voor dit doel.
2. Dissectie en zaaien (figuur 1)
- Hippocampus isolatie
OPMERKING: Zwangere ratten met embryo's op E18 worden geëuthanaseerd onmiddellijk voordat het protocol begint in overeenstemming met de lokale ethische commissie van de Universiteit van Barcelona, volgens de Europese (2010/63/UE) voorschriften over het gebruik en de verzorging van proefdieren. In dit protocol werd kooldioxide (CO2) inademing gebruikt als euthanasiemethode.- Ontleed de rat ter hoogte van het buikperitoneum met behulp van een tang en een schaar. Haal de baarmoeder eruit met de E18 embryo's en leg deze in een schaal van 10 cm die op ijs is gekoeld.
OPMERKING: Het is belangrijk om te voorkomen dat de rattenharen zich aan de embryo's hechten. Het wordt aanbevolen om overvloedige hoeveelheden 70% ethanol te gebruiken om de buik te steriliseren. Werk vanaf deze stap in de kap aan ijsbak 1. - Open de embryonale zakken en breng de embryo's over naar de schaal van 10 cm met HBSS, zorg ervoor dat de embryo's volledig zijn ondergedompeld.
- Verwijder de embryokop met een schaar en leg deze in de schaal van 6 cm met HBSS. Herhaal dit proces met alle embryo's.
OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, moet al het weefsel behalve de embryokoppen worden weggegooid in een container met een schroefdop. - Houd de embryokop vast met een fijngebogen tang en doorboort de banen met een paar fijn-rechte tangen, die in een hoek van 45° binnenkomen en laat vervolgens de fijngebogen tang los.
OPMERKING: De tang mag niet door de hersenen gaan, dus het is belangrijk om de hoek te behouden bij het binnenkomen. - Ontleed de huid en schedel met de operatieschaar, beginnend van het achterhoofdsbeen tot het voorhoofdsbeen. Verwijder de hersenen met een fijngebogen tang en plaats deze in de schaal van 6 cm met Hibernate + B27. Herhaal dit proces totdat alle hersenen zijn hersteld.
- Scheid de telencephalons sagittally met de fijn-rechte tang.
OPMERKING: Vanaf deze stap wordt de dissectie van de hippocampus uitgevoerd onder een stereomicroscoop. Het wordt aanbevolen om gelede lampen te gebruiken, zodat het licht het dissectieoppervlak vanaf de zijkanten verlicht. Het wordt ook aanbevolen om een zwarte achtergrond te gebruiken, omdat dit meer contrast biedt, waardoor de hippocampus beter kan worden onderscheiden. - Bereid een schaal van 10 cm door druppels Hibernate + B27 op 1 cm afstand te plaatsen (bijvoorbeeld in een cirkel). Plaats één telencephalon per druppel Hibernate + B27 en visualiseer door de ontleedhoek (1,25x objectieve vergroting wordt aanbevolen).
- Pel de hersenvliezen voorzichtig af en verwijder de thalamus om de hippocampus beter te visualiseren.
- Ontleed de hippocampus met de precisieveerschaar en plaats deze in de schaal van 3,5 cm met Hibernate + B27 in ijsbak 2. Herhaal dit voor elk telencephalon totdat alle hippocampi zijn verzameld.
- Verzamel alle hippocampi zorgvuldig met een Pasteur-pipet en breng ze over in een buis van 50 ml.
OPMERKING: Neem het minimale volume Hibernate + B27 bij het verzamelen van de hippocampi om het trypsine niet te verdunnen.
- Ontleed de rat ter hoogte van het buikperitoneum met behulp van een tang en een schaar. Haal de baarmoeder eruit met de E18 embryo's en leg deze in een schaal van 10 cm die op ijs is gekoeld.
- Celdissociatie
- Enzymatische dissociatie van de hippocampus
- Voeg in de buis van 50 ml met de hippocampi 1 ml 2,5% trypsine toe en breng het op een volume van 5 ml met HBSS. Incubeer gedurende 15 minuten in het waterbad bij 37 °C.
- Om het trypsine te verdunnen, voeg 10 ml voorverwarmd HBSS toe en incubeer gedurende 5 minuten in het waterbad bij 37 °C.
- Breng de hippocampi die nu verschijnen als een slijmmassa over naar een buis van 50 ml met een micropipette van 1.000 μL, voeg 6 ml voorverwarmd HBSS toe en incubeer gedurende 5 minuten in het waterbad bij 37 °C.
- Mechanische dissociatie van de hippocampus
- Breng de massa over naar een buis van 2 ml met conische bodem en neem het minimale volume. Voeg 1 ml voorverwarmde DMEM-media toe. Homogeniseer de pellet met een micropipette van 1.000 μL door voorzichtig op en neer te zuigen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat u bubbels genereert bij het aspirateren, omdat bubbels de cellen kunnen lyseren. - Herhaal de op- en neergaande aspiratie met een voorgetrokken glazen pipet (10x-20x), met de punt in contact met de conische onderkant van de buis. Vermijd het genereren van bubbels. Aan het einde van deze stap moet het mengsel doorschijnend zijn.
- Breng het mengsel, eenmaal homogeen gemengd, zodat het mengsel doorschijnend is, over in een buis met 4 ml DMEM-media bij 37 °C en homogeniseer met een glazen pipet door op en neer te pipetteren.
- Breng de massa over naar een buis van 2 ml met conische bodem en neem het minimale volume. Voeg 1 ml voorverwarmde DMEM-media toe. Homogeniseer de pellet met een micropipette van 1.000 μL door voorzichtig op en neer te zuigen.
- Enzymatische dissociatie van de hippocampus
- Cel zaaien
- Tel de cellen. Het aantal neuronen in de oplossing kan worden geteld volgens standaard laboratoriumprocedures.
OPMERKING: In beeldvormingsexperimenten voor antilichaamdetectie en calciumactiviteit is een concentratie van 50.000 cellen per schaal van 3,5 cm optimaal. - Houd de cellen gesuspendeerd, trek het berekende volume op en plaat in schotels van 3,5 cm met PLL-gecoate coverslips of in de PLL-gecoate glazen bodemschalen.
- Verdeel de cellen gelijkmatig over de schotels door zachtjes te schudden in gekruiste bewegingen (heen en weer, dan van links naar rechts; herhaal indien nodig) en plaats de gerechten in de CO2 (5%) incubator.
OPMERKING: Het is belangrijk om gekruiste bewegingen te gebruiken om te voorkomen dat de cellen zich in de periferie van het gerecht nestelen. - Voeg elke week ongeveer 1 ml NB + B27 toe, zodat de cultuur niet droogt.
OPMERKING: Na 2 weken (14 dagen in vitro [div]), zijn de neuronen volwassen en drukken ze alle factoren uit die moeten worden gebruikt voor experimenten. Het totale gemiddelde aantal neuronen verkregen met behulp van dit protocol is ongeveer 2,5 x 106 neuronen afkomstig van een gemiddelde van 12 E18 embryo's per zwangere rat.
- Tel de cellen. Het aantal neuronen in de oplossing kan worden geteld volgens standaard laboratoriumprocedures.
DEEL 2: Hippocampus neuronale culturen gebruiken voor antilichaamdetectie in neuronale celoppervlakeiwitten
OPMERKING: Dit deel van het protocol laat zien hoe hippocampusculturen worden gebruikt om anti-NMDAR-antilichamen te identificeren in het serum en/of csf van patiënten met anti-NMDAR-encefalitis. Fluorescerende immunostaining wordt gebruikt om de reactiviteit in de levende neuronen te visualiseren, maar andere visualisatiemethoden kunnen ook worden gebruikt. Een geschikte controle voor dit experiment zou serum of csf van een gezond individu zijn. Houd er bij het gebruik van menselijke monsters rekening mee dat goedkeuring van de institutionele ethische commissie vereist kan zijn.
3. Live fluorescerende immunostaining
- Gebruik 14 div-cellen die zijn gekweekt op coverslips (50.000 cellen per schaal van 3,5 cm met vijf coverslips).
- Spoel de coverslips in de kap af met NB voorverwarmd tot 37 °C.
- Voeg het monster toe dat in dit geval anti-NMDAR-antilichamen bevat (gebruikt als primair antilichaam) verdund in NB-media op 1:200 voor serum of 1:2 voor CSF en incubeer 1 uur bij 37 °C (in de CO2 (5%) incubator).
- Spoel voorzichtig af met PBS 3x op RT.
- Voeg fixatieoplossing (4% formaldehyde in PBS) toe en incubeer bij RT gedurende 5 minuten.
LET OP: Wanneer u 4% formaldehyde hanteert, werk dan in de motorkap en draag de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen. - Was 3x met PBS gedurende 5 min per stuk.
- Voeg secundair antilichaam Goat anti-Human AF488 toe bij 1:1000 verdunning en incubeer bij RT gedurende 1 uur.
OPMERKING: Bescherm tijdens de incubatie tegen blootstelling aan licht door af te dekken met aluminiumfolie. - Was 3x met PBS gedurende 5 min per stuk. Afspoelen met gedestilleerd water
- Monteer de coverslips met een vloeibaar montagemedium (bijv. antifading montagemedia met DAPI; ongeveer 7 μL), zuig de resterende vloeistof aan en spoel af met gedestilleerd water. De neuronen zijn nu klaar voor fluorescentie beeldvorming.
LET OP: Draag bij het hanteren van montagemedium de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen.
DEEL 3: Demonstratie van antilichaampathogene effecten met behulp van calciumbeeldvorming
OPMERKING: Dit deel van het protocol laat zien hoe te bepalen of de antilichamen bij patiënten een functioneel effect hebben op de culturen, wat pathogeniciteit zou suggereren. Om de significantie van de effecten te vergroten, werd een pool van CSF van acht patiënten gebruikt. Calciumactiviteit van de levende culturen werd geregistreerd bij chemische stimulatie (NMDA + Glycine) met behulp van de GECI fluorescentiecalciumindicator (GCaMP5G). Deze studies vereisen een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een celkamer die de vereiste fysiologische omstandigheden van de neuronen kan handhaven.
4. Calcium beeldvorming
- Gebruik 14-18 div-cellen die zijn gekweekt op coverslips (50.000 cellen per schaal van 3,5 cm met vijf coverslips)
- Voeg 1 week voorafgaand aan de beeldvorming de virale vector pAAV2-CAG-GCaMP5G toe aan 2,5 x 1010 GC/ml aan de cellen en incubeer gedurende 5-7 dagen.
OPMERKING: Deze in de handel verkrijgbare, voorverpakte AAV serotype 2-vector overexpressie van genetisch gecodeerde calciumindicator GCaMP5G onder een CAG-promotor. - Voeg 1 dag voorafgaand aan de beeldvorming het patiëntmonster toe (in dit voorbeeld een pool van CSF verdund 1:25 in NB + B27) en incubeer gedurende 24 uur. Filtreer altijd menselijke monsters (0,2 μm poriegrootte) voor gebruik om besmetting te voorkomen.
OPMERKING: Voor deze studies moet de controle van csf van gezonde proefpersonen parallel worden uitgevoerd. - Bereid op de dag van de beeldvorming de beeldvormingsopstelling voor en stel de microscoopcelkamer in op 37 °C, vul de baan met gedestilleerd water en infundeer met 5% CO2 om de fysiologische omstandigheden van de cel te behouden.
- Was in de kap de cellen van stap 3 met 3 ml EPS voorverwarmd tot 37 °C
- Bedek de cellen met 2,45 ml EPS en breng ze over naar de microscoopcelkamer. Voeg NBQX (10 μM) toe om de AMPA- en KA-receptoren te blokkeren om uitsluitend de NMDA-receptorrespons te visualiseren.
- Verkrijg in de omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een kwiklamp en een FITC-filterkubus een film van 2 minuten met frames die om de 100 ms worden opgenomen (spontane activiteit).
OPMERKING: Er werd een luchtdoelstelling van 20x NA 0,75 gebruikt en er werden elke 100 ms afbeeldingen (512 x 512 pixels, 16-bits grijswaarden) gemaakt met een sCMOS-camera. - Verkrijg de tweede film van 4 minuten met frames die elke 100 ms worden opgenomen. Voeg kort na het starten van de acquisitie de stimulatieoplossing (NMDA [100 μM] + Glycine [1 μM]) toe aan het gerecht.
OPMERKING: De toevoeging van media aan de schotel zal turbulentie genereren die de beeldomstandigheden (focus, fluorescentie-intensiteit en / of niet-specifiek achtergrondsignaal) kan verstoren. Voeg niet meer dan 50 μL oplossing toe aan de gevulde schaal van 2,5 ml om de kans op dergelijke veranderingen te verkleinen. - Met behulp van beeldverwerkingssoftware (ImageJ werd hier gebruikt), extraheer het fluorescentiesignaal in de loop van de tijd, verkregen bij stimulatie, uit de culturen die met de patiënt zijn geïncubeerd en controleer CSF-monsters.
OPMERKING: De GCaMP-sondes ondergaan, wanneer ze zich binden aan vrije calciumionen, een conformatieverandering waardoor ze helderder worden. Daarom correleert de toename van fluorescentie-intensiteit met een calciuminstroom als gevolg van neuronale depolarisatie. - Bepaal de regio's van belang (ROI) die u wilt analyseren. Segmenteer handmatig de soma's van neuronen en voeg de ROI's toe aan de ROI-manager (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Sla de ROI op via het menu ROI Manager (Meer > Opslaan).
- Stel de metingen in (Analyseren > Metingen instellen) en selecteer de gemiddelde grijswaarde. Extraheer het gemiddelde fluorescentie-intensiteitsprofiel uit de celsoma's door op Meer > Multi meting te klikken en sla de gegenereerde tabel op als een .xls spreadsheet.
- Statistische analyses uitvoeren om de fluorescentie tussen groepen te vergelijken (csf van patiënten versus csf van de controle).
Representative Results
Oprichting van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampale neuronale culturen
Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de invloedrijke studies over het kweken van zenuwcellen uitgevoerd door Banker en Goslin15. Het protocol is verfijnd om neuronale culturen te verkrijgen met optimale morfologie, dichtheid en zuiverheid voor het uitvoeren van neuronale oppervlakte-antilichaamdetectiestudies. Het protocol van dissectie en zaaien is verdeeld in drie delen (figuur 1A). Het eerste deel, de hippocampusisolatie, bestaat uit de chirurgische extractie van het levende weefsel (figuur 1A, linkerpaneel). Zoals aangegeven door de figuur, zijn zwangere Wistar-ratten met E18-embryo's het belangrijkste uitgangsmateriaal voor een succesvolle kweek. Zodra de hersenen uit de E18-embryo's zijn geëxtraheerd, wordt microchirurgie uitgevoerd onder een stereomicroscoop. Met de juiste hulpmiddelen (figuur 1B) en nauwkeurige hantering is het mogelijk om de hippocampus te scheiden van de rest van het zenuwweefsel. De dispositie van weefsels in de specifieke media is weergegeven in figuur 1C. Het tweede deel van het protocol bestaat uit de hippocampusceldissociatie. Het is onderverdeeld in twee stappen (figuur 1A, middenpaneel): enzymatische dissociatie en mechanische dissociatie van de hippocampus, die resulteren in intacte, gedissocieerde, enkele cellen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om celculturen te verkrijgen zonder celaggregaten, zoals weergegeven in figuur 2A-D. Het derde deel van het protocol bestaat uit het zaaien van cellen (figuur 1A, rechterpaneel). Dit deel van het protocol is cruciaal om de dichtheid en homogeniteit van de neuronale cultuur in de plaat aan te passen. Het tellen van de cellen en het zaaien van 50.000 neuronen in een gebied van een schaal van 3,5 cm biedt een optimale dichtheid om niet alleen experimenten uit te voeren om de aanwezigheid van antilichamen tegen neuronale celoppervlakeiwitten te bepalen (figuur 3), maar ook om de pathogeniciteit van deze antilichamen te analyseren met calciumbeeldvorming (figuur 4).
Figuur 1: Visueel protocol voor primaire culturen van hippocampale neuronen. (A) Stroomdiagram met de drie delen van het protocol voor het bereiden van gedissocieerde celculturen van hippocampale neuronen van embryonale ratten op E18. Het protocol is onderverdeeld in 1. Hippocampusisolatie, 2. Celdissociatie, en 3. Celzaaien. (B) Selectie van aanbevolen hulpmiddelen voor hippocampusisolatie gegroepeerd in drie categorieën: (1- Tang, 2- Gebogen tang, 3- Schaar) voor embryoverzameling, (4- Fijngebogen tang, 5- Fijn-rechte tang, 6- Chirurgieschaar) voor hersenextractie, en (7- Fijnhoekige tang, 8- Precisieveerschaar) voor hippocampusisolatie. (C) Schematische weergave van ijsbak 1 met platen en media die nodig zijn voor de hippocampusisolatie. Embryo's en hoofden worden in HBSS geplaatst, terwijl hersenen in winterslaapmedium + B27 worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Culturen van hippocampusneuronen op 18 div zijn volwassen, onderling verbonden en drukken structurele en functionele eiwitten uit
In de groei en rijping van neuronale culturen kunnen twee gedifferentieerde fasen worden gewaardeerd: de polarisatiefase van het neuron (figuur 2A, B) en de fase van dendritische ontwikkeling en constructie van het synaptische netwerk (figuur 2C, D). Cellen op 1 div zijn gelijkmatig verdeeld en hebben zich aan de plaat gehecht, waardoor een lamellen rond het cellichaam worden ontwikkeld met kleine neurieten die zich beginnen uit te breiden (figuur 2A). Na enkele dagen in cultuur breiden de neurieten zich over een korte afstand uit. Cellen vertonen een significante polarisatie, maar er is weinig nettogroei (figuur 2B). Na deze fase is synaptogenese prominent aanwezig en beginnen de neuronen met elkaar te verbinden. Het neuronale netwerk blijft groeien en wordt complexer (figuur 2C). Bij 18 div zijn neuronen volwassen en onderling verbonden; het neuronale netwerk wordt gebouwd (figuur 2D). Zodra de synaptische stekels zijn gevormd en verbonden, zijn neuronen volledig gepolariseerd en drukken ze alle functionele en structurele eiwitten uit. Van de vele eiwitten die door volwassen gekweekte neuronen tot expressie worden gebracht, zijn hier de neuronale receptor NMDA (figuur 2E) en het synaptische eiwit PSD95 (figuur 2F) gekozen als representatieve markers. Bovendien is het mogelijk om axonen selectief te visualiseren door neurofilament (NF) te labelen (figuur 2G) en dendrieten te visualiseren door zich te richten op het MAP2-eiwit (figuur 2H).
Figuur 2: Tijdsverloop van de rijping van gedissocieerde celculturen van hippocampale neuronen. (A-D) Fasecontrastbeelden van hippocampale neuronen tijdens de eerste 18 dagen van de cultuur. (A) Neuronen op 1 div bij aanhechting aan het PLL-gecoate substraat. (B) De opkomst van kleine neurieten in neuronen bij 5 div. (C) Neuronen bij 11 div hebben lange neurieten ontwikkeld die verlengen en axonale kenmerken verwerven. (D) Neuronen op 18 div zijn volwassen en hebben een neuraal netwerk gevormd. Schaalbalk (A-D) = 40 μm. (E-H) Representatieve fluorescerende beelden gemaakt door confocale laserscanmicroscopie met behulp van selectieve markers om volwassen neuronen op 18 div te tonen. Neuronale culturen werden gefixeerd en immunostained met antilichamen die selectief kleuren voor (E) neuronale receptor (NMDAR), (F) synaptische marker (PSD95), (G) axonale marker (neurofilament, NF) en (H) dendritische marker (MAP2). Schaalbalk (E-H) = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Antilichamen in patiëntmonsters reageren met neuronale celoppervlakantigenen
De monsters (serum en CSF) verkregen van patiënten met anti-NMDAR-encefalitis bevatten auto-antilichamen die de NMDAR op het oppervlak van neuronen herkennen. Incubatie van de culturen met de patiëntmonsters produceert een intens fluorescentiesignaal op het celoppervlak en dendrieten (figuur 3A, C). Controlemonsters produceren daarentegen geen fluorescentiesignaal wanneer ze worden toegediend aan de neuronale culturen (figuur 3 B, D). Deze bevindingen laten zien hoe de culturen kunnen worden gebruikt om patiëntmonsters te screenen op antilichamen en kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe antilichamen die zich richten op het neuronale celoppervlak.
CSF-monster van de patiënt verlaagt de intracellulaire calciumconcentratie in NMDA-geïnduceerde culturen van hippocampale neuronen
Om het effect van de antilichamen van de patiënten op de neurale activiteit (na 24 uur behandeling) te evalueren, werden intracellulaire calciumtransiënten optisch gemonitord vanuit de gekweekte neuronen in realtime op NMDA-gemedieerde stimulatie. De toepassing van NMDA genereert een toename van de fluorescentie-intensiteit, zoals aangegeven door een verandering in de intracellulaire groene fluorescentie (figuur 4A en aanvullende video 1). Neuronen behandeld met het controle-liquormonster vertoonden een hoger verschil in fluorescentie-intensiteit (56%) wanneer de stimulator werd toegepast in vergelijking met de cellen die werden behandeld met het CSF-monster van de patiënt. De verschillen in fluorescentie-intensiteit werden gemeten en de NMDA-gemedieerde stimulatiecurven uit de gegevens geëxtraheerd uit de soma van de cellen werden vergeleken (figuur 4B, C). De stimulatiecurves laten zien dat er in beide scenario's een intracellulaire instroom van calcium was, maar de culturen die werden behandeld met de liquor van de patiënten (grijze lijn) vertoonden een lagere respons dan de met controle behandelde culturen (zwarte lijn). Deze resultaten tonen aan dat de antilichamen die aanwezig zijn in de liquor van de patiënten de cellulaire activiteit verminderen als gevolg van de interactie van de antilichamen met de NMDAR en dus een pathogeen effect veroorzaken.
Figuur 3: Antilichamen van patiënten reageren met het oppervlak van neuronale culturen. (A,E) Serum en CSF van patiënten met anti-NMDAR encefalitis reageren met het celoppervlak van levende hippocampale neuronen van ratten, (B,F), terwijl het serum en de liquor van controlepersonen geen reactiviteit vertonen. Schaalbalk (A,B,E,F) = 20 μm. Hogere vergrotingsafbeelding van een dendriet (63x) met het typische oppervlaktepatroon van reactiviteit voor (C, G) het serum en de liquor van de patiënt en (D, H) negatief voor controles. De beelden werden gemaakt met confocale laserscanmicroscopie. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Antilichamen van patiënten verminderen de calciuminstroom in rattenneuronen die GCaMP5G tot expressie brengen. (A) Toediening van stimulatieoplossing (NMDA [100 μM] + Glycine [1 μM]) in culturen van neuronen veroorzaakte een calciuminstroom, zoals aangegeven door toenemende intracellulaire groene fluorescentie (stimulatiepiek), vergeleken met het beeld dat vóór de stimulatie werd genomen (prestimulatie). Na 120 s neemt de fluorescentie-intensiteit af en stabiliseert (na stimulatie). Culturen behandeld met de liquor van de patiënten vertoonden een significante vermindering (56%) in de NMDA-gemedieerde calciumtoename in vergelijking met de liquor van de controlegroep. De beelden werden gemaakt door fluorescentiemicroscopie. Schaalbalk = 20 μm. (B) Een grafiek van een van de drie onafhankelijke experimenten die de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd (180 s) weergeven voor de culturen die worden behandeld met de liquor van de controle (zwarte lijn) en de liquor van de patiënt (grijze lijn) bij NMDA-stimulatie (blauwe pijl). n(Controls' CSF) = 20 cellen; n(CSF van patiënten) = 28 cellen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (C) Boxplots tonen de mediaan, 25e en 75e percentielen. Snorharen geven de minimum- en maximumwaarden aan. Beoordeling van significantie werd uitgevoerd door tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA; p < 0,0001) en Mann-Whitney U-tests (p < 0,0001). Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Video met twee hippocampale neuronen die GCaMP5G naast elkaar tot expressie brengen: neuron behandeld met de liquor van de controle (links) versus neuron behandeld met de liquor van patiënten (rechts). De toepassing van NMDAR (stimulatie) genereert in beide gevallen een toename van de intracellulaire fluorescentie-intensiteit, maar met een significant hoger niveau in het neuron dat wordt behandeld met de liquor van de controle dan het neuron dat wordt behandeld met de liquor van de patiënt. Beelden werden gemaakt door fluorescentiemicroscopie en bewerkt met ImageJ die de lookup table (LUT) Fire toepaste. 1700 frames (170 s); 5 keer versneld. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het groeiende veld van antilichaam-gemedieerde auto-immuniteit heeft een venster van mogelijkheden geopend voor de identificatie van neuronale auto-antilichamen die kunnen worden gebruikt om de diagnose en behandeling van patiënten te verbeteren. Culturen van hippocampusneuronen zijn een essentieel hulpmiddel voor de identificatie van antilichamen; daarom is het belangrijk om een gestandaardiseerd protocol uit te voeren om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De belangrijkste stappen om te overwegen, beperkingen en probleemoplossing worden hier besproken.
De kritieke stappen van dit protocol kunnen worden gegroepeerd in drie categorieën, afhankelijk van of ze de zuiverheid, de homogeniteit of de levensvatbaarheid van de hippocampusneuronen beïnvloeden.
Zuiverheid - Om optimale primaire celculturen te verkrijgen, moet de onderzoeker zelfverzekerd, getraind en in staat zijn om snel te werken, vooral om de tijd van de dissectie te minimaliseren. Zelfs als piramidale neuronen het belangrijkste celtype zijn, bevat de hippocampus een verscheidenheid aan interneuronen14. Om culturen met minimale gliacellen te genereren, moet de hippocampus worden geëxtraheerd met het minimale omliggende weefsel. Het gebruik van een zwarte achtergrond tijdens de dissectie helpt om de grenzen van de hippocampus onder de stereomicroscoop te identificeren. Bovendien moet er rekening mee worden gehouden dat lagere celdichtheden resulteren in minder paracriene ondersteuning en het moeilijker maken om de cultuur te behouden13. Het is dus belangrijk om deze balans in gedachten te houden. Dit is belangrijk in beeldvormingsstudies die een laag aantal cellen gebruiken (50.000 neuronen per schotel van 3,5 cm). Om extra tijd te hebben voor de hippocampusextractie, moeten Hibernate-media worden gebruikt die het weefsel behouden17. Werken met adequate chirurgische hulpmiddelen is ook essentieel. Zeer nauwkeurige gereedschappen zijn delicaat, dus de reproduceerbaarheid van de techniek moet worden gewaarborgd door ze zorgvuldig te beschermen.
Homogeniteit - Om een cultuur zonder celaggregaten te ontwikkelen, is de mechanische celdissociatie opgewaardeerd door het gebruik van een voorgetrokken glazen pipet te combineren met een standaard pipet van 1.000 μL.
Levensvatbaarheid - In dit protocol werden geen antibiotica toegevoegd omdat ze de neuronale prikkelbaarheid beïnvloeden en de elektrofysiologische eigenschappen van de gekweekte neuronen veranderen18. Daarom is besmetting zeer waarschijnlijk als de hoogste normen van steriliteit niet worden gehandhaafd. Temperatuur is ook een belangrijke factor. Het weefsel koud houden tijdens de hippocampusisolatie vertraagt het metabolisme en vermindert de celafbraak. Het weefsel werd daarom op ijs gehouden tot het celdissociatieproces. Bovendien is het cruciaal om de juiste balans te vinden tijdens de enzymatische celdissociatie die de cellen uitsplitst zonder duidelijke cellyse. In dit protocol zijn de timings van incubatie met trypsine en de daaropvolgende wasstappen geoptimaliseerd om individuele cellen te verkrijgen met voldoende ruimte om de creatie van een geschikt neuronaal netwerk mogelijk te maken.
Kritische stappen worden ook gevonden in fluorescerende live immunostaining en calciumactiviteitsregistraties van de neuronale culturen. Om succesvolle live immunostaining uit te voeren voor het bepalen van de aanwezigheid van antilichamen tegen celoppervlakeiwitten in patiëntmonsters, moet men permeabilisatie van de cellen vermijden die de antilichamen toegang geven tot intracellulaire eiwitten. Bovendien moeten op basis van de titer van de antilichamen de incubatietijd en de verdunning van het monster dienovereenkomstig worden aangepast (zeer hoge titerantistoffen kunnen bijvoorbeeld achtergrondkleuring geven die het interpreteren van de resultaten moeilijk maakt). Bij het uitvoeren van de pathogeniciteitsbeoordeling van de auto-antilichamen met calciumbeeldvorming, moet men een medium gebruiken dat optimaal is voor cellulaire activiteitsmetingen (bijv. Mg2 + -onderdrukking in het kweekmedium is belangrijk voor goede prestaties). Bovendien moeten voor fluorescentiebeeldvorming media met pH-indicatoren zoals fenolrood worden vermeden omdat het een niet-specifiek achtergrondsignaal introduceert.
Er zijn twee belangrijke beperkingen van het gebruik van hippocampus neuronale culturen. Ten eerste moeten in vergelijking met stabiele cellijnen continu primaire culturen worden gegenereerd, en dit impliceert het gebruik van proefdieren regelmatig. Geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSC) zouden de noodzaak voor het gebruik van diermodellen kunnen vervangen, maar de differentiatieprotocollen voor iPSC zijn nog steeds niet optimaal. Ten tweede drukken neuronen afgeleid van iPSC niet de volledige spectra van oppervlakte-eiwitten uit en daarom impliceert de afwezigheid van reactiviteit, indien gebruikt, niet noodzakelijkerwijs de negativiteit van het monster19.
Er zijn drie methoden om te screenen op de aanwezigheid van auto-antilichamen in het serum of csf van patiënten waarvan wordt vermoed dat ze AE hebben: weefselgebaseerde assay (TBA) met behulp van hersenweefsel van ratten, celgebaseerde assay (CBA) met BEHULP VAN HEK-cellen getransfecteerd om neuronale eiwitten tot expressie te brengen, en de toepassing die hier wordt gerapporteerd met behulp van levende culturen van hippocampale neuronen19. Het belang van de gekweekte hippocampusneuronmethode ligt in het vermogen om reactiviteit te differentiëren met oppervlakte- en intracellulaire antigenen die niet gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door TBA. Bovendien worden primaire neuronale culturen, in tegenstelling tot CBA in HEK-getransfecteerde cellen, niet beperkt door het repertoire van getransfecteerde eiwitten. Bovendien kunnen gekweekte hippocampusneuronen worden gebruikt om nieuwe antilichamen en hun doelantigenen te identificeren in combinatie met immunoprecipitatie en massaspectrometrie en daarom het spectrum van identificeerbare antilichamen verbreden. Ten slotte maakt het de beoordeling van de pathogene effecten van de auto-antilichamen mogelijk door middel van live beeldvormingsmethoden die veranderingen in cellulaire activiteit kunnen volgen. Kortom, de identificatie van nieuwe auto-antilichamen maakt het uiteindelijk mogelijk om specifieke immunotherapieën te starten om de resultaten voor patiënten te verbeteren.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann en Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) en Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp en Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universiteit van Barcelona) voor hun technische ondersteuning en voor het leveren van reagentia, en Josep Dalmau en Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universiteit van Barcelona) voor hun kritische beoordeling van het manuscript en mentorschap. Deze studie werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) en medegefinancierd door de Europese Unie, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programma voor Centres of Excellence in R&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programma en Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); en Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
