Summary
Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.
Abstract
Con la amplia aplicación de tecnologías de secuenciación, se han descubierto muchas secuencias nuevas similares a virus en artrópodos, incluidos los mosquitos. Las dos categorías principales de estos nuevos virus asociados a mosquitos son "virus transmitidos por mosquitos (MBV)" y "virus específicos de mosquitos (MSV)". Estos nuevos virus podrían ser patógenos tanto para los vertebrados como para los mosquitos, o simplemente podrían ser simbióticos con los mosquitos. Los virus de entidad son esenciales para confirmar las características biológicas de estos virus. Por lo tanto, aquí se ha descrito un protocolo detallado para el aislamiento y la amplificación del virus de los mosquitos recolectados en el campo. Primero, las muestras de mosquitos se prepararon como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Después de la centrifugación dos veces, los sobrenadantes se inocularon en la línea celular de mosquito C6/36 o en la línea celular de vertebrados BHK-21 para la amplificación del virus. Después de 7 días, los sobrenadantes se recolectaron como sobrenadantes P1 y se almacenaron a -80 °C. A continuación, los sobrenadantes P1 se pasaron dos veces más en las células C6/36 o BHK-21 mientras se verificaba diariamente el estado de la célula. Cuando se descubrió el efecto citopatogénico (CPE) en las células, estos sobrenadantes se recolectaron y se utilizaron para identificar virus. Este protocolo sirve como base para futuras investigaciones sobre virus asociados a mosquitos, incluidos MBV y MSV.
Introduction
Los mosquitos son un grupo de importantes artrópodos patógenos vectores. Hay aproximadamente 3.500 especies de mosquitos en la familia Culicidae 1,2. El desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de muchas secuencias novedosas similares a virus en mosquitos de diferentes partes del mundo3. En general, estos virus asociados a mosquitos se pueden clasificar en dos grupos principales: MBV y MSV.
Los MBV son un grupo de virus diversos que son agentes causantes de muchas enfermedades humanas o animales, como el virus de la fiebre amarilla (YFV), el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus del Nilo Occidental (WNV) y el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV)4. Han amenazado gravemente la salud pública al causar morbilidad y mortalidad graves tanto en humanos como en animales en todo el mundo. Los MBV mantienen naturalmente un ciclo de vida entre diversos huéspedes a través de la transmisión de un mosquito infectado a un huésped ingenuo, así como de un huésped infectado por virus y a un mosquito que se alimenta5. Por lo tanto, estos virus pueden infectar tanto líneas celulares de mosquitos como líneas celulares de vertebrados en el laboratorio1.
Los MSV, que incluyen el virus Yichang (YCN), el flavivirus Culex (CxFV) y el virus Chaoyang (CHAOV), son un subgrupo de virus específicos de insectos 1,6,7. En los últimos años, ha habido un aumento en el descubrimiento de nuevos MSV, y se ha encontrado que algunos de estos MSV tienen un impacto en la transmisión de MBV. Por ejemplo, CxFV, que puede ser una infección persistente en Culex pipiens, podría suprimir la replicación del VNO en una etapa temprana8. Se ha encontrado que otro flavivirus específico de insectos, el virus del agente fusionador celular (CFAV), inhibe la propagación del virus DENV y Zika (ZIKV) en mosquitos Aedes aegypti 9. Por lo tanto, este protocolo es un enfoque útil para aislar los virus asociados a los mosquitos y puede ayudar en futuras investigaciones sobre la distribución de patógenos relacionados con los mosquitos y el control de las enfermedades transmitidas por mosquitos.
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Protocol
1. Muestreo y clasificación de mosquitos
- Atrape a los mosquitos adultos a través de las trampas de luz MXA-02 o trampas de mosquitos de dióxido de carbono en el campo.
- Mata a los mosquitos recolectados sumergiéndolos en nitrógeno líquido10,11. Transportarlos al laboratorio mediante el sistema logístico de cadena de frío12.
NOTA: El hielo seco se utilizó principalmente en el sistema logístico de la cadena de frío. - (Opcional) Si los sitios de muestra estaban cerca del laboratorio, envíe directamente los mosquitos vivos en las trampas de red al laboratorio y eutanasiéselos congelándolos a ≤-20 ° C durante 30 min4.
- Realizar una identificación morfológica de los mosquitos recolectados a través del libro de herramientas13 para clasificación e identificación de mosquitos.
NOTA: Si es necesario, el código de barras de ADN podría usarse para clasificar e identificar mosquitos14,15. - Según las fechas y los sitios de muestreo, asígnelos en diferentes grupos y luego guárdelos en tubos de 2 a 5 ml.
- Dibuje una tabla para registrar cada tubo con especies de mosquitos, número, código de muestreo, fecha y sitios.
- Imprima las etiquetas con códigos de muestreo y péguelas a los tubos.
- Mantener los tubos con las muestras de mosquitos a -80 °C hasta un análisis adicional.
2. Molienda de mosquitos
- Coloque 20-50 mosquitos en cada tubo estéril de 2 ml con perlas de cerámica de 3 mm con 1.5 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) que contenga una solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%.
NOTA: Mantenga los tubos en hielo o en una bandeja agradable. - Homogeneizar los mosquitos con un homogeneizador de tejidos a baja temperatura moliendo durante 30 s a 70 Hz a 4 °C durante tres ciclos16.
- Centrifugar las mezclas a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos.
- Centrifugar de nuevo los sobrenadantes a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos de mosquitos12,17.
NOTA: Si es necesario, los sobrenadantes se pueden filtrar utilizando filtros de 0,22 μm. - Alícuota los sobrenadantes (P0) en tubos de almacenamiento de tapón de rosca de 2 ml (200 μL por tubo) y almacénelos a -80 °C.
3. Preparación de células y medio de mantenimiento de cultivos celulares
NOTA: La línea celular de mosquito C6/36 (Aedes albopictus RNAi-deficiente) y la línea celular de vertebrados BHK-21 (riñón de hámster bebé) se utilizaron para la amplificación y aislamiento del virus.
- Inocular 1 × 106 células C6/36 en un matraz de 75 cm2 con 10 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 28 °C en una incubadora humidificada conCO2 al 5%.
- Inocular 1 × 106 células BHK-21 en un matraz de 75 cm2 con 10 ml de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
NOTA: Las celdas fueron pasadas dos o tres veces por semana17,18. - Sembrar las células cultivadas en un matraz de 75cm2 (células C6/36 o BHK-21) en las placas de 24 pocillos (C6/36 por pocillo: 1,4 × 105; BHK-21 por pozo: 0,8 × 105).
- Coloque las placas de 24 pocillos a 28 °C o 37 °C durante la noche.
- Observe las células bajo el microscopio y confirme si la confluencia celular en cada pocillo es del 80% al 90%.
- Preparar el medio de mantenimiento del cultivo celular (500 mL).
NOTA: Para C6/36, el medio fue medio RPMI suplementado con FBS al 2% y solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%. Para BHK-21, el medio fue medio DMEM suplementado con FBS al 2% y solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2%.
4. Aislamiento de virus
NOTA: Todos los pasos se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El requisito de nivel de seguridad del laboratorio de bioseguridad se determinó mediante la evaluación de riesgos de seguridad de la biotecnología basada en las regulaciones de diferentes países y regiones. El proceso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad.
- Retirar el medio de cultivo celular de las placas de 24 pocillos y añadir 100 μL del medio de mantenimiento del cultivo celular y 100 μL del sobrenadante del homogeneizado del mosquito (P0) a cada pocillo.
- Incubar las placas a 28 °C o 37 °C durante 60 min y agitarlas suavemente cada 15 min para evitar que las células se sequen.
- Retire el sobrenadante y enjuague suavemente cada pozo con 600 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular para eliminar los residuos por completo.
- Agregue 800 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo y mantenga las placas en una incubadora humidificada deCO2 al 5% a 28 °C o 37 °C durante 7 días.
- Monitorear el estado celular de cada pocillo bajo el microscopio diariamente15.
- Recoger los sobrenadantes de las células (sobrenadantes P1) el7º día y almacenar los sobrenadantes a -80 °C.
- Repita los pasos 4.1-4.6 2x para obtener sobrenadantes P2 y P3.
NOTA: En el paso 4.3, enjuagar cada pocillo suavemente con 600 μL de medio de mantenimiento de cultivo celular fue opcional para P2 y P3. - Dependiendo de qué pozo muestra el efecto citopatogénico (CPE): las células mueren, la picnosis y se desprenden de la superficie; fusión con células adyacentes para formar sincitia; o la aparición de cuerpos de inclusión nucleares o citoplasmáticos: agregue 300-400 μL del sobrenadante de este CPE en cada pocillo de las nuevas placas de 6 pocillos que contienen células (la confluencia celular fue del 80% -90%) para amplificar en gran medida los virus.
- Recoger los sobrenadantes y alícuotas en tubos de almacenamiento de tapón de rosca de 2 ml (500 μL por tubo). Guárdelos a -80 °C.
NOTA: Después de tres generaciones de paso sucesivo en las células, las muestras que no indujeron CPE fueron descartadas. Si es necesario, se pueden aumentar las generaciones de pases sucesivos en las células.
5. Detección de secuencias virales por RT-PCR
- Extraer ARN total de 200 μL del sobrenadante viral utilizando un mini kit de ARN viral16.
NOTA: Aquí, se utilizó un sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos para extraer el ARN total siguiendo las instrucciones del fabricante del instrumento. - Convierta el ARN en ADNc siguiendo las instrucciones del kit RT-PCR utilizando un instrumento de PCR.
- Agregue 15 μL de ARN mezclado con 1 μL de cebadores aleatorios en el tubo de PCR. Coloque el tubo a 70 °C durante 5 min y luego colóquelo en hielo durante 5 min.
- Añadir 5 μL de tampón 5x y 25 μL de mezcla (10 mM dNTP, 40 U/μL de inhibidor de la RNasa y 200 U/μL M-MLV) en el tubo y colocar el tubo a 42 °C durante 60 min y 95 °C durante 10 min.
- Conservar el tubo a -20 °C.
- Utilice un kit de PCR y cebadores universales (Tabla 1) para detectar virus por PCR.
- Para los arbovirus, configure el sistema de reacción por PCR (total 30 μL) con los siguientes componentes: 3 μL de tampón Taq 10x, 3 μL de dNTP (1mM), 1 μL de cebador directo (10 μm), 1 μL de cebador inverso (10 μm), 0,3 μL de Taq (10 U/μL), 19,7 μL deddH2Oy 2 μL de ADNc.
- Para la detección de flavivirus, configurar el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Para la detección de alfavirus, configurar el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Para la detección de bunyavirus, configure el proceso de reacción como: etapa 1: 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; etapa 2: 72 °C durante 10 min.
- Detectar los productos de amplificación por PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y enviarlos para su análisis de secuenciación.
NOTA: Si las condiciones lo permiten, los sobrenadantes pueden someterse a un análisis de secuenciación de próxima generación para identificar nuevos virus y obtener la secueundancia completa del genoma viral.
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Representative Results
Después de la inoculación con los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito (P0), las células C6/36 exhibieron un amplio espacio intercelular, y las células exfoliadas se observaron a las 120 h (Figura 1A) en comparación con las células no inoculadas (control) al mismo tiempo (Figura 1B). Después de incubar las células BHK-21 con los sobrenadantes P3, se observó CPE visible en las células BHK-21 a las 48 h (Figura 1C) en contraste con las células control (Figura 1D). Se realizó PCR para determinar especies virales. Los cebadores universales para la detección de flavivirus, alfavirus y bunyavirus fueron sintetizados comercialmente (Tabla 1). Un producto de PCR para el bunyavirus Ebinur Lake Virus se estableció como un control positivo y se agregó al carril 1. Los cebadores universales para bunyavirus, flavivirus y alfavirus se utilizaron para generar los productos de PCR para el sobrenadante viral, que luego se agregaron a Lane 2, 3 y 4, respectivamente. Los tamaños estimados de los productos de PCR para flavivirus, alfavirus y bunyavirus fueron 266 pb, 434 pb y 251 pb, respectivamente. Las bandas solo eran visibles en el carril 2 y el carril de control positivo 1. Como resultado, es probable que el virus en los sobrenadantes sea un bunyavirus (Figura 2).
Figura 1: Observación CPE de células después de la incubación con los sobrenadantes virales. El estado de las células C6/36 a las 120 h después de la infección (CPE) (A) y el de las células de control al mismo tiempo (B). El estado de las células BHK-21 a 48 hpi (C) y el de las células de control (D). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: CPE = efecto citopatogénico; HPI = horas después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de PCR para sobrenadantes virales. El carril 1 representa el control positivo de los bunyavirus (Ebinur Lake Virus). Los carriles 2-4 representaron los resultados de PCR de sobrenadantes mediante el uso de cebadores universales para bunyavirus (251 pb), flavivirus (266 pb) y alfavirus (434 pb). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Virus | Cebador | Oligonucleótido (5'→3') | El tamaño del producto de PCR (bp) | ||
| Flavivirus | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| Alfavirus | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyavirus | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
Tabla 1: Cebadores universales para la detección de arbovirus.
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Discussion
El objetivo de este método era ofrecer una forma práctica de aislar virus asociados a mosquitos utilizando varias líneas celulares. Es fundamental añadir el antibiótico-antimicótico (penicilina-estreptomicina-anfotericina) a los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito para evitar la contaminación por bacterias u hongos. Los mosquitos y sobrenadantes virales obtenidos en el campo deben refrigerarse a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
Otro paso crítico en el protocolo fue la molienda. Las muestras de mosquitos deben pulverizarse completamente y almacenarse en hielo. Los tejidos de mosquitos insuficientemente molidos pueden inducir la muerte celular y pueden sesgar los hallazgos del análisis de CPE. Antes del aislamiento del virus, es necesario emplear mosquitos normales para confirmar los parámetros de molienda. La molienda debe hacerse a bajas temperaturas para evitar que el virus se vuelva inactivo durante el proceso.
Este enfoque puede aislar y amplificar eficazmente los virus asociados a mosquitos, pero solo es aceptable para los virus que pueden mostrar CPE en líneas celulares de mamíferos o insectos. Este enfoque es inapropiado para los virus que no inducen CPE. Usando el protocolo, podemos obtener candidatos virales que contienen solo un tipo de virus o una mezcla con diferentes virus. Todavía se necesita más investigación (purificación viral, identificación morfológica y análisis de placa) para obtener el virus purificado.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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