Summary
Talrige nye viruslignende sekvenser er fundet i myg på grund af den omfattende brug af sekventeringsteknologier. Vi leverer en effektiv procedure til isolering og forstærkning af vira ved hjælp af hvirveldyr og mygcellelinjer, som kan tjene som grundlag for fremtidige undersøgelser af myggeassocierede vira, herunder myggebårne og myggespecifikke vira.
Abstract
Med den brede anvendelse af sekventeringsteknologier er mange nye viruslignende sekvenser blevet opdaget i leddyr, herunder myg. De to hovedkategorier af disse nye myggeassocierede vira er "myggebårne vira (MBV'er)" og "myggespecifikke vira (MSV'er)". Disse nye vira kan være patogene for både hvirveldyr og myg, eller de kan bare være symbiotiske med myg. Entitetsvira er afgørende for at bekræfte disse viras biologiske egenskaber. Således er der beskrevet en detaljeret protokol her for virusisolering og forstærkning fra feltindsamlede myg. Først blev myggeprøverne fremstillet som supernatanter af myggehomogenater. Efter centrifugering to gange blev supernatanterne podet til enten mygcellelinje C6/36 eller hvirvelcellelinje BHK-21 til virusamplifikation. Efter 7 dage blev supernatanterne opsamlet som P1-supernatanter og opbevaret ved -80 °C. Dernæst blev P1-supernatanter passeret to gange mere i C6/36- eller BHK-21-celler, mens cellestatus blev kontrolleret dagligt. Når cytopatogen virkning (CPE) på cellerne blev opdaget, blev disse supernatanter indsamlet og anvendt til at identificere vira. Denne protokol tjener som grundlag for fremtidig forskning i myg-associerede vira, herunder MBV'er og MSV'er.
Introduction
Myg er en gruppe af vigtige patogene leddyrvektorer. Der er cirka 3.500 arter af myg i familien Culicidae 1,2. Udviklingen af high-throughput sekventeringsteknologier har ført til opdagelsen af mange nye, viruslignende sekvenser i myg fra forskellige dele af verden3. Generelt kan disse myg-associerede vira klassificeres i to hovedgrupper: MBV'er og MSV'er.
MBV'er er en gruppe af forskellige vira, der er årsagsmidler til mange sygdomme hos mennesker eller dyr, såsom gul feber-virus (YFV), dengue-virus (DENV), japansk encefalitisvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley fever-virus (RVFV)4. De har alvorligt truet folkesundheden ved at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV'er opretholder naturligt en livscyklus mellem forskellige værter gennem transmission fra en inficeret myg til en naiv vært såvel som fra en virusinficeret vært og til en fodringsmyg5. Derfor kan disse vira inficere både mygcellelinjer og hvirveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSV'er, som omfatter Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe af insektspecifikke vira 1,6,7. I de senere år har der været en stigning i opdagelsen af nye MSV'er, og nogle af disse MSV'er har vist sig at have en indvirkning på transmissionen af MBV'er. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infektion i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikation på et tidligt stadium8. Et andet insektspecifikt flavivirus, cellefusionsmiddelvirus (CFAV), har vist sig at hæmme udbredelsen af DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-myg 9. Således er denne protokol en nyttig tilgang til isolering af mygassocierede vira og kan hjælpe med yderligere forskning i fordelingen af patogener relateret til myg og kontrol af mygbårne sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mygprøveudtagning og sortering
- Fang de voksne myg gennem lysfælderne MXA-02 eller kuldioxid myggefælder i marken.
- Dræb de indsamlede myg ved at dyppe i flydende nitrogen10,11. Transporter dem til laboratoriet med kølekædens logistiksystem12.
BEMÆRK: Tøris blev primært brugt i kølekædens logistiksystem. - (Valgfrit) Hvis prøvestederne var i nærheden af laboratoriet, skal du direkte sende de levende myg i netfælderne til laboratoriet og aflive dem ved at fryse ved ≤-20 ° C i 30 min4.
- Lav en morfologisk identifikation af de indsamlede myg gennem værktøjsbogen13 til klassificering og identifikation af myg.
BEMÆRK: Om nødvendigt kan DNA-stregkodning bruges til at klassificere og identificere myg14,15. - Baseret på prøveudtagningsdatoer og steder skal du tildele dem i forskellige puljer og derefter opbevare dem i 2-5 ml rør.
- Tegn en tabel for at registrere hvert rør med mygarter, nummer, prøveudtagningskode, dato og steder.
- Udskriv etiketterne med prøveudtagningskoder og fastgør dem til rørene.
- Opbevar rørene med myggeprøverne ved -80 °C indtil yderligere analyse.
2. Myg slibning
- Placer 20-50 myg i hvert 2 ml sterilt rør med 3 mm keramiske perler med 1,5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium indeholdende 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B opløsning.
BEMÆRK: Opbevar rørene på is eller på en dejlig bakke. - Homogeniser myggene med en lavtemperaturvævshomogenisator ved formaling i 30 s ved 70 Hz ved 4 °C i tre cyklusser16.
- Blandingerne centrifugeres ved 15 000 × g i 30 minutter ved 4 °C, og supernatanterne overføres til nye glas.
- Supernatanterne centrifugeres igen ved 15.000 × g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne myggerester12.17.
BEMÆRK: Supernatanterne kan om nødvendigt filtreres med 0,22 μm filtre. - Supernatanterne (P0) anbringes i opbevaringsrør med skruelåg på 2 ml (200 μL pr. glas), og de opbevares ved -80 °C.
3. Fremstilling af celler og vedligeholdelsesmedium til cellekultur
BEMÆRK: Mygcellelinje C6/36 (Aedes albopictus RNAi-mangelfuld) og hvirvelcellelinje BHK-21 (babyhamsternyre) blev anvendt til virusforstærkning og isolering.
- 1 × 106 C6/36-celler podes i en 75 cm 2 kolbe med 10 ml RPMI-medium suppleret med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % penicillin/streptomycin (P/S) ved 28 °C i en 5 % CO2 befugtet inkubator.
- 1 × 106 BHK-21 celler podes i en 75 cm 2 kolbe med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1% P/S ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
BEMÆRK: Cellerne blev passeret to eller tre gange om ugen17,18. - Cellerne dyrket i en 75 cm2 kolbe (C6/36 eller BHK-21 celler) hældes i pladerne med 24 brønde (C6/36 pr. brønd: 1,4 × 105; BHK-21 pr. Brønd: 0,8 × 105).
- Pladerne med 24 brønde anbringes ved 28 °C eller 37 °C natten over.
- Overhold cellerne under mikroskopet og bekræft, om cellesammenløbet i hver brønd er 80% -90%.
- Forbered vedligeholdelsesmediet til cellekultur (500 ml).
BEMÆRK: For C6/36 var mediet RPMI-medium suppleret med 2 % FBS og 2 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-opløsning. For BHK-21 var mediet DMEM-medium suppleret med 2% FBS og 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-opløsning.
4. Virusisolering
BEMÆRK: Alle trin blev udført i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) laboratorium. Biosikkerhedslaboratoriets krav til sikkerhedsniveau blev bestemt af biosikkerhedsrisikovurderingen baseret på reglerne i forskellige lande og regioner. Processen skal udføres i et biosikkerhedsskab.
- Cellekulturmediet fjernes fra pladerne med 24 huller, og der tilsættes 100 μL af cellekulturvedligeholdelsessubstratet og 100 μL af myggehomogenatets supernatant (P0) til hvert hul.
- Pladerne inkuberes ved 28 °C eller 37 °C i 60 minutter, og ryst dem forsigtigt hvert 15. minut for at forhindre celletørring.
- Supernatanten fjernes og hvert hul skylles forsigtigt med 600 μL vedligeholdelsessubstrat for cellekultur for at fjerne snavs helt.
- Der tilsættes 800 μL vedligeholdelsessubstrat til cellekultur i hvert hul, og pladerne opbevares i en 5 % CO2 befugtet inkubator ved 28 °C eller 37 °C i 7 dage.
- Overvåg celletilstanden for hver brønd under mikroskopet dagligt15.
- Supernatanterne fra cellerne (P1-supernatanterne) indsamles på 7. dagen og supernatanterne opbevares ved -80 °C.
- Gentag trin 4.1-4.6 2x for at få P2- og P3-supernatanter.
BEMÆRK: I trin 4.3 var skylning af hvert hul forsigtigt med 600 μL cellekulturvedligeholdelsesmedium valgfrit for P2 og P3. - Afhængigt af hvilken brønd der viser den cytopatogene virkning (CPE) - celler dør, pyknosis og løsner sig fra overfladen; fusion med tilstødende celler til dannelse af syncyti; eller udseendet af nukleare eller cytoplasmatiske inklusionslegemer - tilsæt 300-400 μL af supernatanten af denne CPE godt ind i hver brønd i de nye 6-brøndplader, der indeholder celler (cellesammenløbet var 80% -90%) for i høj grad at forstærke viraene.
- Supernatanterne opsamles og prøves i 2 ml opbevaringsrør med skruelåg (500 μL pr. reagensglas). Opbevar dem ved -80 °C.
BEMÆRK: Efter tre generationer med successiv passaging i celler blev prøverne, der ikke inducerede CPE, kasseret. Om nødvendigt kan generationerne af successiv passaging i celler øges.
5. Påvisning af virale sekvenser ved RT-PCR
- Total RNA ekstraheres fra 200 μL af den virale supernatant ved hjælp af et viralt RNA-minisæt16.
BEMÆRK: Her blev et automatiseret nukleinsyreekstraktionssystem brugt til at ekstrahere total RNA efter instrumentproducentens instruktioner. - Konverter RNA'et til cDNA ved at følge RT-PCR-kitinstruktionerne ved hjælp af et PCR-instrument.
- Tilsæt 15 μL RNA blandet med 1 μL tilfældige primere i PCR-røret. Anbring røret ved 70 °C i 5 minutter, og læg det derefter på is i 5 minutter.
- Der tilsættes 5 μL 5x buffer og 25 μL blanding (10 mM dNTP, 40 E/μL RNasehæmmer og 200 E/μL M-MLV) i glasset, og røret anbringes ved 42 °C i 60 minutter og 95 °C i 10 minutter.
- Opbevares tuben ved -20 °C.
- Brug et PCR-sæt og universelle primere (tabel 1) til at detektere vira ved PCR.
- For arbovirus opsættes PCR-reaktionssystemet (i alt 30 μL) med følgende komponenter: 3 μL 10x Taq-buffer, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL fremadgående primer (10 μm), 1 μL omvendt primer (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U / μL), 19,7 μL ddH 2 O og2μL cDNA.
- Til påvisning af flavivirus indstilles reaktionsprocessen som: trin 1: 35 cyklusser à 94 °C i 30 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 30 s; trin 2: 72 °C i 10 min.
- Til påvisning af alfavirus indstilles reaktionsprocessen som: trin 1: 35 cyklusser a 94 °C i 30 s, 50 °C i 30 s og 72 °C i 30 s; trin 2: 72 °C i 10 min.
- Til påvisning af bunyavirus indstilles reaktionsprocessen som: trin 1: 35 cyklusser à 94 °C i 30 s, 50 °C i 30 sek. og 72 °C i 30 s; trin 2: 72 °C i 10 min.
- Detekter PCR-amplifikationsprodukterne med 1% agarosegelelektroforese og send dem til sekventeringsanalyse.
BEMÆRK: Hvis forholdene tillader det, kan supernatanterne underkastes næste generations sekventeringsanalyse for at identificere nye vira og opnå hele virusgenomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter podning med supernatanterne af myggehomogenaterne (P0) udviste C6/36-cellerne et bredt intercellulært rum, og eksfolierede celler blev observeret ved 120 timer (figur 1A) sammenlignet med de ikke-inokulerede celler (kontrol) på samme tid (figur 1B). Efter inkubation af BHK-21-cellerne med P3-supernatanterne blev der observeret synlig CPE i BHK-21-cellerne ved 48 timer (figur 1C) i modsætning til kontrolcellerne (figur 1D). PCR blev udført for at bestemme virale arter. De universelle primere til påvisning af flavivirus, alfavirus og bunyavirus blev kommercielt syntetiseret (tabel 1). Et PCR-produkt til bunyavirus Ebinur Lake Virus blev indstillet som en positiv kontrol og tilføjet til bane 1. De universelle primere til bunyavirus, flavivirus og alfavirus blev brugt til at generere PCR-produkterne til den virale supernatant, som derefter blev tilsat henholdsvis bane 2, 3 og 4. De anslåede størrelser af PCR-produkterne for flavivirus, alfavirus og bunyavirus var henholdsvis 266 bp, 434 bp og 251 bp. Båndene var kun synlige i bane 2 og den positive kontrol bane 1. Som følge heraf er virusset i supernatanterne sandsynligvis et bunyavirus (figur 2).
Figur 1: CPE-observation af celler efter inkubation med virussupernatanterne. Status for C6/36-celler 120 timer efter infektion (CPE) (A) og status for kontrolcellerne på samme tid (B). Status for BHK-21-celler ved 48 hpi (C) og status for kontrolcellerne (D). Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: CPE = cytopatogen virkning; HPI = timer efter infektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: PCR-resultater for virale supernatanter. Bane 1 repræsenterer den positive kontrol af bunyavirus (Ebinur Lake Virus). Bane 2-4 repræsenterede PCR-resultaterne for supernatanter ved at anvende universelle primere for bunyavirus (251 bp), flavivirus (266 bp) og alfavirus (434 bp). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Virus | Primer | Oligonukleotid (5'→3') | Størrelsen af PCR-produktet (bp) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirus | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabel 1: Universal primere til arbovirus detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne metode var at tilbyde en praktisk måde at isolere myg-associerede vira ved hjælp af forskellige cellelinjer. Det er afgørende at tilsætte antibiotika-antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til myggehomogenaternes supernatanter for at undgå forurening med bakterier eller svampe. Myg og evirale supernatanter i marken skal nedkøles ved -80 °C for at undgå gentagne cyklusser med fryse-optøning.
Et andet kritisk trin i protokollen var slibning. Mygprøver skal pulveriseres grundigt og opbevares på is. Utilstrækkeligt jordet mygvæv kan fremkalde celledød og kan skæve resultaterne af CPE-analyse. Før virusisolering er det nødvendigt at anvende normale myg for at bekræfte slibeparametrene. Slibning skal udføres ved lave temperaturer for at forhindre, at virussen bliver inaktiv under processen.
Denne tilgang kan effektivt isolere og forstærke myg-associerede vira, men er kun acceptabel for vira, der kan vise CPE i pattedyr eller insektcellelinjer. Denne fremgangsmåde er uhensigtsmæssig for vira, der ikke inducerer CPE. Ved hjælp af protokollen kan vi få virale kandidater, der kun indeholder en virustype eller en blanding med forskellige vira. Yderligere undersøgelse - viral oprensning, morfologisk identifikation og plakanalyse - er stadig nødvendig for at opnå den rensede virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z.
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E.
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
