Многочисленные новые вирусоподобные последовательности были обнаружены у комаров из-за широкого использования технологий секвенирования. Мы предлагаем эффективную процедуру выделения и амплификации вирусов с использованием клеточных линий позвоночных и комаров, которая может послужить основой для будущих исследований вирусов, ассоциированных с комарами, включая переносимые комарами и специфические для комаров вирусы.
Благодаря широкому применению технологий секвенирования у членистоногих, включая комаров, было обнаружено много новых вирусоподобных последовательностей. Двумя основными категориями этих новых вирусов, ассоциированных с комарами, являются «вирусы, переносимые комарами (MBV)» и «специфические для комаров вирусы (MSV)». Эти новые вирусы могут быть патогенными как для позвоночных, так и для комаров, или они могут быть просто симбиотическими с комарами. Сущностные вирусы необходимы для подтверждения биологических характеристик этих вирусов. Таким образом, здесь был описан подробный протокол выделения и амплификации вируса от комаров, собранных в полевых условиях. Во-первых, образцы комаров были подготовлены в качестве надосадочных добавок гомогенатов комаров. После двойного центрифугирования надосадочные жидкости затем инокулировали либо в клеточную линию комаров C6/36, либо в клеточную линию позвоночных BHK-21 для амплификации вируса. Через 7 дней надосадочные жидкости собирали как надосадочные жидкости P1 и хранили при -80 °C. Затем надосадочные жидкости P1 были введены еще дважды в клетки C6/36 или BHK-21, в то время как состояние клеток проверялось ежедневно. Когда было обнаружено цитопатогенное действие (CPE) на клетки, эти надосадочные жидкости были собраны и использованы для идентификации вирусов. Этот протокол служит основой для будущих исследований вирусов, ассоциированных с комарами, включая MBV и MSV.
Комары представляют собой группу важных патогенных членистоногих переносчиков. В семействе Culicidae 1,2 насчитывается около 3 500 видов комаров. Развитие высокопроизводительных технологий секвенирования привело к открытию множества новых вирусоподобных последовательностей у комаров из разных уголков мира3. Как правило, эти вирусы, ассоциированные с комарами, можно разделить на две основные группы: MBV и MSV.
MBV представляют собой группу разнообразных вирусов, которые являются возбудителями многих болезней человека или животных, таких как вирус желтой лихорадки (YFV), вирус денге (DENV), вирус японского энцефалита (JEV), вирус Западного Нила (WNV) и вирус лихорадки Рифт-Валли (RLVFV)4. Они серьезно угрожают здоровью населения, вызывая тяжелую заболеваемость и смертность как среди людей, так и среди животных во всем мире. MBV естественным образом поддерживают жизненный цикл между различными хозяевами путем передачи от инфицированного комара наивному хозяину, а также от инфицированного вирусом хозяина и кормящемуся комару5. Таким образом, эти вирусы могут инфицировать как клеточные линии комаров, так и клеточные линии позвоночных в лаборатории1.
MSV, которые включают вирус Ичан (YCN), флавивирус Culex flavivirus (CxFV) и вирус Чаоян (CHAOV), представляют собой подгруппу вирусов, специфичных для насекомых 1,6,7. В последние годы наблюдается рост числа открытий новых MSV, и было обнаружено, что некоторые из этих MSV влияют на передачу MBV. Например, CxFV, который может быть персистирующей инфекцией в Culex pipiens, может подавлять репликацию ВЗН на ранней стадии8. Было обнаружено, что другой специфический для насекомых флавивирус, вирус клеточного сливающегося агента (CFAV), ингибирует размножение DENV и вируса Зика (ZIKV) у комаров Aedes aegypti 9. Таким образом, этот протокол является полезным подходом для изоляции вирусов, ассоциированных с комарами, и может помочь в дальнейших исследованиях распространения патогенов, связанных с комарами, и борьбы с болезнями, переносимыми комарами.
Цель этого метода состояла в том, чтобы предложить практический способ выделения вирусов, ассоциированных с комарами, с использованием различных клеточных линий. Крайне важно добавлять антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин) к надосадочным продуктам гомогенато?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Уханьским проектом научно-технического плана (2018201261638501).
0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
CO2 | |||
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
PCR tube | |||
penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
The pipette tips | Axygen | TF | |
The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |