Summary
Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.
Abstract
Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), que são patógenos infecciosos para vertebrados, são transmitidos por muitas espécies de mosquitos, representando uma grave ameaça à saúde pública. Uma vez ingeridos, os vírus devem ultrapassar a barreira do intestino médio do mosquito para chegar à hemolinfa, de onde podem potencialmente se espalhar para as glândulas salivares. Quando um mosquito pica, esses vírus são espalhados para novos hospedeiros vertebrados. Da mesma forma, o mosquito pode pegar vírus diferentes. Em geral, apenas uma pequena porção de vírus pode entrar nas glândulas salivares através do intestino. A eficiência de transmissão desses vírus para as glândulas é afetada pelas duas barreiras físicas encontradas em diferentes espécies de mosquitos: as barreiras do intestino médio e as barreiras das glândulas salivares. Este protocolo apresenta um método para detecção de vírus em glândulas salivares de Aedes aegypti após alimentação oral e infecção por injeção intratorácica. Além disso, determinar se o intestino e/ou as glândulas salivares impedem a disseminação viral pode auxiliar na avaliação de risco de MBVs transmitidos pelo Aedes aegypti.
Introduction
Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), um grupo heterogêneo de vírus de RNA, podem persistir em mosquitos vetores e subsequentemente se espalhar para hospedeiros vertebrados1. Os MBVs clinicamente importantes estão distribuídos majoritariamente em quatro famílias de vírus: Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae e Peribunyavividae 2,3. Nas últimas décadas, esses vírus têm sido relatados em todo o mundo, causando problemas de saúde pública. Como um dos MBVs mais conhecidos, o vírus da dengue (DENV) tornou-se o arbovírus emergente ou reemergente mais prevalente em mais de 100 países durante os últimos 20 anos4. Desde a descoberta do vírus Zika (ZIKV) no interior, quase todos os países e territórios tropicais e subtropicais do continente relataram infecções humanas pelo VZIK5. Com o objetivo de avaliar o risco de transmissão do vírus, inúmeros estudos nos últimos anos têm focado na competência do mosquito vetor para esses vírus 6,7. Como resultado, é fundamental prevenir e controlar eficazmente as doenças transmitidas por vetores.
O Aedes aegypti (Ae. aegypti), um dos mosquitos mais facilmente criados em laboratório, é um importante vetor do DENV, ZIKV, Chikungunya virus (CHIKV) e vírus da febre amarela (YFV)8. Durante muito tempo, o Aedes aegypti foi encontrado apenas no continente africano e no sudeste asiático, mas nos últimos anos colonizou quase todos oscontinentes9. Além disso, a abundância global de Aedes aegypti vem crescendo continuamente, com um aumento estimado de 20% até o final do século10. De 2004 a 2009, na China, foi evidente o aumento da competência do vetor Aedes aegypti para o DENV devido às temperaturas mais elevadas no dia-a-dia11. O status do Aedes aegypti como vetor patogênico aumentou significativamente na China. Consequentemente, para enfrentar esses desafios, é necessário investigar a competência vetorial do Aedes aegypti para transmitir vírus.
Como um artrópode hematófago, a fêmea do mosquito perfura a pele de um hospedeiro vertebrado e se alimenta do sangue. Os mosquitos ocasionalmente adquirem vírus de hospedeiros infectados por vírus e, em seguida, transferem os vírus para um novo hospedeiro. Assim, para determinar a competência vetorial, os mosquitos são alimentados com uma farinha de sangue artificial contendo arboviroses por meio de um sistema de alimentação em ambiente de laboratório12. Os mosquitos individuais são separados em cabeças, corpos e secreções de saliva vários dias após a infecção. Para medir a infecção, disseminação e taxas de transmissão do vírus, os títulos virais foram detectados por PCR quantitativo de transcrição reversa (qRT-PCR) ou ensaio de placa. No entanto, nem todos os mosquitos desenvolvem infecções do intestino médio e a capacidade de transferir um vírus para o próximo hospedeiro após a alimentação sanguínea. Está ligada às barreiras fisiológicas dos mosquitos, que impedem a penetração de patógenos no organismo e desempenham papel vital em sua imunidade inata13. As barreiras do intestino médio, particularmente a barreira de infecção do intestino médio (MIB) e a barreira de escape do intestino médio (MEB), influenciam se o vírus poderia infectar o vetor sistemicamente e a eficiência com que ele se espalha. Dificulta a análise da infecção de outros tecidos, como as glândulas salivares, que também apresentam infecção das glândulas salivares e barreiras de escape13,14. Para melhor caracterizar a infecção do intestino médio e glândulas salivares no vetor, um protocolo detalhado para alimentação oral e inoculação intratorácica de arbovírus em Aedes aegypti é apresentado. Este protocolo pode ser aplicado a arboviroses adicionais em uma variedade de mosquitos vetores, como a infecção por DENV e ZIKV em Aedes spp., e pode ser um procedimento praticável.
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Protocol
1. Preparação de vírus e mosquitos
- Preparação de vírus
OBS: Todos os processos foram realizados em laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2). O nível de contenção de biossegurança utilizado deve ser determinado pela avaliação de risco do patógeno e regulamentos específicos para nações e regiões. O processo deve ser realizado em um gabinete de biossegurança.- Inocular 1 x 106 células C6/36 num balão de cultura T75. Encher o frasco com 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
NOTA: O meio L-15 de Leibovitz (L15) ou o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) também podem ser usados para manter células C6/36. - Manter as células em 5% CO2 a 28 °C durante a noite e remover o sobrenadante celular no dia seguinte, quando as células estiverem 80%-90% confluentes.
- Adicionar 1 ml de diluição viral (Multiplicidade de Infecção (MOI) = 0,01) no balão e incubar as células durante 1 h em CO2 a 5% a 28 °C. O Ebinur Lake virus (EBIV)15, um orthobunyavirus transmitido por mosquitos, foi utilizado como vírus modelo para este protocolo.
- Retire o sobrenadante e lave as células 3x com 5 mL de PBS. Encher o frasco com 15 mL de novo meio RPMI com SFB a 2%. Manter o balão em 5% de CO2 a 28 °C.
- Coletar o sobrenadante contendo vírus quando o título viral necessário for atingido (após quase 5 dias, dependendo do vírus usado). Para EBIV, esse valor de título foi de 10a 7 unidades formadoras de placa (UFP)/mL. Subembalá-los em tubos de armazenamento individuais de tampa de rosca de 2 mL e armazenar os tubos contendo 0,5-1 mL de vírus a -80 °C.
- Inocular 1 x 106 células C6/36 num balão de cultura T75. Encher o frasco com 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
- Determinação do título viral
NOTA: Determinar o título viral através dos ensaios de placa16. BHK-21 foi usado para determinar o título viral de EBIV, devido ao óbvio efeito citopático (CPE) observado em células infectadas.- Inocular 1 x 105 células BHK-21 em cada poço de placas de 24 poços. Encher cada poço com 1 mL de meio DMEM contendo 10% de SFB e 1% de P/S. Manter as células em 5% de CO2 a 37 °C durante a noite.
- Fazer seis (10-6) diluições sucessivas de 10 vezes de sobrenadante contendo vírus com meio DMEM fresco contendo 10% de SFB e 1% de P/S.
- Adicionar 100 μL de diluente viral em cada poço de placas de 24 poços contendo a monocamada BHK-21. Eliminar o diluente viral após incubação durante 1 h em 5% de CO2 a 37 °C. Adicionar 500 μL de DMEM contendo 1,5% de metilcelulose a cada poço.
- Células de cultura em CO2 a 5% a 37 °C por 48 h (o ECP aparente foi encontrado após 48 h para EBIV). Fixar as células durante a noite com 750 μL de formaldeído a 3,7%.
- Colora-os com 200 μL de violeta de cristal a 2% por 15 min. Conte o número de placas para calcular o título viral.
- Reprodução de mosquitos em laboratório
NOTA: Mosquitos traseiros em um laboratório de nível 1 de contenção de artrópodes (ACL-1).- Para a preparação da água desclorada, encha um balde de 20 L com água da torneira e deixe-o repousar por 7-8 dias sem luz. Não cubra a tampa.
- Manter ovos e larvas de Aedes aegypti em uma sala de mosquitos com as seguintes condições: 28 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h e umidade relativa de 75% ± 5%.
- Manter cerca de 1.000 larvas em um prato raso (22 cm x 15 cm x 6 cm) contendo água desclorada após a eclosão dos ovos. Alimente-os com quase 1/8 colher de chá de pó de ração para ratos. Refrescar os alimentos diariamente e trocar a água a cada 2 dias.
- Uma vez que as larvas pupam após 5-7 dias, use um conta-gotas único para transferir as pupas para um copo plástico (7 oz) cheio de água desclorada.
- Coloque cinco xícaras contendo pupas (cerca de 200 por xícara) em uma gaiola de malha (30 cm x 30 cm x 30 cm) e mantenha as gaiolas na incubadora de insetos com as mesmas condições da etapa 1.3.2.
- Coloque uma pequena esponja contendo uma solução de glicose a 8% (m/p) em cada gaiola de malha para alimentar mosquitos adultos. Após a emergência do adulto, retire os copos sem pupas. Mantenha as gaiolas de malha com cerca de 1.000 mosquitos adultos por gaiola na mesma incubadora de insetos.
2. Preparação para infecção oral
- Preparar mosquitos fêmeas para infecção oral. Use a máquina de absorção de mosquitos para coletar mosquitos de 5 a 8 dias de idade. Anestesia-os a -20 °C por 1 min e verifique se os mosquitos estão tontos. Caso contrário, anestesiar-os por mais um minuto a -20 °C.
- Despeje-os rapidamente nos copos plásticos (24 oz) a cerca de 200 mosquitos (fêmeas e machos) por xícara. Cubra rapidamente cada copo com um mosquiteiro bem cortado, seguido de uma tampa com um orifício (aproximadamente 6 cm de diâmetro) no meio.
- Passe fome os mosquitos por 24 h antes da infecção oral e prepare a refeição de sangue infecciosa da seguinte maneira.
- Em um gabinete de biossegurança sob condições BSL-2, retire o estoque de vírus do freezer de -80 °C e descongele-o no gelo. Diluir o estoque de vírus para uma concentração de 2 x 106 PFU/mL com meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB e 1% de P/S. Misture a diluição do vírus com um volume igual de sangue de cavalo desfibrado.
OBS: Os processos foram realizados em gabinete de biossegurança em laboratório de ACL-2.
3. Realizar infecção oral
OBS: Todas as etapas foram realizadas em laboratório de ACL-2. O processo deve ser realizado no porta-luvas para evitar que os mosquitos escapem.
- Realizar alimentação artificial utilizando o sistema de alimentação artificial do mosquito por 1 h.
- Cortar as membranas de colágeno no tamanho adequado (aproximadamente 5 cm de diâmetro), fixá-las aos reservatórios com o-rings e, em seguida, adicionar a mistura vírus-sangue (aproximadamente 3 mL) aos reservatórios. Use tampões plásticos para vedar reservatórios e evitar vazamentos.
OBS: Essas etapas foram realizadas em uma cabine de biossegurança. - Coloque os copos plásticos (24 oz) contendo mosquitos no porta-luvas. Rosqueie os reservatórios selados no alimentador FU1 e coloque um reservatório em um copo e, em seguida, ligue a unidade de alimentação. Alimente os mosquitos por 1 h
- Cortar as membranas de colágeno no tamanho adequado (aproximadamente 5 cm de diâmetro), fixá-las aos reservatórios com o-rings e, em seguida, adicionar a mistura vírus-sangue (aproximadamente 3 mL) aos reservatórios. Use tampões plásticos para vedar reservatórios e evitar vazamentos.
- Anestesiar os mosquitos por CO2 por vários segundos até que desmaiem. Em resumo, coloque a pistola de dióxido de carbono no meio da malha de rede através do buraco no copo que contém mosquitos, abra o valor e permita que enormes quantidades de dióxido de carbono sejam expelidas para anestesiar os mosquitos.
- Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e cubra a tampa rapidamente. Escolha os mosquitos fêmeas ingurgitados com fórceps. Para identificar, os machos têm antenas de penas e as fêmeas têm antenas planas. Transfira-os para copos plásticos novos a 50 fêmeas de mosquitos por xícara.
NOTA: As fêmeas ingurgitadas de mosquitos foram colhidas para manter a consistência, pois a quantidade de alimentação afeta o conteúdo viral. - Embrulhe o copo com uma malha mosquiteira cortada e, em seguida, cubra-o com uma tampa com um buraco no meio. Corte a esponja em um pedaço pequeno e coloque no copo.
- Adicione solução de glicose a 8% na esponja usando um conta-gotas descartável de plástico. Manter os copos contendo fêmeas de mosquitos na incubadora a 27 °C a 80% de umidade por 10 dias. Substitua uma nova esponja saturada de glicose a cada 72 h.
4. Preparo para inoculação intratorácica
- Prepare as agulhas de microinjeção da seguinte forma. Utilizar um PUL-1000 para confecção de agulhas de microinjeção (Figura 1A) com os seguintes parâmetros no programa extrator da agulha: Índice de calor = 450, força (g) = 110, distância (mm) = 1,00 e atraso (s) = 0.
- Cortar a ponta de uma agulha tracionada com uma pinça sob o microscópio dissecante em aumento de 16x (Figura 1B). Não deixe a ponta muito grande, caso contrário pode prejudicar os mosquitos.
- Prepare mosquitos fêmeas como na etapa 2.1.
NOTA: Os seguintes processos foram realizados em um laboratório de ACL-2. - Preparar a diluição do vírus infeccioso da seguinte forma:
- Retire o estoque de vírus do freezer de -80 °C e descongele-o no gelo. Diluir o vírus para uma diluição de vírus de 100 nL contendo 100-500 vírus PFU com meio RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% P/S. Mantenha a diluição do vírus no gelo.
- Encha novamente a agulha com óleo mineral através de uma seringa estéril descartável. Conecte a agulha no injetor seguindo as instruções na máquina.
- Introduza a agulha num tubo contendo a diluição do vírus infeccioso. Não quebre a ponta da agulha. Pressione o botão FILL para encher a agulha com solução de vírus. O volume final da solução viral na agulha é de aproximadamente 4,0 μL. Uma vez que a agulha está cheia com o vírus, tenha cuidado para não tocá-lo e danificá-lo.
OBS: As etapas foram realizadas em uma cabine de biossegurança.
5. Realizar injeção viral sob microscópio dissecante
OBS: Todas as etapas foram realizadas em laboratório de ACL-2.
- Anestesiar mosquitos a -20 °C por 1 min. Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e cubra a tampa rapidamente.
- Escolha cerca de 50 mosquitos fêmeas com pinça e coloque-os na placa de gelo. Coloque a placa de gelo sob o injetor e insira a agulha na cavidade torácica do mosquito sob o microscópio dissecante (Figura 1C).
- Ajuste o volume de injeção para 100 nL e a taxa para 50 nL/s. Pressione o botão INJECT para deixar a solução do vírus fluir para o mosquito. Se ocorrer uma injeção bem-sucedida, o abdômen ficará ligeiramente protuberante.
- Coloque o mosquito infectado em um novo copo plástico (24 oz) colocado no gelo. Quando o número de mosquitos infectados for suficiente, envolva o copo com uma malha mosquiteira cortada e, em seguida, cubra-o com a tampa.
- Manter o copo contendo mosquitos infecciosos na incubadora a 27 °C a 80% de umidade por 10 dias. Alimente os mosquitos como no passo 3.5.
6. Processamento das fêmeas de mosquitos infectadas
NOTA: Três tecidos/órgãos diferentes foram dissecados de cada fêmea do mosquito: o intestino para calcular a taxa de infecção pelo vírus (VIR), a cabeça para calcular a taxa de disseminação do vírus (VDR) e a saliva para calcular a taxa de transmissão do vírus (VTR). VIR foi definido como o número de mosquitos com intestinos positivos para vírus. VDR foi definido como o número de mosquitos com cabeças vírus-positivas dividido pelo número de mosquitos com intestinos vírus-positivos por 100. A VTC foi definida como o número de mosquitos com saliva vírus-positiva dividido pelo número de mosquitos com intestinos vírus-positivos por 100.
- Coleta de saliva das fêmeas de mosquitos infectadas
NOTA: Os processos devem ser realizados em um laboratório ACL-2.- Anestesiar as fêmeas de mosquitos infectadas por anestesia com dióxido de carbono como no passo 3.2. Despeje-os em uma placa de Petri colocada no gelo e feche a tampa rapidamente.
- Coloque as pontas da pipeta de 10 μL preenchidas com óleo de imersão lado a lado sobre a lama de borracha.
- Escolha mosquitos fêmeas com pinças e coloque-os em uma placa de gelo. Retire as pernas e asas com uma pinça. Coloque a parte bucal de um mosquito em cada ponta da pipeta.
- Colete a saliva como secretada no óleo pelos mosquitos para os próximos 45-60 minutos à temperatura ambiente.
- Colocar as pontas da pipeta em tubos de 1,5 mL contendo 200 μL de meio diluente viral (meio RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% P/S). Centrifugar-os a 5.000 x g por 5 min a 4 °C para expelir a saliva em tubos. Conservar estes tubos a -80 °C para posterior determinação das taxas de transmissão.
- Dissecar os mosquitos fêmeas infectados
NOTA: Os processos devem ser realizados em um laboratório ACL-2.- Use pinças para cortar as cabeças das fêmeas de mosquitos após a coleta de saliva. Coloque cada cabeça em um tubo individual contendo 200 μL de meio RPMI 1640.
- Pegue o tórax com um tweezer, depois o penúltimo segmento do abdômen com outra pinça e puxe-o para fora. O intestino será arrancado. Limpe o intestino arrancado de qualquer tecido e órgãos perdidos.
- Lave o intestino com PBS e coloque cada intestino em um tubo individual contendo 200 μL de meio RPMI 1640. Conservar estes tubos a -80 °C para posterior determinação da taxa de infecção e da taxa de disseminação do vírus.
7. Análise dos dados
- Extração de RNA
- Triture os tecidos em pedaços com uma máquina de moagem homogeneizadora de tecidos de baixa temperatura ajustada para os seguintes parâmetros: frequência de operação = 60 Hz, tempo de operação = 15 s, tempo de pausa = 10 s, ciclos = 2 e temperatura de ajuste = 4,0 °C.
- Centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Extrair o RNA total de cada amostra pelo sistema automatizado de extração de ácido nucleico seguindo as instruções do instrumento.
- Realizando qRT-PCR
- Use o kit de RT-PCR de uma etapa para quantificar as cópias do RNA viral usando um instrumento de PCR quantitativo17. Use os seguintes primers para a detecção do segmento F do EBIV S: ATGGCATCACCTGGGAAAG e R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Definir o processo de reação como: estágio 1: 42 °C por 5 min, 95 °C por 10 s; estágio 2: 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 20 s.
- Determinar a dose de vírus mais baixa para a infecção nas células através das diluições seriadas de 10 vezes inoculadas nas células. Use as células BHK-21 para determinar a menor dose viral de EBIV, usando diluições até 10-7 , conforme descrito na etapa 1.2.
- Calcular o valor de Ct da menor dose de vírus por qRT-PCR. Use o valor de corte para EBIV-positivo por qRT-PCR como < 35. Use a seguinte equação para calcular as cópias de EBIV em cada amostra:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (as cópias do EBIV), y = valor Ct, R2 = 0,9905] - Calcule a taxa de infecção, a taxa de disseminação e a taxa de transmissão da seguinte forma:
Taxa de infecção (%) = 100 x (o número de intestinos de mosquitos positivos para vírus / o número total de mosquitos)
Taxa de disseminação (%) = 100 x (o número de cabeças de mosquito positivas para vírus / o número de intestinos de mosquito positivos para vírus)
Taxa de transmissão (%) = 100 x (o número de saliva de mosquito positivo para vírus / o número de intestinos de mosquito positivo para vírus) - Analisar as diferenças nas variáveis contínuas e diferenças nas taxas de infecção do mosquito, taxas de disseminação e taxas de transmissão usando a análise não paramétrica de Kruskal-Wallis para comparações múltiplas e o teste exato de Fisher, quando apropriado.
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Representative Results
Para examinar a distribuição de EBIV nos mosquitos infectados via alimentação sanguínea artificial (o título final viral foi de 6,4 x 106 UFP/mL) e injeção intratorácica (a dose viral foi de 340 UFP), RNAs virais na saliva, cabeças e intestinos dos mosquitos aos 10 dias pós-infecção (dpi) foram determinados.
Para o Aedes aegypti, o título viral de EBIV no intestino, cabeça e saliva das fêmeas inoculadas intratoracicamente foi muito maior do que nas fêmeas infectadas oralmente (Figura 2A-C). A taxa de infecção e disseminação para as fêmeas inoculadas intratoracicamente foi de 100%, mas para as fêmeas infectadas oralmente foi de 70% e 38,1%, respectivamente (Figura 2D, E). A taxa de transmissão para as fêmeas inoculadas intratoracicamente atingiu até 90%, mas para as fêmeas infectadas oralmente foi de apenas 4,8%. Indicou que o intestino do Aedes aegypti tinha um forte efeito inibitório para a transmissão do vírus.
Figura 1: Esquema da ponta da micropipeta e injeção intratorácica. (A) Puxar a ponta da micropipeta antes de quebrar a ponta. (B) Ponteira de micropipeta adequadamente preparada, adequada para inoculação intratorácica. (C) Esquema de injeção intratorácica para os mosquitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Competência vetorial de mosquitos adultos através da alimentação oral e inoculação intratorácica. As fêmeas de mosquitos infectadas foram incubadas a 28 °C por 10 dias. Valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise não paramétrica de Kruskal-Wallis foi utilizada para comparações múltiplas e o teste exato de Fisher, quando apropriado. Esse valor foi modificado a partir do estudo de Xia et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo deste método foi fornecer uma avaliação de risco abrangente de um vírus transmitido por mosquitos, avaliando a competência do vetor por meio de alimentação oral e inoculação intratorácica.
No experimento de alimentação oral, os mosquitos ingurgitados precisam ser colhidos e transferidos para um novo recipiente, representando um sério risco para os operadores. Isso porque qualquer mosquito, inclusive mosquitos não infectados, pode ser fonte de infecção19. Consequentemente, os mosquitos devem ser anestesiados primeiro, conforme especificado no protocolo, e então as etapas de acompanhamento devem ser realizadas. É importante ressaltar que a seleção dos mosquitos ingurgitados e sua transferência devem ser realizadas em um porta-luvas lacrado. Mantenha o porta-luvas fechado durante o processo, a menos que não haja mosquitos em movimento livre na caixa.
No experimento de infecção, é melhor que dois indivíduos trabalhem juntos e, depois que as duas pessoas confirmarem que não há mosquitos escapando ao mesmo tempo, eles podem abrir o porta-luvas para evitar que os mosquitos infectados escapem. Se ocorrer uma fuga, esses mosquitos devem ser mortos ou recapturados. Não é recomendado matar mosquitos infectados com as mãos nuas. O risco de infecção dos operadores pode ser reduzido com o uso de aspiradores a vácuo ou outras ferramentas apropriadas (por exemplo, pinças, pincéis, mãos enluvadas). Após o experimento, desinfetar o interior do porta-luvas e a superfície da bancada com um desinfetante convencional.
A maioria das pesquisas sobre a competência do mosquito vetor para vírus transmitidos por mosquitos tem se concentrado exclusivamente na infecção oral20,21. Para a infecção oral, os vírus devem ultrapassar várias barreiras teciduais associadas ao intestino médio e glândulas salivares para serem liberados nasaliva14. O efeito da glândula do intestino médio e da glândula salivar sobre a capacidade vetorial do mosquito não foi demonstrado neste experimento. Quando a alimentação oral e a injeção intratorácica são combinadas, as diferentes barreiras teciduais podem ser cuidadosamente avaliadas. De acordo com os resultados desse procedimento, o intestino do Aedes aegypti desempenha um papel dominante na competência vetorial do vírus e a barreira das glândulas salivares pode não estar presente (Figura 2). Para isso, nosso protocolo é benéfico para confirmar a presença de barreiras do intestino médio ou glândulas salivares à infecção por arbovírus.
De acordo com a metodologia, apenas o RNA viral foi identificado nas amostras. Outras investigações, como ver o virion com um microscópio eletrônico de transmissão, confirmar a infecção usando ensaios de placa ou detectar a proteína viral com um ensaio de imunofluorescência, são necessárias para confirmar os vírus infecciosos nas várias amostras. Esta metodologia pode ser modificada e usada para inocular vírus adicionais de interesse em uma ampla gama de mosquitos vetores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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