Summary
Polyp bail-out är en process som induceras av akut stress, där korallpolyper smälter vävnaden som förbinder dem med sin koloni och lossnar från den för att leva som individer. Det nuvarande protokollet beskriver hur man inducerar korallmikropropagation genom räddningsaktion med hjälp av hypersalin eller kalciumfria havsvattenbehandlingar.
Abstract
Koraller är koloniala djur som bildas av modulära enheter som kallas polyper. Korallpolyper är fysiologiskt kopplade och förbundna med vävnad. Fenomenet polyp bail-out är en process som induceras av akut stress, där korallpolyper smälter vävnaden som förbinder dem med resten av kolonin och slutligen lossnar från skelettet för att fortsätta leva som separata individer. Korallbiologer har erkänt processen för polypräddning i flera år, men först nyligen har mikropropagaterna som genereras av denna process erkänts som ett modellsystem för korallbiologiska studier. Användningen av polyp bail-out kan skapa ett stort antal klonala enheter från ett enda korallfragment. En annan fördel är att enstaka polyper eller fläckar av polyper enkelt kan visualiseras under ett mikroskop och underhållas i mycket standardiserade billiga miljöer som petriskålar, kolvar och mikrofluidiska chips. Det nuvarande protokollet visar reproducerbara metoder som kan inducera korallmikropropagation och olika metoder för att hålla de enskilda polyperna vid liv på lång sikt. Denna metod kunde framgångsrikt odla polyper av korallarten Pocillopora verrucosa i upp till 8 veckor efter räddningsaktionen, vilket uppvisade det praktiska med att använda enskilda korallpolyper för korallforskning.
Introduction
Scleractinian eller revbyggande koraller är cnidarians som kan bilda karbonatskelett, skapa rev och strukturellt komplexa ekosystem som kan hittas från djupa till grunda vattenmiljöer1. Tropiska korallrev hyser stor biologisk mångfald och tillhandahåller viktiga ekosystemtjänster, såsom kustskydd och fiskeunderhåll2. De flesta revbyggande koraller på grunt vatten förlitar sig på ett mutualistiskt förhållande till alger av familjen Symbiodiniaceae, som ger den energi som koraller behöver för att bygga sina skelett. Symbiosen mellan korallen och algerna kan brytas av miljöstress, vilket orsakar korallblekning 3,4,5,6. De senaste temperaturavvikelserna har orsakat stora korallblekningshändelser runt om i världen, vilket har lett till masskoralldödlighet och permanent revförstöring 7,8,9,10,11. Eftersom detta fenomen är baserat på utvisning av symbionter genom postvärmestressassocierade cellulära mekanismer, såsom apoptos, autofagi och exocytos, kan korallblekning beskrivas som en cellulär process som har konsekvenser i ekosystemskala 5,6,12, vilket innebär att in vitro-kulturer av korallceller eller vävnader skulle vara tillämpliga för att studera detta fenomen noggrant.
På grund av korallrevens betydelse och de stora hot de har stått inför, särskilt under de senaste två decennierna2, har koraller blivit fokus för forskning för skydd och restaureringsändamål över hela världen13. Utvecklingen av tillvägagångssätt och experimentella system som är tillförlitliga, reproducerbara och erbjuder minimal miljöpåverkan för att studera koraller är dock en stor kamp inom detta område.
Mikropropagation definieras som in vitro-spridning av en organisms genotyp genom odling av dess biologiska material i kontrollerade kärl14,15. Odlingen av celler, vävnader och organ har varit avgörande för växt- och djurbiologin under de senaste decennierna. Det möjliggör massreproduktion av organismer i laboratorier, snabb bedömning av olika behandlingar (såsom läkemedel och läkemedel) och direktstudie av cellfunktion 14,15,16,17. I allmänhet har in vitro-modeller varit användbara för att komplettera och fördjupa studierna av olika organismer under bättre kontrollerade fysiska och kemiska förhållanden. På grund av fördelarna med in vitro-odlingstekniker har olika djurcells- och vävnadsodlingstekniker utvecklats, optimerats och använts som viktiga verktyg inom många forskningsområden, där flera cellinjer har studerats och kommersialiserats för många applikationer 16,17,18.
Många framsteg i kunskapen om cell- och vävnadsodling har gjorts sedan den första djurvävnadskulturen 188217, såsom användning av naturliga och syntetiska medier, uppfinningen av etablerade cellinjer och utvecklingen av 3D-media för att odla en mängd celltyper på ett bättre sätt16,17, 18,19. Cellbiologins område har dock mest fokuserat på en utvald grupp modellorganismer, medan många taxa fortfarande inte har väletablerade in vitro-kulturer av celler, vävnader eller organ20. Till exempel, i korallforskning, har inga odödliga cellinjer använts i stor utsträckning för forskning, vilket begränsar korallcellsforskning till användningen av primära cellkulturer. Dessa kulturer har livskraft begränsad till några veckor21, utan studier som registrerar överlevnaden av enskilda celler från alla korallvävnader i mer än 13 dagar fram till början av 202122. Den första rapporten om hållbara korallcellinjer som publicerades var med Acropora tenuis-celler som levde upp till 6 månader, och nyttan av dessa celler för framtida forskning återstår att utforska23.
För att övervinna begränsningarna i odling av korallcellkulturer och för att upprätthålla en laboratoriekultur som bevarar den övergripande vävnadsorganisationen av koraller har användningen av isolerade polyper nyligen föreslagits som en modell för korallbiologisk forskning24,25. Polyps är de anatomiska enheterna av koraller, och var och en av dem har en mun som ligger i mitten av deras orala skiva och är ansluten till andra polyper av coenosarc i sin aborala region26. Separationen av levande polyper sker naturligt genom processen med polyp bail-out, där akut stress orsakar matsmältningen av coenosarc mellan polyperna, som sedan kan lossna från kolonins skelett 25,27,28. Detta fenomen har rapporterats förekomma i en mängd olika taxa, inklusive oktokoraler29,30,31, svarta koraller32 och scleractinian koraller 25,27,28,32,33, och har kopplats till flera miljöstressorer, såsom brist på kalcium i vatten 24,34, ökad surhet35, hyperosmotiska förhållanden 25,27,32,36, höga temperaturer36,37, svält33, luftexponering25,30 och insekticidförorening28,38. Polyp bail-out har till exempel rapporterats i pocilloporid koraller19, som är brett spridda över hela världen och ofta används som modeller i korallforskning. Arter som tillhör denna grupp, såsom Pocillopora damicornis och Styllophora pistillata, har genererat cirka 30-40 mikropropagat från ett 5 mm fragment25. Detta nummer betonar fördelen med att använda polyp bail-out som en metod för korallmikropropagation, eftersom det skapar möjligheten att generera många genetiskt identiska individer från en liten bit korall. Användningen av isolerade polyper för forskning har också samma fördelar som cellkulturer när det gäller möjligheten att odlas i kontrollerade laboratoriemiljöer, såsom kolvar och petriskålar. Dessutom har mikrofluidiska plattformar för att upprätthålla levande polyper visat att dessa mikropropagater kan förvaras i relativt billiga och lättrepresenterade miljöer, med kontrollerat vattenflöde, yta och temperatur24,25. Dessa mikrofluidikplattformar kan också användas för att visualisera levande korallstrukturer under ett mikroskop direkt 24,25.
I den här artikeln sammanfattar och demonstrerar vi de tekniker som har utvecklats för att isolera enskilda korallpolyper från sina kolonier, vilket visar hur man behåller dem i laboratorieförhållanden för långsiktig kultur. De metoder som diskuteras inkluderar polypräddning genom hyperosmotiska förhållanden genom avdunstning och pumpning av havsvatten med hög salthalt och inkubation i kalciumfritt havsvatten.
Protocol
För den aktuella studien samlades en koloni som tillhör korallarterna Pocillopora verrucosa från Al Fahal-revet (22.305118 N; 38.964568 E) av SCUBA genom dykning med en hammare och mejsel. Kolonins släkt identifierades morfologiskt, och dess art klassificerades som P. verrucosa baserat på tidigare publicerat arbete, inklusive Pocillopora från Röda havet, vilket indikerar att ur genetisk synvinkel är arten som finns i detta område P. verrucosa39,40. Al Fahal-revet är inte en del av ett skyddat miljöområde, och inga särskilda tillstånd behövdes för korallinsamling. Kolonin hölls i ett 300 L akvarium i en månad innan den fragmenterades och fick sina polyper "räddade". Akvariet hölls vid 26 °C med två akvarievärmare, tre pumpar och två ljuskällor (se materialtabell) och upprätthöll en 12 timmars ljuscykel. Akvariet temperatur upprätthölls genom att ansluta var och en av de två värmare till en temperaturregulator. Ljusemissionen programmerades att börja klockan 6 och sluta klockan 6, vilket gav en bestrålningskurva som toppade klockan 12 med 230 μmolfotoner m−2s−1.
1. Polyp bail-out genom hög salthalt efter vattenavdunstning
OBS: Denna metod anpassades från Shapiro et al.25. Om du använder andra arter än Pocillopora verrucosa, bör polypernas storlek beaktas innan storleken på fragmentet som ska skäras bestäms.
- Skär små fragment (mindre än 1 cm långa) från en korallkoloni med diagonal skärtång (se materialtabell).
OBS: Anpassa skärverktygen efter de korallarter som används. Diagonal tång är användbara för att skära koraller med smala grenar. I den aktuella studien skars ett fragment för varje behandling, men antalet och storleken på fragmenten kan variera beroende på antalet önskade polyper. Storleken på de skurna fragmenten får inte överstiga vattnets djup efter avdunstning, så korallerna stannar helt inne i vattnet efter att processen är klar. - Placera de skurna fragmenten i små petriskålar fyllda med 12 ml havsvatten som korallkolonin har acklimatiserats till. Detta kan vara artificiellt havsvatten (se materialtabell) eller filtrerat havsvatten med samma salthalt som korallkolonin sattes in i före fragmenteringen.
OBS: Det är viktigt att täcka fragmentet helt med vatten. Om 12 ml i en petriskål inte räcker för att täcka det skurna fragmentet, optimera behållaren och volymen därefter. I den aktuella studien samlades det använda vattnet upp från Röda havet och dess salthalt var 40 PSU, mätt med en multiparametermätare (se materialtabell). - Låt plattan stå öppen i ~24 timmar vid omgivningstemperatur så att vattnet kan avdunsta och salthalten gradvis öka. När vävnadsförtunning är observerbar mellan polyper, fortsätt till steg 1.4.
OBS: Efter att inkubationstiden har gått måste salthalten i vattnet vara cirka 40% högre än i början, och polyperna måste vara redo att lossas från skelettet. - Använd en 1 ml överföringspipett och skapa ett skonsamt flöde nära korallvävnaden. Flödet kommer långsamt att hjälpa till att fullständigt avlägsna polyperna som redan har smält vävnaden runt dem från skelettet.
OBS: När vattenflödet skapas med pipetten måste separata polyper eller grupper av polyper komma från skelettet som flingor. Om ett grumligt ämne lossnar istället indikerar det vävnadsdöd eller sönderdelning, vilket innebär att korallerna inkuberades för länge eller i ett för stressigt tillstånd (i detta fall hög salthalt). Det är mycket viktigt att göra ett försiktigt flöde av vatten för att lossa polyperna, eftersom ett starkare flöde kan orsaka fysisk skada på dem. - Byt långsamt ut vattnet i petriskålen mot isosmotiskt vatten (använd samma vatten som i steg 1.2.) med en pipett. Ett 50% vattenutbyte över 10 minuter räcker för att acklimatisera polyperna tillbaka till ett icke-stressande salthaltstillstånd.
OBS: När korallkolonier av pocilloporid-arten Pocillopora verrucosa från Röda havet användes, utfördes tester för att bestämma under vilka specifika förhållanden korallerna från denna unika miljö skulle rädda sig. Det är viktigt att lyfta fram Röda havets höga salthalt jämfört med de flesta andra revmiljöer.
2. Polypräddning genom havsvattenförsörjning med hög salthalt
OBS: Denna metod anpassades från Chuang et al.27.
- Förbered 3 liter havsvatten med hög salthalt genom att tillsätta NaCl till havsvatten tills salthalten ökar med 85 %, mätt med en salthaltssond.
OBS: I den aktuella studien framställdes ett 74 PSU havsvatten med hög salthalt från 40 PSU havsvatten från Röda havet. - Skär små fragment av koraller enligt beskrivningen i steg 1.1.
- Placera de skurna fragmenten i en 10 L behållare fylld med 3 L isosmotiskt havsvatten (i detta fall havsvatten med icke-stressande salthalt för korallerna, samma som används i steg 1.2) anslutet till en peristaltisk pump (se materialtabell).
OBS: För bättre underhåll av korallhälsan kan temperaturregulatorer, luftpumpar och lampor läggas till för att simulera samma akvarieförhållanden som kolonin tidigare utsattes för. Under inkubationen i detta arbete förvarades korallfragmenten i behållare vid 26 °C, under en 12 timmars daglig ljuscykel. Vattenrörelsen och homogeniseringen av temperaturen upprätthölls av luftpumpar. - Fyll behållaren som innehåller korallfragment med havsvatten med hög salthalt som framställs i steg 2.1 med hjälp av den peristaltiska pumpen i 24 timmar med en hastighet på 126 ml/h. Tillsätt totalt 3 L vatten vid en ökande salthalt på cirka 40%.
OBS: Vatten med hög salthalt kan produceras helt enkelt genom att tillsätta NaCl till havsvatten tills det når den avsedda salthalten. - Skapa ett mjukt vattenflöde med en pipett för att frigöra polyperna från skelettet (steg 1.4.).
- Byt långsamt ut vattnet i vilket polyperna finns mot isosmotiskt vatten (steg 1.5.). Fortsätt sedan till steg 4 eller steg 5.
3. Polyp bail-out genom kalciumfri havsvatteninkubation
OBS: Denna metod anpassades från Pang et al.24.
- Förbered kalciumfri lösning av artificiellt havsvatten (CaFSW) genom att tillsätta 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 g MgSO4, 11,94 gMgCl2, 3,42 gNa2S04och 0,286 g NaHCO3 (se materialtabell) till 1 liter avjoniserat vatten.
OBS: Denna lösning justerades från tidigare protokoll för att vara bättre lämpad för koraller anpassade till en salthalt på 40 PSU. För koraller anpassade till andra salthaltsförhållanden, använd samma andel salter men justera den totala massan av lösta ämnen för att få den salthalt som är bättre lämpad för de koraller som används. - Skär små fragment av koraller enligt beskrivningen i steg 1.1.
- Sänk ner korallfragmenten i petriskålar fyllda med CaFSW som tidigare framställts (steg 3.1) och inkubera dem i orbitalinkubatorer med en rotationshastighet på 80 varv / min i 3 timmar.
OBS: Återigen är det viktigt att täcka fragmentet helt med vatten. Om en petriskål inte räcker för att täcka fragmentet, optimera behållaren och volymen enligt det experimentella behovet. - Överför fragmenten till petriskålar eller 6-brunnsplattor fyllda med 20% Dulbeccos modified eagle media (DMEM) och 100 mg/ml ampicillinlösning (se materialtabell) beredd med 40 PSU artificiellt havsvatten. Inkubera fragmenten vid 26 °C och 80 rpm, byt ut media varje dag tills vävnadens matsmältning kan observeras mellan polyperna och enskilda polyper börjar lossna från skelettet.
OBS: I de flesta fall är vävnadsuppslutningen fullständig inom 20 timmar efter inkubation i detta medium, och inga utbyten behövs. - Överför polyperna till steriliserat havsvatten för initial återhämtning med en pipett. Efter 1 h inkubation, fortsätt till steg 4 eller steg 5.
4. Polypunderhåll i petriskålar
- När polyperna återförs till filtrerat havsvatten med icke-stressande salthalt, välj livskraftiga polyper genom att observera vävnadsintegritet och rörelse orsakad av ciliärt flöde under ett stereomikroskop.
- Placera de valda polyperna i en petriskål av glas eller plast och täck petriskålen med ett planktonnät (200 μm maskstorlek, se materialtabell) så att polyperna inte flyter bort från skålen.
OBS: Nätnätets storlek kan variera beroende på polypernas storlek. Det är viktigt att notera att näten måste ha porer som är mindre än polyperna och tillåter vattenutbyte och ljuspenetration. - Placera petriskålen i ett akvarium med lämpliga förhållanden för de korallarter som används.
OBS: I den aktuella studien var förhållandena 40 PSU-filtrerat havsvatten vid 26 °C och en 12-timmars ljuscykel. - Öppna petriskålarna minst en gång i veckan för att förnya vattnet och rengöra diskarna. Detta steg är viktigt för att eliminera alger överväxt som kan konkurrera med eller skada korallpolyperna genom att lokalt släppa ut giftiga föreningar.
5. Polyp underhåll i inkubatorer
- Välj livskraftiga polyper enligt beskrivningen i steg 4.1.
- Placera polyperna i 75 cm2 ytkolvar fyllda med 50 ml isosmotiskt havsvatten med hjälp av överföringspipetter.
OBS: I det aktuella arbetet användes filtrerat havsvatten som samlats in från Röda havet för polypunderhåll. Vatten med samma egenskaper som det som används i steg 1.2 kan användas. - Stäng kolvarna och flytta dem till inkubatorer. Ställ in kuvöserna på 12 timmars ljuscykler vid 26 °C och 40 rpm. Byt ut 50% av vattenvolymen var 4:e dag och överför innehållet till rena kolvar när/om de blir fulla av alger eller biofilm på väggarna.
OBS: Bilderna togs med ett helt apokromatiskt zoomsystem utrustat med en HD-kamera (se materialtabell) för de representativa resultaten.
Representative Results
Polyp bail-out inducerades i korallfragment som tillhör en enda koloni av arten P. verrucosa enligt tre olika metoder (Figur 1). Räddningsaktion inducerad av hög salthalt efter att vattenavdunstningen var klar efter 24 timmars inkubation av korallfragment i petriskålar vid omgivningstemperatur fylld med vatten initialt vid 40 PSU, som sedan nådde en slutlig salthalt på 59 PSU när processen var över (figur 2A-C, I). Räddningsaktion genom saltvattenförsörjning uppnåddes också efter 24 timmars inkubation i vatten initialt vid 40 PSU som nådde en salthalt på 52 PSU efter 12 h och 59 PSU i slutet av processen, efter 24 h (Figur 2D-F,I). I båda experimenten var en ökning av salthalten ansvarig för induktionen av vävnadsuppslutning av polyperna. Efter 12 h orsakade tillståndet med hög salthalt sammandragningen av polyperna i samband med den gradvisa gallringen av coenosarc, vilket i slutändan orsakade den slutliga avlägsnandet av polyperna efter 24 timmar. Räddningsinduktionen genom inkubation i kalciumfritt havsvatten slutfördes efter en 3h inkubation i CaFSW följt av en 20h inkubation i 20% DMEM-media (Figur 2G-H). Vävnaden lossnade från skelettet i alla tre metoderna efter att ha skjutit bort den med en pipett tills individualiserade korallpolyper (figur 3A-C) och "vävnadsbollar" genererades.
Efter avlägsnandet samlades polyperna från alla tre metoderna och fick återhämta sig i havsvatten innan de tilldelades petriskålar täckta med nät eller cellkolvar. Polyperna erhållna från avdunstningen och vattenförsörjningsmetoderna upprätthölls i petriskålar inuti akvarier och överlevde i 6 veckor respektive 8 veckor (figur 3D och figur 3F). Dessa mikropropagater behöll den vanliga anatomin hos polyper och presenterade tentaklar, basalskivor och munnar1. Polyperna erhållna genom inkubationen i kalciumfritt havsvatten hade en kort livslängd och överlevde upp till 1 dag, varefter deras vävnad dissocierades. Polyper erhållna från havsvattenindunstningsmetoden som förvarades i cellodlingskolvar inuti inkubatorer överlevde i upp till 3 veckor utan dissociation av vävnader (figur 3F). I alla fall, även om polyperna inte kunde fästa vid substratet, var de visuellt friska och behöll sin färg, med zooxanthellae-celler som fortfarande var synliga inuti deras vävnader1.
Figur 1: Schematisk representation av de tre olika testade metoderna för polyp bail-out induction (vänster) följt av illustrationen av två metoder för att upprätthålla de förvärvade polyperna under laboratorieförhållanden (höger). (A) Representation av metoden för polyp bail-out genom vattenavdunstning. (B) Återgivning av metoden för polypräddning genom havsvattenförsörjning med hög salthalt. C) Återgivning av metoden för polypräddning genom kalciumfri inkubation av havsvatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bilder av polyp bail-out-processen inducerad av tre olika metoder med hjälp av fragment av korallarten P. verrucosa. (A-C) Ett korallfragment vid 0 h, 12 h respektive 24 h efter inkubation i en petriskål med användning av vattenindunstningsmetoden. (D-F) Ett korallfragment vid 0 h, 12 h respektive 24 h efter inkubation med användning av havsvattenförsörjningsmetoden med hög salthalt. (G,H) Korallfragment som utsätts för den kalciumfria sjövatteninkubationsmetoden före respektive efter. Inkubationerna i kalciumfritt artificiellt havsvatten var för 3 h och i 20% DMEM för 21 h. (I) Grafisk representation av salthaltsvärdena i PSU av havsvattnet över tid under vattenavdunstningen och hög salthalt havsvattenförsörjningsräddningsmetoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bilder av P. verrucosa-polyper erhållna från de tre demonstrerade räddningsinduktionsförfarandena. (D) Bilden av en korallpolyp erhållen från avdunstningsmetoden efter att ha överlevt 6 veckor i en petriskål. (E) Bilden av en korallpolyp erhållen från saltvattenförsörjningsmetoden efter att ha överlevt 8 veckor i en petriskål. (F) Bilden av en korallpolyp erhållen från avdunstningsmetoden efter att ha överlevt 3 veckor i en cellodlingskolv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Polypernas överlevnadsgrad efter att ha lämnats in till räddningsprocesser och den tid som krävs för att processen ska slutföras varierar mellan tidigare rapporterade forskning 25,33,41, vilket möjligen förklaras av de olika experimentella metoder som tillämpas i varje studie. Till exempel har olika korallarter, eller till och med koraller från samma art men acklimatiserat sig till olika miljöförhållanden (t.ex. koraller från Röda havet), olika trösklar till salthalterna. Den valda räddningsmetoden och laboratorie-/akvarieförhållandena spelar också viktiga roller för resultaten. I vissa fall har underhållet av korallmikropropagat under laboratorieförhållanden överträffat överlevnadstiden för korallcellskulturer genom att nå månader av överlevnad i azooxanthellat3 3,41 och zooxanthellat25 koraller. Tiden för att polypräddningsprocessen ska vara klar har också varierat i olika studier, allt från några timmar2 5,2 7,30 till veckor35 av inkubation utsatt för stressorn som är ansvarig för att orsaka räddningsaktion. En annan variabel som ska beaktas när man studerar polyp bail-out är återhämtningen av polyperna efter exponering för den akuta stress som utlöste deras frisättning. Det är fortfarande diskutabelt om polyper efter räddningsaktion är i tillräckligt bra skick för att användas som modeller för att studera korallbiologi. Återhämtningen av deras vävnader efter nedbrytningen av coenosarc är en fråga om oro vid användning av dessa mikropropagat. Polyper i många studier, inklusive nutiden, har dock kunnat presentera zooxanthellae-celler inuti sina vävnader och yttre morfologier med intakt oral-aboral polarisering och tentakler veckor efter räddningsaktion 25,27,32,36. Tidigare studier har också funnit att, efter att ha befriats från akut stress, har frigjorda korallpolyper som utsätts för mycket saltlösning eller uppvärmt havsvatten kunnat återställa uttrycket av gener relaterade till processer som apoptos, proteolys och celldelning till nivåer som liknar de som hittades före räddningsaktion32,36 och till och med för att öka uttrycket av gener relaterade till vävnadsläkning36.
När det gäller skillnaden i överlevnad mellan metoder är det viktigt att lyfta fram att den här tiden kan variera mellan olika experiment även om samma tekniker används, och det kan relateras till hälsan hos de använda fragmenten och korrekt underhåll av polyperna efter räddningsprocessen. När det gäller räddningsaktionen genom kalciumfri havsvatteninkubation begränsades polypöverlevnaden till 1 dag. Således kan man dra slutsatsen att metoden inte är väl lämpad för den långsiktiga överlevnaden av de studerade arterna, eller en bättre anpassning av tekniken för P. verrucosa koraller från Röda havet måste göras. De rapporterade resultaten visade att en längre överlevnadstid erhölls med metoderna baserade på den gradvisa ökningen av salthalten, när polyperna utsattes för droppning av vatten med hög salthalt. Denna metod kan ge en mer kontrollerad ökning av salthalten än avdunstningsmetoden, samtidigt som den inte är ansvarig för en ökning av koncentrationen av andra ämnen som finns i havsvattnet, inklusive korallens metaboliska avfall, vilket är potentiellt giftigt för organismen. Av alla dessa skäl har denna metod föreslagits som ett säkrare alternativ för att upprätthålla friska polyper27. Även om denna metod har antagits vara säkrare för polyphälsa och kunna producera polyper som lever längre, ett faktum som bekräftades i denna aktuella publikation, behövs ytterligare undersökningar för att bekräfta det. Båda hög salthaltsinducerade räddningsexperimenten visade en fullständig avlägsnande av polyper efter att salthalten nådde 59 PSU på 24 timmar. Om salthalten ökas förbi den nivå där räddningsaktionen är klar kommer ytterligare stress att orsakas polyperna, vilket minskar deras chans att överleva och återhämta sig från den akuta stressbehandlingen. Därför rekommenderas det inte att behålla polyperna längre i sådana salthalter. Vid utförande av räddningsinduktionsmetoden genom exponering för kalciumfritt havsvatten erhölls en fullständig frigöring från en 3-timmars inkubation i kalciumfritt artificiellt havsvatten, vilket innebär att ytterligare exponering för detta medium inte heller rekommenderas.
För att ta itu med de metoder som var mer adekvata för studier av korallpolyper i laboratorie- / in vitro-undersökningar fokuserade denna studie endast på tre procedurer som tog nära 24 timmar för att räddningsprocessen skulle vara fullständig och användes i studier som involverade långsiktigt underhåll av korallpolyper från scleractinian koraller. Andra metoder som rapporterades ta betydligt längre tid än denna tid var inte engagerade. Uppgörelsen av polyper till ett substrat försöktes inte i denna studie, som fokuserade på att producera polyper som kunde överföras till olika miljöer eller enkelt samlas in för analyser med hjälp av engångspipetter. Resultaten visar att polyper från korallarten P. verrucosa hölls vid liv, med tillhörande zooxanthellae-celler, hälsosam visuell status och en bevarad grov yttre anatomisk struktur, i upp till 8 veckor, även utan bindning till ett substrat. Dessa resultat indikerar att fler biologiska replikat kan genereras från enstaka korallfragment med hjälp av några av de tekniker som demonstrerats i denna studie. Sådana biologiska replikat kan förvaras i kontrollerade miljöer (t.ex. petriskålar och kolvar) och underhållas under laboratorieförhållanden för månadslånga experiment och användas för flera ändamål.
Sedan de första tillfälliga beskrivningarna av polyp bail-out42,43 har nya protokoll upprättats för att hitta mer standardiserade metoder för att inducera polypfrisättning och upprätthålla sådana polyper vid liv, som kan användas för framtida forskningsapplikationer. Dessa inkluderar att undersöka olika aspekter associerade med korall holobiontfysiologin44 och värd-mikrobiominteraktioner45, de molekylära mekanismerna som är involverade i korallblekning 5,25 och hälsa, motståndskraft och skydd av korall holobionten 12,13,46,47 . Dessutom kan frigjorda korallpolyper användas för applikationer utanför forskningsområdet och har föreslagits vara användbara för att skapa propaguler som kan fästa vid ett substrat och växa, vilket potentiellt skapar flera korallindivider som kan användas för restaureringsändamål när standardiserade protokoll för räddningsaktion blir utbredd28 . Sammantaget, även om mer djupgående experiment med räddade polyper bör utföras för att standardisera metoden, har det visat sig att polyp bail-out är ett reproducerbart tillvägagångssätt som kan tillämpas som ett verktyg i korallforskning för flera ändamål.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Adam Barno och Francisca Garcia för deras stöd i experimenten och övervakningen av korallpolyperna. Vi tackar också KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab för deras hjälp när det gäller akvariumunderhåll och infrastruktur. Studien finansierades av KAUST-anslagsnummer BAS/1/1095-01-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A.
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
