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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

मौखिक भोजन और माइक्रोइंजेक्शन द्वारा वयस्क मच्छरों में प्रायोगिक वायरल संक्रमण

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/63830
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यह पद्धति, जिसमें मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन संक्रमण शामिल था, आर्बोवायरस संक्रमण पर मिडगट और / या लार ग्रंथि बाधाओं के प्रभाव का प्रभावी ढंग से आकलन कर सकता है।

Abstract

मच्छर जनित वायरस (एमबीवी), जो कशेरुक के लिए संक्रामक रोगजनक हैं, कई मच्छर प्रजातियों द्वारा फैलते हैं, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए गंभीर खतरा पैदा करते हैं। एक बार निगलने के बाद, वायरस को हेमोलिम्फ तक पहुंचने के लिए मच्छर के मिडगट बैरियर को पार करना होगा, जहां से वे संभावित रूप से लार ग्रंथियों में फैल सकते हैं। जब एक मच्छर काटता है, तो ये वायरस नए कशेरुक मेजबानों में फैल जाते हैं। इसी तरह, मच्छर विभिन्न वायरस उठा सकता है। सामान्य तौर पर, वायरस का केवल एक छोटा सा हिस्सा आंत के माध्यम से लार ग्रंथियों में प्रवेश कर सकता है। ग्रंथियों में इन वायरस की संचरण दक्षता विभिन्न मच्छर प्रजातियों में पाए जाने वाले दो भौतिक अवरोधों से प्रभावित होती है: मिडगट बाधाएं और लार ग्रंथियां बाधाएं। यह प्रोटोकॉल मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन संक्रमण के बाद एडीज एजिप्टी की लार ग्रंथियों में वायरस का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह निर्धारित करना कि क्या आंत और / या लार ग्रंथियां वायरल प्रसार में बाधा डालती हैं, एडीज एजिप्टी द्वारा प्रेषित एमबीवी के जोखिम आकलन में सहायता कर सकती हैं।

Introduction

मच्छर-जनित वायरस (एमबीवी), आरएनए वायरस का एक विषम समूह, मच्छर वैक्टर में बना रह सकता है और बाद मेंकशेरुक मेजबानों में फैल सकता है। नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण एमबीवी मुख्य रूप से चार वायरस परिवारों में वितरित किए जाते हैं, अर्थात् फ्लेविविरिडे, टोगाविरिडे, रिओविरिडे और पेरिबुनेविडे 2,3। हाल के दशकों में, इन वायरस को दुनिया भर में रिपोर्ट किया गया है, जिससे सार्वजनिक स्वास्थ्य के मुद्दे पैदा हुए हैं। सबसे प्रसिद्ध एमबीवी में से एक के रूप में, डेंगू वायरस (डीईएनवी) पिछले 20वर्षों के दौरान 100 से अधिक देशों में सबसे प्रचलित उभरता हुआ या फिर से उभरता हुआ अर्बोवायरस बन गया है। जीका वायरस (जेडआईकेवी) अंतर्देशीय की खोज के बाद से, महाद्वीप के लगभग सभी उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय देशों और क्षेत्रों ने मानव जेडआईकेवी संक्रमण की सूचना दीहै। वायरस संचरण के जोखिम का आकलन करने के लिए, हाल के वर्षों में कई अध्ययनों ने इन वायरस 6,7 के लिए मच्छर वेक्टर क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है। नतीजतन, वेक्टर जनित रोगों को प्रभावी ढंग से रोकना और नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है।

प्रयोगशाला में सबसे आसानी से पाले जाने वाले मच्छरों में से एक एडीज एजिप्टी (एई एजिप्टी) डीईएनवी, जेडआईकेवी, चिकनगुनिया वायरस (चिक्व), और पीले बुखार वायरस (वाईएफवी) 8 का एक महत्वपूर्ण वेक्टर है। लंबे समय तक, एई एजिप्टी केवल अफ्रीकी महाद्वीप और दक्षिण पूर्व एशिया में पाया जाता था, लेकिन हाल के वर्षों में इसने लगभग सभी महाद्वीपोंको उपनिवेश ति किया है। इसके अलावा, एई एजिप्टी की वैश्विक बहुतायत लगातार बढ़ रही है, सदी 10 के अंत तक अनुमानित20% की वृद्धि के साथ। चीन में 2004 से 2009 तक, उच्च दिन-प्रतिदिनके तापमान के कारण डीईएनवी के लिए एई एजिप्टी वेक्टर क्षमता में स्पष्ट वृद्धि हुई थी। रोगजनक वेक्टर के रूप में एई एजिप्टी की स्थिति चीन में काफी बढ़ गई है। नतीजतन, इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, वायरस को प्रसारित करने के लिए एई एजिप्टी की वेक्टर क्षमता की जांच करना आवश्यक है।

हेमेटोफैगस आर्थ्रोपोड के रूप में, मादा मच्छर एक कशेरुक मेजबान की त्वचा को छेदती है और रक्त पर फ़ीड करती है। मच्छर कभी-कभी वायरस से संक्रमित मेजबानों से वायरस प्राप्त करते हैं और फिर वायरस को एक नए मेजबान में स्थानांतरित करते हैं। जैसे, वेक्टर क्षमता निर्धारित करने के लिए, मच्छरों को प्रयोगशाला सेटिंग12 में एक फीडिंग सिस्टम के माध्यम से आर्बोवायरस युक्त कृत्रिम ब्लडमील खिलाया जाता है। संक्रमण के कई दिनों बाद व्यक्तिगत मच्छरों को सिर, शरीर और लार के स्राव में अलग किया जाता है। वायरस संक्रमण, प्रसार और संचरण दर को मापने के लिए, वायरस टिटर्स का पता मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या पट्टिका परख द्वारा लगाया गया है। हालांकि, सभी मच्छर मिडगट संक्रमण विकसित नहीं करते हैं और रक्त खिलाने के बाद वायरस को अगले मेजबान में स्थानांतरित करने की क्षमता रखते हैं। यह मच्छरों की शारीरिक बाधाओं से जुड़ा हुआ है, जो रोगजनकों को शरीर में प्रवेश करने से रोकते हैं और उनकी जन्मजात प्रतिरक्षामें महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मिडगट बैरियर, विशेष रूप से मिडगट संक्रमण बाधा (एमआईबी) और मिडगट एस्केप बैरियर (एमईबी), प्रभावित करते हैं कि क्या वायरस वेक्टर को व्यवस्थित रूप से संक्रमित कर सकता है और जिस दक्षता के साथ यह फैलता है। यह अन्य ऊतकों के संक्रमण के विश्लेषण में बाधा डालता है, जैसे लार ग्रंथियां जो लार ग्रंथि संक्रमण भी प्रदर्शित करती हैं और बाधाओं से बचती हैं13,14. वेक्टर में मिडगट्स और लार ग्रंथियों के संक्रमण को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए, एई एजिप्टी में अर्बोवायरस के मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक टीकाकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के मच्छर वैक्टर में अतिरिक्त अर्बोवायरस संक्रमण पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि एडीज एसपीपी में डीईएनवी और जेडआईकेवी संक्रमण, और एक व्यावहारिक प्रक्रिया साबित हो सकती है।

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Protocol

1. वायरस और मच्छरों की तैयारी

  1. वायरस की तैयारी
    नोट: सभी प्रक्रियाओं को एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में किया गया था। उपयोग किए जाने वाले जैव सुरक्षा नियंत्रण का स्तर रोगज़नक़ के जोखिम मूल्यांकन और राष्ट्रों और क्षेत्रों के लिए विशिष्ट नियमों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रक्रिया को जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
    1. टी 75 कल्चर फ्लास्क में 1 x 10 6सी 6 /36 कोशिकाओं को टीका लगाएं। फ्लास्क को रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम के 10 एमएल से भरें जिसमें 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) शामिल हैं।
      नोट: लीबोविट्ज़ के एल -15 माध्यम (एल 15) या डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) का उपयोग सी 6/36 कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए भी किया जा सकता है।
    2. कोशिकाओं को रात भर 28 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में बनाए रखें और अगले दिन सेल सुपरनैटेंट को हटा दें जब कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंट हों।
    3. फ्लास्क में 1 एमएल वायरस कमजोर पड़ने (संक्रमण की बहुलता (एमओआई) = 0.01) जोड़ें और 28 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एबिनुर लेक वायरस (ईबीआईवी)15, एक मच्छर जनित ऑर्थोबुन्यावायरस, इस प्रोटोकॉल के लिए एक मॉडल वायरस के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
    4. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 5 एमएल पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें। फ्लास्क को 2% एफबीएस के साथ 15 एमएल नए आरपीएमआई माध्यम से भरें। फ्लास्क को 28 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में बनाए रखें।
    5. आवश्यक वायरल टिटर तक पहुंचने पर सुपरनैटेंट युक्त वायरस एकत्र करें (लगभग 5 दिनों के बाद, उपयोग किए गए वायरस के आधार पर)। EBIV के लिए, यह टिटर मान 107 पट्टिका बनाने वाली इकाइयाँ (PFU)/mL था। उन्हें अलग-अलग 2 एमएल स्क्रू कैप स्टोरेज ट्यूबों में उप-पैकेज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर 0.5-1 एमएल वायरस वाले ट्यूबों को स्टोर करें।
  2. वायरल टिटर का निर्धारण
    नोट: पट्टिका परख16 के माध्यम से वायरल टिटर निर्धारित करें। बीएचके -21 का उपयोग संक्रमित कोशिकाओं में देखे गए स्पष्ट साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के कारण ईबीआईवी के वायरल टिटर को निर्धारित करने के लिए किया गया था।
    1. 24-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 1 x 105 बीएचके -21 कोशिकाओं को टीका लगाएं। प्रत्येक कुएं को 10% FBS और 1% P/S युक्त DMEM माध्यम के 1 mL से भरें। कोशिकाओं को रात भर 37 °C पर 5%CO2 में बनाए रखें।
    2. ताजा डीएमईएम माध्यम के साथ वायरस युक्त सुपरनैटेंट के छह (10-6) लगातार 10 गुना कमजोर पड़ने वाले 10% एफबीएस और 1% पी / एस युक्त बनाएं।
    3. मोनोलेयर बीएचके -21 युक्त 24-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 100 μL वायरस डिल्यूनेट जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद वायरस को हटा दें। प्रत्येक कुएं में 1.5% मिथाइलसेल्यूलोज युक्त डीएमईएम के 500 μL जोड़ें।
    4. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में कल्चर कोशिकाएं (ईबीआईवी के लिए 48 घंटे के बाद स्पष्ट सीपीई पाया गया था)। 3.7% फॉर्मलाडेहाइड के 750 μL के साथ रात भर कोशिकाओं को ठीक करें।
    5. उन्हें 15 मिनट के लिए 2% क्रिस्टल वायलेट के 200 μL के साथ दाग दें। वायरल टिटर की गणना करने के लिए सजीले टुकड़े की संख्या की गणना करें।
  3. लैब में मच्छरों का प्रजनन
    नोट: आर्थ्रोपोड नियंत्रण स्तर 1 (एसीएल -1) प्रयोगशाला में मच्छरों को पालें।
    1. डीक्लोरीनयुक्त पानी की तैयारी के लिए, नल के पानी के साथ 20 एल बाल्टी भरें और इसे प्रकाश के बिना 7-8 दिनों तक खड़े रहने दें। ढक्कन को कवर न करें।
    2. एजिप्टी के अंडे और लार्वा को निम्नलिखित स्थितियों के साथ एक मच्छर के कमरे में रखें: 28 ± 1 डिग्री सेल्सियस 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र और 75% ± 5% की सापेक्ष आर्द्रता के साथ।
    3. अंडे से निकलने के बाद डीक्लोरीनयुक्त पानी वाले उथले डिश (22 सेमी x 15 सेमी x 6 सेमी) में लगभग 1,000 लार्वा बनाए रखें। उन्हें लगभग 1/8 चम्मच चूहों के फीडस्टफ पाउडर के साथ खिलाएं। भोजन को रोजाना ताज़ा करें और हर 2 दिनों में पानी बदलें।
    4. एक बार जब लार्वा 5-7 दिनों के बाद सूख जाता है, तो प्यूपे को डीक्लोरीनेटेड पानी से भरे प्लास्टिक कप (7 औंस) में स्थानांतरित करने के लिए एक-ऑफ ड्रॉपर का उपयोग करें।
    5. एक जाल पिंजरे (30 सेमी x 30 सेमी x 30 सेमी) में प्यूपे युक्त पांच कप (लगभग 200 प्रति कप) डालें और पिंजरों को कीट इनक्यूबेटर में चरण 1.3.2 के समान स्थितियों के साथ रखें।
    6. वयस्क मच्छरों को खिलाने के लिए प्रत्येक जाल पिंजरे पर 8% (एम / डब्ल्यू) ग्लूकोज समाधान युक्त एक छोटा स्पंज डालें। वयस्क उभरने के बाद, कप को बिना प्यूपे के बाहर निकालें। एक ही कीट इनक्यूबेटर में प्रति पिंजरे लगभग 1,000 वयस्क मच्छरों के साथ जाल पिंजरे रखें।

2. मौखिक संक्रमण के लिए तैयारी

  1. मादा मच्छरों को मौखिक संक्रमण के लिए तैयार करें। 5-8 दिन पुराने मच्छरों को इकट्ठा करने के लिए मच्छर ों को अवशोषित करने वाली मशीन का उपयोग करें। उन्हें 1 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एनेस्थेटकरें और यह देखने के लिए जांचें कि क्या मच्छर चक्कर खा रहे हैं। यदि नहीं, तो उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर एक और मिनट के लिए एनेस्थेटकरें।
  2. उन्हें प्लास्टिक के कप (24 औंस) में लगभग 200 मच्छरों (मादा और पुरुष) प्रति कप पर जल्दी से डालें। प्रत्येक कप को एक अच्छी तरह से कटे हुए मच्छरदानी के साथ जल्दी से कवर करें, इसके बाद बीच में एक छेद (लगभग 6 सेमी व्यास) के साथ एक ढक्कन लगाएं।
  3. मौखिक-संक्रमण से पहले मच्छरों को 24 घंटे तक भूखा रखें और निम्नानुसार संक्रामक रक्त भोजन तैयार करें।
  4. बीएसएल -2 स्थितियों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से वायरस स्टॉक को बाहर निकालें और उन्हें बर्फ पर पिघलाएं। वायरस स्टॉक को 2 x 106 पीएफयू / एमएल की एकाग्रता तक आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ पतला करें जिसमें 10% एफबीएस और 1% पी / एस होता है।
    नोट: प्रक्रियाओं को एसीएल -2 प्रयोगशाला में एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया गया था।

3. मौखिक संक्रमण करें

नोट: सभी चरण ों को एसीएल -2 प्रयोगशाला में किया गया था। मच्छरों को भागने से रोकने के लिए प्रक्रिया को दस्ताने बॉक्स में किया जाना चाहिए।

  1. 1 घंटे के लिए कृत्रिम मच्छर आहार प्रणाली का उपयोग करके कृत्रिम भोजन करें।
    1. कोलेजन झिल्ली को उचित आकार (लगभग 5 सेमी व्यास) में काटें, उन्हें ओ-रिंग के साथ जलाशयों में सुरक्षित करें, फिर जलाशयों में वायरस-रक्त मिश्रण (लगभग 3 एमएल) जोड़ें। जलाशयों को सील करने और रिसाव को रोकने के लिए प्लास्टिक प्लग का उपयोग करें।
      नोट: ये चरण एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए गए थे।
    2. मच्छरों वाले प्लास्टिक के कप (24 औंस) को दस्ताने के बॉक्स में डालें। एफयू 1 फीडर पर सील किए गए जलाशयों को पेंच करें और एक कप पर एक जलाशय डालें, फिर बिजली इकाई चालू करें। मच्छरों को 1 घंटे तक खिलाएं
  2. मच्छरों को सीओ2 द्वारा कई सेकंड के लिए एनेस्थेटाइज्ड करें जब तक कि वे बेहोश न हो जाएं। संक्षेप में, कार्बन डाइऑक्साइड स्प्रे गन को मच्छरों वाले कप पर छेद के माध्यम से नेट जाल के बीच में रखें, मूल्य खोलें, और मच्छरों को एनेस्थेटाइज करने के लिए भारी मात्रा में कार्बन डाइऑक्साइड को बाहर निकलने की अनुमति दें।
  3. उन्हें बर्फ पर रखे पेट्री डिश में डालें और ढक्कन को जल्दी से कवर करें। रेंगने वाली मादा मच्छरों को बलपूर्वक चुनें। पहचान करने के लिए, पुरुषों में पंख वाले एंटीना होते हैं और महिलाओं के पास सादे एंटीना होते हैं। उन्हें प्रति कप 50 मादा मच्छरों पर नए प्लास्टिक कप में स्थानांतरित करें।
    नोट: मादा मच्छरों को स्थिरता बनाए रखने के लिए चुना गया था क्योंकि भोजन की मात्रा वायरल सामग्री को प्रभावित करती है।
  4. कप को कटे हुए मच्छरदानी जाल के साथ लपेटें और फिर इसे बीच में एक छेद के साथ ढक्कन से ढक दें। स्पंज को एक छोटे टुकड़े में काटें और इसे कप पर रखें।
  5. प्लास्टिक डिस्पोजेबल ड्रॉपर का उपयोग करके स्पंज पर 8% ग्लूकोज समाधान जोड़ें। मादा मच्छरों वाले कप को 10 दिनों के लिए 80% आर्द्रता पर 27 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। हर 72 घंटे में एक नया ग्लूकोज-संतृप्त स्पंज बदलें।

4. इंट्राथोरेसिक टीकाकरण के लिए तैयारी

  1. माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को निम्नानुसार तैयार करें। सुई खींचने वाले प्रोग्राम में निम्नलिखित मापदंडों के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई (चित्रा 1 ए) बनाने के लिए पीयूएल -1000 का उपयोग करें: गर्मी सूचकांक = 450, बल (जी) = 110, दूरी (मिमी) = 1.00, और देरी (एस) = 0।
  2. 16x आवर्धन पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे चिमटी के साथ खींची गई सुई की नोक को काटें (चित्र 1 बी)। टिप को ज्यादा बड़ा न बनाएं, नहीं तो यह मच्छरों को नुकसान पहुंचा सकता है।
  3. चरण 2.1 के रूप में मादा मच्छरों को तैयार करें।
    नोट: एसीएल -2 प्रयोगशाला में निम्नलिखित प्रक्रियाएं की गईं।
  4. संक्रामक वायरस को कमजोर करने की तैयारी निम्नानुसार करें:
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से वायरस स्टॉक निकालें और उन्हें बर्फ पर पिघलाएं। 100 nL वायरस को पतला करें जिसमें RPMI 1640 माध्यम के साथ 100-500 PFU वायरस होता है जिसमें 10% FBS और 1% P / S होता है।
  5. एक डिस्पोजेबल बाँझ सिरिंज के माध्यम से खनिज तेल के साथ सुई को बैकफिल करें। मशीन पर निर्देश के बाद इंजेक्टर में सुई संलग्न करें।
  6. सुई को एक ट्यूब में डालें जिसमें संक्रामक वायरस कमजोर पड़ता है। सुई की नोक न तोड़ें। वायरस समाधान के साथ सुई भरने के लिए FILL बटन दबाएं। सुई में वायरस समाधान की अंतिम मात्रा लगभग 4.0 μL है। एक बार जब सुई वायरस से भर जाती है, तो सावधान रहें कि इसे स्पर्श और नुकसान न पहुंचे।
    नोट: चरणों को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया गया था।

5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत वायरल इंजेक्शन करें

नोट: सभी चरण ों को एसीएल -2 प्रयोगशाला में किया गया था।

  1. 1 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मच्छरों को एनेस्थेटाइज करें। उन्हें बर्फ पर रखे पेट्री डिश में डालें और ढक्कन को जल्दी से कवर करें।
  2. चिमटी के साथ लगभग 50 मादा मच्छरों को चुनें और उन्हें बर्फ की प्लेट पर रखें। इंजेक्टर के नीचे बर्फ की प्लेट रखें और सुई को विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 सी) के तहत मच्छर के वक्ष गुहा में डालें।
  3. इंजेक्शन की मात्रा को 100 nL पर सेट करें और 50 nL / s तक रेट करें। वायरस के घोल को मच्छर में प्रवाहित करने के लिए इंजेक्शन बटन दबाएं। यदि सफल इंजेक्शन होता है, तो पेट थोड़ा उभार होगा।
  4. संक्रमित मच्छर को बर्फ पर रखे एक नए प्लास्टिक कप (24 औंस) में डालें। जब संक्रमित मच्छरों की संख्या पर्याप्त हो जाए, तो कप को कटे हुए मच्छरदानी जाल से लपेटें और फिर इसे ढक्कन से ढक दें।
  5. संक्रामक मच्छरों वाले कप को 10 दिनों के लिए 80% आर्द्रता पर 27 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। चरण 3.5 के रूप में मच्छरों को खिलाएं।

6. संक्रमित मादा मच्छरों का प्रसंस्करण

नोट: प्रत्येक मादा मच्छर से तीन अलग-अलग ऊतकों / अंगों को विच्छेदित किया गया था: वायरस संक्रमण दर (वीआईआर) की गणना के लिए आंत, वायरस प्रसार दर (वीडीआर) की गणना के लिए सिर, और वायरस संचरण दर (वीटीआर) की गणना के लिए लार। वीआईआर को वायरस-पॉजिटिव हिम्मत वाले मच्छरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था। वीडीआर को वायरस-पॉजिटिव सिर वाले मच्छरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसे वायरस-पॉजिटिव आंत वाले मच्छरों की संख्या से 100 से विभाजित किया गया था। वीटीआर को वायरस-पॉजिटिव लार वाले मच्छरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसे वायरस-पॉजिटिव आंत वाले मच्छरों की संख्या से 100 से विभाजित किया गया था।

  1. संक्रमित मादा मच्छरों से लार का संग्रह
    नोट: प्रक्रियाओं को एसीएल -2 प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए।
    1. चरण 3.2 के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड एनेस्थेटाइजेशन द्वारा संक्रमित मादा मच्छरों को एनेस्थेटाइजेशन करें। उन्हें बर्फ पर रखे पेट्री डिश में डालें और ढक्कन को जल्दी से बंद करें।
    2. रबर मिट्टी पर विसर्जन तेल से भरे 10 μL पिपेट युक्तियाँ रखें।
    3. चिमटी के साथ मादा मच्छरों को चुनें और उन्हें बर्फ की प्लेट पर रखें। चिमटी से उनके पैर और पंख हटा दें। प्रत्येक पिपेट की नोक पर एक मच्छर के मुंह के हिस्से को रखें।
    4. कमरे के तापमान पर अगले 45-60 मिनट के लिए मच्छरों द्वारा तेल में स्रावित लार को इकट्ठा करें।
    5. पिपेट युक्तियों को 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें जिसमें 200 μL वायरस डिल्यूएंट माध्यम (RPMI 1640 माध्यम जिसमें 10% FBS और 1% P / S होता है)। उन्हें ट्यूबों में लार को बाहर निकालने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। ट्रांसमिशन दरों के बाद के निर्धारण के लिए इन ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. संक्रमित मादा मच्छरों का विच्छेदन
    नोट: प्रक्रियाओं को एसीएल -2 प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए।
    1. लार संग्रह के बाद मादा मच्छरों के सिर को काटने के लिए चिमटी का उपयोग करें। प्रत्येक सिर को एक अलग ट्यूब में रखें जिसमें आरपीएमआई 1640 माध्यम के 200 μL हों।
    2. एक चिमटी के साथ वक्ष को पकड़ें, फिर एक और चिमटी के साथ पेट के अंतिम भाग को पकड़ें और इसे बाहर निकालें। आंत को बाहर निकाला जाएगा। किसी भी आवारा ऊतक और अंगों की खींची गई आंत को साफ करें।
    3. पीबीएस के साथ आंत को धोएं और प्रत्येक आंत को एक व्यक्तिगत ट्यूब में रखें जिसमें आरपीएमआई 1640 माध्यम के 200 μL हों। वायरस संक्रमण दर और प्रसार दर के बाद के निर्धारण के लिए इन ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. डेटा विश्लेषण

  1. आरएनए निष्कर्षण
    1. ऊतकों को निम्न मापदंडों पर सेट कम तापमान ऊतक होमोजिनाइज़र पीसने की मशीन के साथ टुकड़ों में पीस लें: ऑपरेटिंग आवृत्ति = 60 हर्ट्ज, ऑपरेशन समय = 15 एस, विराम समय = 10 एस, चक्र = 2, और सेटिंग तापमान = 4.0 डिग्री सेल्सियस।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। उपकरण निर्देशों का पालन करते हुए स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रणाली द्वारा प्रत्येक नमूने के कुल आरएनए को निकालें।
  2. QRT-PCR का प्रदर्शन
    1. मात्रात्मक पीसीआर उपकरण17 का उपयोग करके वायरल आरएनए प्रतियों को निर्धारित करने के लिए एक-चरण आरटी-पीसीआर किट का उपयोग करें। EBIV S सेगमेंट F का पता लगाने के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करें: ATGGCATCACCTGGAAG और R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA। प्रतिक्रिया प्रक्रिया को इस प्रकार सेट करें: चरण 1: 5 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 5 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 20 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
    2. कोशिकाओं पर लगाए गए सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने के माध्यम से कोशिकाओं में संक्रमण के लिए सबसे कम वायरस खुराक निर्धारित करें। चरण 1.2 में वर्णित 10-7 तक कमजोर पड़ने का उपयोग करके, ईबीआईवी की सबसे कम वायरस खुराक निर्धारित करने के लिए बीएचके - 21 कोशिकाओं का उपयोग करें।
    3. QRT-PCR द्वारा सबसे कम वायरस खुराक के सीटी मान की गणना करें। QRT-PCR द्वारा EBIV-पॉजिटिव के लिए कटऑफ मान का उपयोग < 35 के रूप में करें। प्रत्येक नमूने में EBIV की प्रतियों की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      y = -4.0312x + 3.384 [x = log (EBIV की प्रतियां), y = Ct मान, R2 = 0.9905]
    4. संक्रमण दर, प्रसार दर और संचरण दर की गणना निम्नानुसार करें:
      संक्रमण दर (%) = 100 x (वायरस पॉजिटिव मच्छर की आंत / कुल मच्छरों की संख्या)
      प्रसार दर (%) = 100 x (वायरस पॉजिटिव मच्छर के सिर की संख्या / वायरस पॉजिटिव मच्छर की आंत की संख्या)
      संचरण दर (%) = 100 x (वायरस पॉजिटिव मच्छर लार की संख्या / वायरस पॉजिटिव मच्छर के गले की संख्या)
    5. कई तुलनाओं के लिए गैर-पैरामीट्रिक क्रुस्कल-वालिस विश्लेषण और फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके निरंतर चर और मच्छर संक्रमण दर, प्रसार दर और संचरण दर में अंतर का विश्लेषण करें।

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Representative Results

कृत्रिम रक्त आहार (वायरल अंतिम टिटर 6.4 x 106 पीएफयू / एमएल) और इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन (वायरल खुराक 340 पीएफयू था) के माध्यम से संक्रमित मच्छरों में ईबीआईवी वितरण की जांच करने के लिए, संक्रमण (डीपीआई) के 10 दिनों के बाद मच्छरों के लार, सिर और आंत में वायरल आरएनए निर्धारित किए गए थे।

एजिप्टी के लिए, इंट्राथोरैसिक रूप से टीका लगाए गए मादा मच्छरों की आंत, सिर और लार में ईबीआईवी का वायरस टिटर मौखिक रूप से संक्रमित मादा मच्छरों की तुलना में बहुत अधिक था (चित्रा 2 ए-सी)। इंट्राथोरेसिक रूप से टीका लगाए गए मादा मच्छरों के लिए संक्रमण दर और प्रसार दर 100% थी, लेकिन मौखिक रूप से संक्रमित मादा मच्छरों के लिए क्रमशः 70% और 38.1% थी (चित्रा 2 डी, ई)। इंट्राथोरैसिक रूप से टीका लगाए गए मादा मच्छरों के लिए संचरण दर 90% तक पहुंच गई, लेकिन मौखिक रूप से संक्रमित मादा मच्छरों के लिए केवल 4.8% थी। इसने संकेत दिया कि एई एजिप्टी की आंत में वायरस संचरण के लिए एक मजबूत निरोधात्मक प्रभाव था।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोपिपेट टिप और इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन का योजनाबद्ध । (ए) टिप को तोड़ने से पहले माइक्रोपिपेट टिप खींचा गया। (बी) इंट्राथोरेसिक टीकाकरण के लिए उपयुक्त माइक्रोपिपेट टिप। (सी) मच्छरों के लिए इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन का योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक टीकाकरण के माध्यम से वयस्क मच्छरों की वेक्टर क्षमता। संक्रमित मादा मच्छरों को 10 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। पी मान ≤ 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। गैर-पैरामीट्रिक क्रुस्कल-वालिस विश्लेषण का उपयोग कई तुलनाओं और फिशर के सटीक परीक्षण के लिए किया गया था जहां उपयुक्त था। यह आंकड़ा ज़िया एट अल .18 द्वारा अध्ययन से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पद्धति का लक्ष्य मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक टीकाकरण के माध्यम से वेक्टर क्षमता का मूल्यांकन करके एक मच्छर जनित वायरस का व्यापक जोखिम मूल्यांकन प्रदान करना था।

मौखिक-भोजन प्रयोग में, रेंग-मच्छरों को बाहर निकालने और एक नए कंटेनर में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, जिससे ऑपरेटरों के लिए एक गंभीर जोखिम पैदा होता है। इसका कारण यह है कि असंक्रमित मच्छरों सहित कोई भीमच्छर संक्रमण का स्रोत हो सकता है। नतीजतन, मच्छरों को पहले एनेस्थेटाइज्ड किया जाना चाहिए, जैसा कि प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट किया गया है, और फिर अनुवर्ती चरण किए जाने चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रेंगने वाले मच्छरों का चयन करना और उन्हें स्थानांतरित करना एक सीलबंद दस्ताने बॉक्स में किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के दौरान दस्ताने बॉक्स को बंद रखें जब तक कि बॉक्स में स्वतंत्र रूप से चलने वाले मच्छर न हों।

संक्रमण प्रयोग में, दो व्यक्तियों के लिए एक साथ काम करना बेहतर होता है, और दो लोगों द्वारा पुष्टि करने के बाद कि एक ही समय में कोई बचने वाले मच्छर नहीं हैं, वे संक्रमित मच्छरों को भागने से रोकने के लिए दस्ताने बॉक्स खोल सकते हैं। यदि कोई पलायन होता है, तो उन मच्छरों को मार दिया जाना चाहिए या फिर से पकड़ लिया जाना चाहिए। संक्रमित मच्छरों को नंगे हाथों से मारने की सिफारिश नहीं की जाती है। वैक्यूम एस्पिरेटर या अन्य उपयुक्त उपकरणों (जैसे, फोर्स, पेंटब्रश, ग्लव्ड हैंड) का उपयोग करके ऑपरेटरों के संक्रमण जोखिम को कम किया जा सकता है। प्रयोग के बाद, दस्ताने बॉक्स के अंदर और वर्कबेंच की सतह को पारंपरिक कीटाणुनाशक के साथ कीटाणुरहित करें।

मच्छर जनित वायरस के लिए मच्छर वेक्टर क्षमता के बारे में अधिकांश शोध पूरी तरह से मौखिक संक्रमण20,21 पर केंद्रित है। मौखिक संक्रमण के लिए, वायरस को लार14 में जारी करने के लिए मिडगट और लार ग्रंथियों से जुड़े कई ऊतक बाधाओं को दूर करना चाहिए। इस प्रयोग में मच्छर वेक्टर क्षमता पर मिडगट ग्रंथि और लार ग्रंथि के प्रभाव का प्रदर्शन नहीं किया गया था। जब मौखिक भोजन और इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन को जोड़ा जाता है, तो विभिन्न ऊतक बाधाओं का पूरी तरह से मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के परिणामों के अनुसार, एई एजिप्टी की आंत वायरस के लिए वेक्टर क्षमता में एक प्रमुख भूमिका निभाती है और लार ग्रंथि बाधा मौजूद नहीं हो सकती है (चित्रा 2)। इसके लिए, हमारा प्रोटोकॉल अर्बोवायरस संक्रमण के लिए मिडगट या लार ग्रंथि बाधाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए फायदेमंद है।

कार्यप्रणाली के अनुसार, नमूनों में केवल वायरल आरएनए की पहचान की गई थी। अन्य जांच, जैसे कि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ वायरियन को देखना, प्लाक परख का उपयोग करके संक्रमण की पुष्टि करना, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के साथ वायरल प्रोटीन का पता लगाना, विभिन्न नमूनों में संक्रामक वायरस की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं। इस पद्धति को संशोधित किया जा सकता है और मच्छर वैक्टर की एक विस्तृत श्रृंखला में रुचि के अतिरिक्त वायरस को टीका लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को वुहान विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (2018201261638501) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aedes aegypti  Rockefeller strain
Automated nucleic acid extraction system  NanoMagBio S-48
BHK-21 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Buckets
C6/36 cells  National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Carbon dioxide spray gun  wuhan Yihong YHDFPCO2
Centrifugal machine Himac  CF16RN
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad CFX96 Touch
Ebinur Lake virus Cu20-XJ isolation
Formaldehyde  Wuhan Baiqiandu B0003
Glove box 
Glucose Hushi 10010518
Immersion oil  Cargille 16908-1
Insect incubator Memmert HPP750T7
Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine  Servicebio KZ-III-F
Magnetic Virus Genome Extraction Kit NanoMagBio NMG0966-16
mesh cages (30 x 30 x 30 cm) Huayu HY-35
methylcellulose Calbiochem 17851
mice feedstuff powder  BESSN BS018
Microelectrode Puller WPI PUL-1000 PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.
Mosquito net meshes 
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond 3-000-207
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit  Takara RR096A
PBS, pH 7.4 Gibco C10010500BT
Penicillin/streptomycin Gibco 151140-122
Petri dishes 
Plastic cupes (7 oz)  Hubei Duoanduo
Plastic cups (24 oz)  Anhui shangji PET32-Tub-1
Plastic disposable droppers Biosharp BS-XG-O3L-NS
Refrigerator (-80 °C) sanyo MDF-U54V
Replacement Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
RPMI medium 1640  Gibco C11875500BT
Screw cap storage tubes (2 mL ) biofil  FCT010005
Shallow dishes 
Sponge
Sterile defibrillated horse blood Wuhan Purity Biotechnology CDHXB413
T75 culture flask Corning 430829
The artificial mosquito feeding system  Hemotek Hemotek PS6
The dissecting microscope  ZEISS  stemi508
The ice plates
The mosquito absorbing machine  Ningbo Bangning
The pipette tips  Axygen TF
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Tweezers Dumont 0203-5-PO

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References

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मौखिक भोजन और माइक्रोइंजेक्शन द्वारा वयस्क मच्छरों में प्रायोगिक वायरल संक्रमण
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Wang, F., Yang, C., Wang, S., Wu,… More

Wang, F., Yang, C., Wang, S., Wu, Q., Ochieng, C., Yuan, Z., Xia, H. Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection. J. Vis. Exp. (185), e63830, doi:10.3791/63830 (2022).

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