Summary

Выделение комар-ассоциированного вируса от комаров, собранных в полевых условиях

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Многочисленные новые вирусоподобные последовательности были обнаружены у комаров из-за широкого использования технологий секвенирования. Мы предлагаем эффективную процедуру выделения и амплификации вирусов с использованием клеточных линий позвоночных и комаров, которая может послужить основой для будущих исследований вирусов, ассоциированных с комарами, включая переносимые комарами и специфические для комаров вирусы.

Abstract

Благодаря широкому применению технологий секвенирования у членистоногих, включая комаров, было обнаружено много новых вирусоподобных последовательностей. Двумя основными категориями этих новых вирусов, ассоциированных с комарами, являются «вирусы, переносимые комарами (MBV)» и «специфические для комаров вирусы (MSV)». Эти новые вирусы могут быть патогенными как для позвоночных, так и для комаров, или они могут быть просто симбиотическими с комарами. Сущностные вирусы необходимы для подтверждения биологических характеристик этих вирусов. Таким образом, здесь был описан подробный протокол выделения и амплификации вируса от комаров, собранных в полевых условиях. Во-первых, образцы комаров были подготовлены в качестве надосадочных добавок гомогенатов комаров. После двойного центрифугирования надосадочные жидкости затем инокулировали либо в клеточную линию комаров C6/36, либо в клеточную линию позвоночных BHK-21 для амплификации вируса. Через 7 дней надосадочные жидкости собирали как надосадочные жидкости P1 и хранили при -80 °C. Затем надосадочные жидкости P1 были введены еще дважды в клетки C6/36 или BHK-21, в то время как состояние клеток проверялось ежедневно. Когда было обнаружено цитопатогенное действие (CPE) на клетки, эти надосадочные жидкости были собраны и использованы для идентификации вирусов. Этот протокол служит основой для будущих исследований вирусов, ассоциированных с комарами, включая MBV и MSV.

Introduction

Комары представляют собой группу важных патогенных членистоногих переносчиков. В семействе Culicidae 1,2 насчитывается около 3 500 видов комаров. Развитие высокопроизводительных технологий секвенирования привело к открытию множества новых вирусоподобных последовательностей у комаров из разных уголков мира3. Как правило, эти вирусы, ассоциированные с комарами, можно разделить на две основные группы: MBV и MSV.

MBV представляют собой группу разнообразных вирусов, которые являются возбудителями многих болезней человека или животных, таких как вирус желтой лихорадки (YFV), вирус денге (DENV), вирус японского энцефалита (JEV), вирус Западного Нила (WNV) и вирус лихорадки Рифт-Валли (RLVFV)4. Они серьезно угрожают здоровью населения, вызывая тяжелую заболеваемость и смертность как среди людей, так и среди животных во всем мире. MBV естественным образом поддерживают жизненный цикл между различными хозяевами путем передачи от инфицированного комара наивному хозяину, а также от инфицированного вирусом хозяина и кормящемуся комару5. Таким образом, эти вирусы могут инфицировать как клеточные линии комаров, так и клеточные линии позвоночных в лаборатории1.

MSV, которые включают вирус Ичан (YCN), флавивирус Culex flavivirus (CxFV) и вирус Чаоян (CHAOV), представляют собой подгруппу вирусов, специфичных для насекомых 1,6,7. В последние годы наблюдается рост числа открытий новых MSV, и было обнаружено, что некоторые из этих MSV влияют на передачу MBV. Например, CxFV, который может быть персистирующей инфекцией в Culex pipiens, может подавлять репликацию ВЗН на ранней стадии8. Было обнаружено, что другой специфический для насекомых флавивирус, вирус клеточного сливающегося агента (CFAV), ингибирует размножение DENV и вируса Зика (ZIKV) у комаров Aedes aegypti 9. Таким образом, этот протокол является полезным подходом для изоляции вирусов, ассоциированных с комарами, и может помочь в дальнейших исследованиях распространения патогенов, связанных с комарами, и борьбы с болезнями, переносимыми комарами.

Protocol

1. Отбор проб и сортировка комаров Ловите взрослых комаров с помощью световых ловушек MXA-02 или ловушек для комаров с углекислым газом в полевых условиях. Убейте собранных комаров, окунув в жидкий азот10,11. Транспортировка их в лаборатори…

Representative Results

После инокуляции надосадочными продуктами гомогенатов комаров (P0) клетки C6/36 демонстрировали широкое межклеточное пространство, а отслоившиеся клетки наблюдались через 120 ч (рис. 1A) по сравнению с неинокулированными клетками (контроль) в то же время (рис. 1B).</st…

Discussion

Цель этого метода состояла в том, чтобы предложить практический способ выделения вирусов, ассоциированных с комарами, с использованием различных клеточных линий. Крайне важно добавлять антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин) к надосадочным продуктам гомогенато?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Уханьским проектом научно-технического плана (2018201261638501).

Materials

0.22 µm membrane filter Millipore SLGP033RB Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates CORNING 3524 Containers for cell
75 cm2 flasks CORNING 430641 Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system NanoMagBio S-48
BHK-21 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine Himac CF16RN Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) Gibco C11995500BT medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141C

Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer servicebio KZ-III-F Instrument for grinding
incubator (28 °C) Panasonic MCO-18AC Instrument for cell culture
incubator (37 °C) Panasonic MCO-18AC Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin Gibco 15410-122 Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution Gibco 15240096
Refrigerator (-80 °C) sanyo MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI) Gibco C11875500BT medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL) biofil  FCT010005
sterile pestles Tiangen OSE-Y004 Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder Tiangen OSE-Y30 Instrument for grinding
The dissecting microscope ZEISS stemi508
the light traps MXA-02 Maxttrac
The mosquito absorbing machine Ningbo Bangning
The pipette tips Axygen TF
The QIAamp viral RNA mini kit QIAGEN 52906
Tweezers Dumont 0203-5-PO

References

  1. Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
  2. Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
  3. Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
  4. Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
  5. Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
  6. Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
  7. Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
  8. Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
  9. Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
  10. Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
  11. Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
  12. Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
  13. Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
  14. Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
  15. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  16. Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
  17. Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
  18. Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).

Play Video

Cite This Article
Huang, D., Ma, H., Zhao, L., Wang, X., Huang, Y., Wang, F., Yuan, Z., Xia, H. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (186), e63852, doi:10.3791/63852 (2022).

View Video