Summary
Эта методология, которая включала пероральное кормление и инфекцию внутригрудных инъекций, могла эффективно оценить влияние барьеров средней кишки и/или слюнных желез на арбовирусную инфекцию.
Abstract
Вирусы, переносимые комарами (MBV), которые являются инфекционными патогенами для позвоночных, распространяются многими видами комаров, представляя серьезную угрозу для здоровья населения. После попадания в организм вирусы должны преодолеть барьер средней кишки комара, чтобы достичь гемолимфы, откуда они потенциально могут распространиться на слюнные железы. Когда комар кусает, эти вирусы распространяются на новых позвоночных хозяев. Точно так же комар может подхватывать разные вирусы. Как правило, только крошечная часть вирусов может проникать в слюнные железы через кишечник. На эффективность передачи этих вирусов в железы влияют два физических барьера, обнаруженных у разных видов комаров: барьеры средней кишки и барьеры слюнных желез. Этот протокол представляет собой метод обнаружения вируса в слюнных железах Aedes aegypti после перорального кормления и внутригрудной инъекционной инфекции. Кроме того, определение того, препятствуют ли кишки и/или слюнные железы распространению вируса, может помочь в оценке риска MBV, передаваемых Aedes aegypti.
Introduction
Переносимые комарами вирусы (MBV), гетерогенная группа РНК-вирусов, могут сохраняться в комарах-переносчиках и впоследствии распространяться на позвоночныххозяев1. Клинически значимые MBV в основном распространены в четырех семействах вирусов, а именно Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae и Peribunyavividae 2,3. В последние десятилетия эти вирусы были зарегистрированы по всему миру, вызывая проблемы общественного здравоохранения. Будучи одним из наиболее известных МБВ, вирус денге (DENV) стал наиболее распространенным возникающим или вновь возникающим арбовирусом в более чем 100 странах за последние 20 лет4. С момента обнаружения вируса Зика (ZIKV) внутри страны почти все тропические и субтропические страны и территории континента сообщили о случаях инфицирования людей вирусом ZIKV5. Чтобы оценить риск передачи вируса, многочисленные исследования в последние годы были сосредоточены на компетентности комаров-переносчиков этих вирусов 6,7. В связи с этим крайне важно эффективно предотвращать трансмиссивные болезни и бороться с ними.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), один из комаров, которых легче всего выращивать в лаборатории, является важным переносчиком DENV, ZIKV, вируса чикунгунья (CHIKV) и вируса желтой лихорадки (YFV)8. Долгое время Ae. aegypti был найден исключительно на африканском континенте и в Юго-Восточной Азии, но в последние годы он колонизировал почти все континенты9. Кроме того, глобальная численность Ae. aegypti постоянно растет, и, по оценкам, к концу столетия она увеличится на 20%10. В период с 2004 по 2009 гг. в Китае наблюдалось явное увеличение компетентности переносчиков Ae. aegypti для DENV из-за более высоких дневных температур11. Статус Ae. aegypti как патогенного переносчика значительно повысился в Китае. Следовательно, для решения этих проблем необходимо исследовать векторную способность Ae. aegypti передавать вирусы.
Как членистоногое-гематофаг, самка комара прокалывает кожу позвоночного хозяина и питается кровью. Комары иногда приобретают вирусы от инфицированных вирусом хозяев, а затем передают вирусы новому хозяину. Таким образом, для определения компетентности переносчиков комаров кормят искусственной кровяной мукой, содержащей арбовирусы, через систему кормления в лабораторных условиях12. Отдельные комары разделяются на головы, тела и выделения слюны через несколько дней после заражения. Для измерения вирусной инфекции, скорости распространения и передачи титры вируса были обнаружены с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) или анализа бляшек. Однако не у всех комаров развиваются инфекции средней кишки и способность передавать вирус следующему хозяину после кормления кровью. Это связано с физиологическими барьерами комаров, которые препятствуют проникновению патогенов в организм и играют жизненно важную роль в их врожденном иммунитете13. Барьеры средней кишки, особенно инфекционный барьер средней кишки (MIB) и барьер побега средней кишки (MEB), влияют на то, может ли вирус системно инфицировать вектора и эффективность, с которой он распространяется. Он препятствует анализу инфекции других тканей, таких как слюнные железы, которые также проявляют инфекцию слюнных желез и избегают барьеров13,14. Чтобы лучше охарактеризовать инфекцию средней кишки и слюнных желез у переносчика, здесь представлен подробный протокол перорального кормления и внутригрудной инокуляции арбовируса Ae. aegypti. Этот протокол может быть применен к дополнительным арбовирусным инфекциям у различных комаров-переносчиков, таких как инфекция DENV и ZIKV у Aedes spp., и может оказаться практически осуществимой процедурой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка вирусов и комаров
- Подготовка вирусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процессы проводились в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Используемый уровень биобезопасности должен определяться оценкой риска патогена и правилами, характерными для стран и регионов. Процесс должен выполняться в шкафу биобезопасности.- Инокулируйте 1 x 106 клеток C6/36 в колбу для культивирования T75. Наполните колбу 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда L-15 Лейбовица (L15) или модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM) также могут использоваться для поддержания клеток C6/36. - Поддерживайте клетки в 5% CO2 при 28 ° C в течение ночи и удалите надосадочную жидкость клеток на следующий день, когда клетки сливаются на 80-90%.
- Добавьте 1 мл разбавления вируса (кратность инфекции (MOI) = 0,01) в колбу и инкубируйте клетки в течение 1 часа в 5% CO2 при 28 ° C. Вирус озера Эбинур (EBIV)15, переносимый комарами ортобуньявирус, был использован в качестве модельного вируса для этого протокола.
- Удалите надосадочную жидкость и промойте клетки 3 раза 5 мл PBS. Наполните колбу 15 мл новой среды RPMI с 2% FBS. Храните колбу в 5% CO2 при 28 ° C.
- Соберите надосадочную жидкость, содержащую вирус, когда будет достигнут требуемый титр вируса (почти через 5 дней, в зависимости от используемого вируса). Для EBIV это значение титра составляло10,7 бляшеобразующих единиц (БОЕ)/мл. Упакуйте их в отдельные пробирки для хранения с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл и храните пробирки, содержащие 0,5-1 мл вируса, при температуре -80 °C.
- Инокулируйте 1 x 106 клеток C6/36 в колбу для культивирования T75. Наполните колбу 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащей 10% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
- Определение титра вируса
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите титр вируса с помощью анализов бляшек16. BHK-21 был использован для определения вирусного титра EBIV из-за очевидного цитопатического эффекта (CPE), наблюдаемого в инфицированных клетках.- Инокулируйте 1 x 105 клеток BHK-21 в каждую лунку из 24-луночных планшетов. Заполните каждую лунку 1 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и 1% P/S. Поддерживайте клетки в 5% CO2 при 37 ° C в течение ночи.
- Сделайте шесть (10-6) последовательных 10-кратных разведений вируссодержащей надосадочной жидкости свежей средой DMEM, содержащей 10% FBS и 1% P/S.
- Добавьте 100 мкл вирусного разбавителя в каждую лунку из 24-луночных планшетов, содержащих монослой BHK-21. Выбросьте вирусный разбавитель после инкубации в течение 1 ч в 5% CO2 при 37 ° C. Добавьте 500 мкл DMEM, содержащего 1,5% метилцеллюлозы, в каждую лунку.
- Культивирование клеток в 5% CO2 при 37 ° C в течение 48 ч (кажущийся CPE был обнаружен через 48 ч для EBIV). Зафиксируйте клетки на ночь 750 мкл 3,7% формальдегида.
- Покрасьте их 200 мкл 2% кристаллического фиолетового цвета в течение 15 мин. Подсчитайте количество бляшек, чтобы рассчитать титр вируса.
- Размножение комаров в лаборатории
ПРИМЕЧАНИЕ: Задние комары в лаборатории уровня содержания членистоногих 1 (ACL-1).- Для приготовления дехлорированной воды залейте 20-литровое ведро водопроводной водой и дайте ей постоять 7-8 дней без света. Не накрывайте крышку.
- Яйца и личинки Ae. aegypti хранят в помещении для комаров при соблюдении следующих условий: 28 ± 1 °C с циклом свет/темнота 12 ч и относительной влажностью воздуха 75% ± 5%.
- Содержите около 1000 личинок в неглубокой посуде (22 см x 15 см x 6 см), содержащей дехлорированную воду после вылупления яиц. Кормите их почти 1/8 чайной ложки порошка корма для мышей. Ежедневно обновляйте пищу и меняйте воду каждые 2 дня.
- Как только личинки окуклятся через 5-7 дней, используйте одноразовую капельницу, чтобы перенести куколок в пластиковый стаканчик (7 унций), наполненный дехлорированной водой.
- Поместите пять чашек с куколками (около 200 на чашку) в одну сетчатую клетку (30 см х 30 см х 30 см) и держите клетки в инкубаторе для насекомых в тех же условиях, что и на шаге 1.3.2.
- Положите крошечную губку, содержащую 8% (м/в) раствор глюкозы, на каждую сетчатую клетку, чтобы кормить взрослых комаров. После появления взрослых особей вынимайте стаканчики без куколок. Держите сетчатые клетки с примерно 1000 взрослых комаров в клетке в одном и том же инкубаторе для насекомых.
2. Подготовка к инфекции полости рта
- Подготовьте самок комаров к инфекции полости рта. Используйте машину для поглощения комаров, чтобы собрать 5-8-дневных комаров. Обезболивайте их при -20 °C в течение 1 минуты и проверьте, не кружится ли голова у комаров. Если нет, обезболите их еще минуту при -20 °C.
- Быстро налейте их в пластиковые стаканчики (24 унции) примерно по 200 комаров (самки и самцы) на чашку. Быстро накройте каждую чашку хорошо разрезанной москитной сеткой, а затем крышкой с отверстием (диаметром примерно 6 см) посередине.
- Морите комаров голодом в течение 24 часов перед оральной инфекцией и приготовьте инфекционную кровяную муку следующим образом.
- В шкафу биобезопасности в условиях BSL-2 выньте вирусный запас из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте его на льду. Разбавьте вирусный запас до концентрации 2 x 106 БОЕ/мл со средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% P/S. Смешайте разведение вируса с равным объемом обезжиренной лошадиной крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы проводились в шкафу биобезопасности в лаборатории ACL-2.
3. Выполните инфекцию полости рта
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы были выполнены в лаборатории ACL-2. Процесс должен выполняться в бардачке, чтобы предотвратить побег комаров.
- Выполняйте искусственное кормление с использованием системы искусственного кормления комаров в течение 1 часа.
- Разрежьте коллагеновые мембраны до соответствующего размера (примерно 5 см в диаметре), закрепите их на резервуарах уплотнительными кольцами, затем добавьте смесь вируса и крови (примерно 3 мл) в резервуары. Используйте пластиковые заглушки для герметизации резервуаров и предотвращения утечек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы были выполнены в шкафу биобезопасности. - Положите пластиковые стаканчики (24 унции) с комарами в перчаточный ящик. Прикрутите герметичные резервуары к питателю FU1 и поставьте один резервуар на одну чашку, затем включите силовой агрегат. Кормите комаров в течение 1 ч.
- Разрежьте коллагеновые мембраны до соответствующего размера (примерно 5 см в диаметре), закрепите их на резервуарах уплотнительными кольцами, затем добавьте смесь вируса и крови (примерно 3 мл) в резервуары. Используйте пластиковые заглушки для герметизации резервуаров и предотвращения утечек.
- Обезболивайте комаров CO2 в течение нескольких секунд, пока они не упадут в обморок. Короче говоря, поместите пистолет-распылитель углекислого газа в середину сетчатой сетки через отверстие на чашке, содержащей комаров, откройте значение и позвольте извергнуть огромное количество углекислого газа, чтобы обезболить комаров.
- Вылейте их в чашку Петри, поставленную на лед, и быстро накройте крышкой. Выковыряйте набухших самок комаров щипцами. Чтобы идентифицировать, у самцов перистые усики, а у самок - простые усики. Переложите их в новые пластиковые стаканчики по 50 самок комаров на чашку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Набухшие самки комаров были отобраны для поддержания консистенции, поскольку количество корма влияет на содержание вируса. - Оберните чашку разрезанной сеткой от москитной сетки, а затем накройте ее крышкой с отверстием посередине. Разрежьте губку на небольшой кусочек и положите на чашку.
- Добавьте 8% раствор глюкозы на губку с помощью пластиковой одноразовой капельницы. Храните чашки с самками комаров в инкубаторе при температуре 27 °C при влажности 80% в течение 10 дней. Заменяйте новую губку, насыщенную глюкозой, каждые 72 часа.
4. Подготовка к внутригрудной прививке
- Подготовьте иглы для микроинъекций следующим образом. Используйте PUL-1000 для изготовления игл для микроинъекций (рис. 1A) со следующими параметрами в программе съемника игл: индекс тепла = 450, сила (г) = 110, расстояние (мм) = 1,00 и задержка (с) = 0.
- Отрежьте кончик вытянутой иглы пинцетом под препарирующим микроскопом при 16-кратном увеличении (рис. 1B). Не делайте наконечник слишком большим, иначе он может навредить комарам.
- Подготовьте самок комаров, как показано на шаге 2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процессы были выполнены в лаборатории ACL-2. - Готовят разведение инфекционного вируса следующим образом:
- Достаньте вирусный бульон из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте его на льду. Разбавьте вирус до разведения вируса 100 нл, содержащего 100-500 вирусов БОЕ, со средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% P/S. Держите разведение вируса на льду.
- Залейте иглу минеральным маслом через одноразовый стерильный шприц. Присоедините иглу к инжектору, следуя инструкциям на машине.
- Вставьте иглу в трубку, содержащую разведение инфекционного вируса. Не ломайте кончик иглы. Нажмите кнопку FILL , чтобы заполнить иглу раствором вируса. Конечный объем раствора вируса в игле составляет примерно 4,0 мкл. После того, как игла заполнена вирусом, будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к ней и не повредить ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы были выполнены в шкафу биобезопасности.
5. Выполните вирусную инъекцию под препарирующим микроскопом
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы были выполнены в лаборатории ACL-2.
- Обезболивайте комаров при -20 °C в течение 1 мин. Вылейте их в чашку Петри, поставленную на лед, и быстро накройте крышкой.
- Выберите пинцетом около 50 самок комаров и положите их на тарелку со льдом. Поместите ледяную пластину под инжектор и вставьте иглу в грудную полость комара под препарирующим микроскопом (рис. 1В).
- Установите объем впрыска на 100 нл и скорость на 50 нл / с. Нажмите кнопку INJECT , чтобы раствор вируса попал в комара. Если произойдет успешная инъекция, живот будет слегка выпячиваться.
- Поместите зараженного комара в новый пластиковый стаканчик (24 унции), помещенный на лед. Когда количество зараженных комаров станет достаточным, оберните чашку разрезанной сеткой от москитной сетки, а затем накройте ее крышкой.
- Держите чашку с инфекционными комарами в инкубаторе при температуре 27 ° C при влажности 80% в течение 10 дней. Кормите комаров, как в шаге 3.5.
6. Обработка зараженных самок комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: У каждой самки комара были препарированы три разные ткани/органа: кишечник для расчета скорости вирусной инфекции (VIR), голова для расчета скорости распространения вируса (VDR) и слюна для расчета скорости передачи вируса (VTR). VIR был определен как количество комаров с вирус-положительными кишками. VDR был определен как количество комаров с вирус-положительными головами, деленное на количество комаров с вирус-положительными кишками на 100. VTR был определен как количество комаров с вирус-положительной слюной, деленное на количество комаров с вирус-положительными кишками на 100.
- Сбор слюны у зараженных самок комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы должны выполняться в лаборатории ACL-2.- Обезболивайте инфицированных самок комаров углекислым газом, как показано на шаге 3.2. Вылейте их в чашку Петри, поставленную на лед, и быстро закройте крышку.
- Положите наконечники пипеток объемом 10 мкл, наполненные иммерсионным маслом, рядом на резиновую грязь.
- Выделите самок комаров пинцетом и положите их на тарелку со льдом. Удалите им ножки и крылышки пинцетом. Поместите ротовой аппарат одного комара на каждый кончик пипетки.
- Соберите слюну, выделяемую комарами в масло, в течение следующих 45-60 минут при комнатной температуре.
- Поместите наконечники пипеток в пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 200 мкл среды разбавителя вирусов (среда RPMI 1640, содержащая 10% FBS и 1% P/S). Центрифугируйте их при 5000 x g в течение 5 мин при 4 ° C, чтобы вытеснить слюну в пробирки. Храните эти трубки при температуре -80 °C для последующего определения скорости передачи.
- Препарируют зараженных самок комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы должны выполняться в лаборатории ACL-2.- Используйте пинцет, чтобы отрезать головы самок комаров после сбора слюны. Поместите каждую головку в отдельную пробирку, содержащую 200 мкл среды RPMI 1640.
- Возьмитесь пинцетом за грудную клетку, затем другой пинцетом за предпоследний сегмент живота и вытащите его. Кишку вытащат. Очистите вытащенную кишку от любых бродячих тканей и органов.
- Промойте кишечник PBS и поместите каждую кишку в отдельную пробирку, содержащую 200 мкл среды RPMI 1640. Храните эти пробирки при температуре -80 °C для последующего определения скорости заражения вирусом и скорости распространения.
7. Анализ данных
- Выделение РНК
- Измельчите ткани на куски с помощью низкотемпературного измельчителя ткани, настроенного на следующие параметры: рабочая частота = 60 Гц, время работы = 15 с, время паузы = 10 с, циклы = 2 и температура установки = 4,0 °C.
- Центрифугируют образцы при 12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Извлеките общую РНК из каждого образца с помощью автоматизированной системы выделения нуклеиновых кислот, следуя инструкциям прибора.
- Выполнение qRT-PCR
- Используйте одноэтапный набор ОТ-ПЦР для количественной оценки копий вирусной РНК с помощью количественного инструментаПЦР 17. Используйте следующие праймеры для обнаружения EBIV S-сегмента F: ATGGCATCACCTGGGAAAG и R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Настройте процесс реакции следующим образом: стадия 1: 42 °C в течение 5 мин, 95 °C в течение 10 с; этап 2: 40 циклов 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 20 с.
- Определите самую низкую дозу вируса для инфекции в клетках с помощью серийных 10-кратных разведений, инокулированных на клетки. Используйте клетки BHK-21 для определения самой низкой дозы вируса EBIV, используя разведения до 10-7 , как описано на шаге 1.2.
- Рассчитайте значение Ct наименьшей дозы вируса с помощью qRT-PCR. Используйте пороговое значение для EBIV-положительного результата с помощью qRT-PCR как < 35. Используйте следующее уравнение для расчета копий EBIV в каждом образце:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (копии EBIV), y = значение Ct, R2 = 0,9905] - Рассчитайте скорость заражения, скорость распространения и скорость передачи следующим образом:
Коэффициент инфицирования (%) = 100 х (количество кишок вирус-положительных комаров / общее количество комаров)
Коэффициент распространения (%) = 100 х (количество голов вирус-положительных комаров / количество кишок вирус-положительных комаров)
Скорость передачи (%) = 100 x (количество слюны вирус-положительных комаров / количество кишок вирус-положительных комаров) - Проанализируйте различия в непрерывных переменных и различиях в частоте заражения комаров, скорости распространения и скорости передачи с помощью непараметрического анализа Крускала-Уоллиса для многократных сравнений и точного теста Фишера, где это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для изучения распределения EBIV у инфицированных комаров с помощью искусственного кормления кровью (конечный титр вируса составлял 6,4 x 106 БОЕ/мл) и внутригрудной инъекции (вирусная доза составила 340 БОЕ) определяли вирусные РНК в слюне, головах и кишках комаров через 10 дней после заражения (dpi).
Для Ae. aegypti титр вируса EBIV в кишечнике, головах и слюне внутригрудно инокулированных самок комаров был намного выше, чем у орально инфицированных самок комаров (рис. 2A-C). Уровень инфицирования и коэффициент распространения для внутригрудно инокулированных самок комаров составил 100%, а для орально инфицированных самок комаров составил 70% и 38,1% соответственно (рис. 2D, E). Уровень передачи инфекции для внутригрудных инокулированных самок комаров достигал 90%, но для орально инфицированных самок комаров составлял всего 4,8%. Это указывало на то, что кишечник Ae. aegypti оказывает сильное ингибирующее действие на передачу вируса.
Рисунок 1: Схема наконечника микропипетки и внутригрудной инъекции. (A) Вытянутый наконечник микропипетки перед тем, как сломать наконечник. (B) Правильно подготовленный наконечник микропипетки, пригодный для внутригрудной инокуляции. (C) Схема внутригрудной инъекции комаров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Векторная компетентность взрослых комаров при пероральном кормлении и внутригрудной инокуляции. Инфицированных самок комаров инкубировали при 28 °C в течение 10 дней. Значение p ≤ 0,05 считалось статистически значимым. Непараметрический анализ Крускала-Уоллиса использовался для многократных сравнений и точного теста Фишера, где это было уместно. Эта цифра была изменена на основе исследования Xia et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого метода состояла в том, чтобы обеспечить всестороннюю оценку риска одного вируса, переносимого комарами, путем оценки компетентности переносчиков посредством перорального кормления и внутригрудной инокуляции.
В эксперименте с пероральным кормлением набухших комаров необходимо отбирать и переносить в новый контейнер, что представляет серьезную опасность для операторов. Причина этого заключается в том, что любой комар, включая неинфицированных комаров, может быть источником инфекции19. Следовательно, комары должны быть сначала анестезированы, как указано в протоколе, а затем должны быть выполнены последующие шаги. Важно отметить, что отбор набухших комаров и перенос их следует проводить в герметичном бардачке. Держите перчаточный ящик закрытым во время процесса, если в нем нет свободно перемещающихся комаров.
В эксперименте с инфекцией лучше, чтобы два человека работали вместе, и после того, как два человека подтвердят, что одновременно нет убегающих комаров, они могут открыть перчаточный ящик, чтобы предотвратить побег зараженных комаров. Если происходит побег, эти комары должны быть убиты или пойманы. Не рекомендуется убивать зараженных комаров голыми руками. Риск заражения операторов может быть снижен с помощью вакуумных аспираторов или других соответствующих инструментов (например, щипцов, кистей, рук в перчатках). После эксперимента продезинфицируйте внутреннюю часть перчаточного ящика и поверхность верстака обычным дезинфицирующим средством.
Большинство исследований, посвященных компетентности комаров-переносчиков вирусов, переносимых комарами, были сосредоточены исключительно на инфекции полости рта20,21. При инфекции полости рта вирусы должны преодолеть несколько тканевых барьеров, связанных со средней кишкой и слюнными железами, чтобы попасть в слюну14. Влияние средней кишки и слюнной железы на переносчиковую способность комаров в этом эксперименте не было продемонстрировано. Когда пероральное кормление и внутригрудная инъекция сочетаются, различные тканевые барьеры могут быть тщательно оценены. Согласно результатам этой процедуры, кишечник Ae. aegypti играет доминирующую роль в векторной компетентности вируса, и барьер слюнных желез может отсутствовать (рис. 2). Для этого наш протокол полезен для подтверждения наличия барьеров средней кишки или слюнных желез для арбовирусной инфекции.
Согласно методике, в образцах была идентифицирована только вирусная РНК. Другие исследования, такие как наблюдение вириона с помощью просвечивающего электронного микроскопа, подтверждение инфекции с помощью анализов бляшек или обнаружение вирусного белка с помощью иммунофлуоресцентного анализа, необходимы для подтверждения инфекционных вирусов в различных образцах. Эта методология может быть модифицирована и использована для инокуляции дополнительных вирусов, представляющих интерес, в широкий спектр комаров-переносчиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Уханьским проектом научно-технического плана (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
