육계 병아리 배아에서 지방전구세포의 분리
Summary
본 프로토콜은 육계 배아에서 지방 조직으로부터 지방전구세포를 단리하는 간단한 방법을 기술한다. 이 방법은 고수율, 일차 배양 및 지방전구세포의 아디포제닉 분화로 단리를 가능하게 한다. Oil Red O 염색 및 지질/DNA 염색은 분화 배지로 유도된 분리된 세포의 아디포겐 능력을 측정했습니다.
Abstract
일차 지방전구세포는 지방세포 분화 및 신진대사를 조절하는 분자 경로를 이해하는 데 유용한 실험 시스템이다. 닭 배아는 지방 발달의 초기 단계에서 지방 전구세포를 분리 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 일차 세포는 지방세포 증식 및 아디포제닉 분화에 영향을 미치는 인자를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 이는 어린 시절의 비만 및 가금류의 과도한 지방 침착 조절과 관련된 연구에 유용한 모델이 될 수 있습니다. 산후 지방 조직의 급속한 성장은 육계 닭의 근육 성장에서 멀리 할당함으로써 사료를 효과적으로 낭비합니다. 따라서 지방 조직 발달의 초기 단계를 이해하는 방법은 이러한 경향을 조절하고 삶의 초기에 지방 확장을 제한하는 방법을 식별하는 단서를 제공 할 수 있습니다. 본 연구는 상업적 육계(육류형) 병아리 배아의 지방조직 개발로부터 분리된 지방전구세포의 분리, 일차 배양 및 아디포제닉 분화를 위한 효율적인 방법을 개발하기 위해 고안되었다. 이 절차는 높은 생존력 (~ 98 %)을 가진 세포를 산출하고 성숙한 지방세포로 분화 할 수있는 능력을 증가시키도록 최적화되었습니다. 배아 지방세포 분리, 배양 및 분화의 이 간단한 방법은 초기 생활에서 지방 성장과 발달의 기능적 분석을 지원합니다.
Introduction
비만은 성인과 어린이 모두에게 세계적인 건강 위협입니다. 과체중 또는 비만 인 어린이는 성인보다 비만 할 확률이 약 다섯 배 더 높기 때문에 심혈관 질환, 당뇨병 및 기타 많은 합병증에 걸릴 위험이 크게 증가합니다. 2-5 세 미국 어린이의 약 13.4 %가 비만1을 앓고 있으며, 과도한 체지방을 축적하는 경향이 매우 일찍 시작될 수 있음을 보여줍니다. 매우 다른 이유로, 과도한 지방 조직의 축적은 육계 (고기 유형) 닭에 대한 우려입니다. 현대 육계는 믿을 수 없을만큼 효율적이지만 생리적으로 필요한 것보다 더 많은 지질을 축적합니다 2,3. 이러한 경향은 부화 직후에 시작되어 가장 비싼 생산 구성 요소 인 사료를 근육 성장에서 멀리 할당하여 효과적으로 낭비합니다. 따라서 어린이와 육계 닭 모두에게 매우 다른 이유로 인해 지방 조직 발달에 영향을 미치는 요인을 이해하고 조기에 지방 확장을 제한하는 방법을 찾아야합니다.
지방세포는 지방전구세포로부터 형성되며, 분화를 겪는 지방조직 유래 줄기세포는 성숙하고 지질을 저장하는 지방세포를 발달시킨다. 따라서, 시험관 내 지방전구세포는 비만 연구를 위한 귀중한 실험 모델이다. 지방 데포의 기질 혈관 분획으로부터 분리 된이 세포는 지방 세포 분화 및 신진 대사 4,5를 조절하는 분자 경로에 대한 근본적인 이해를 제공 할 수 있습니다. 병아리 배아는 원하는 일정에 따라 난자를 배양하면 배아의 일련의 발달 단계를 관찰하기 위해 어머니의 희생없이 배아를 얻을 수 있기 때문에 실험 조작이 더 쉬워지기 때문에 발달 연구에서 유리한 실험 모델입니다. 또한, 복잡한 수술 절차와 긴 기간은 더 큰 동물 모델에 비해 배아를 얻을 필요가 없습니다. 따라서 병아리 배아는 지방 조직 발달의 초기 단계에서 지방세포를 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 피하 지방 조직은 허벅지 주위에 위치한 명확하게 정의된 데포로서 배아 12일째(E12) 주위의 병아리에서 보이게 된다. 이 디포는 성숙한 지방세포를 형성하기 위해 발달 단서 하에서 분화를 활발히 겪는 고도로 증식성 전지방세포에서 풍부해진다 6,7. 아디포겐 분화 과정은 닭과 인간 사이에서 비교할 수 있습니다. 따라서, 병아리 배아로부터 분리된 지방전구세포는 인간 및 가금류와 관련된 연구를 위한 이중 목적 모델로서 사용될 수 있다. 그러나, 지방전구세포의 수율은 세포가 성숙한 지방세포로 성장함에 따라 노화에 따라 감소한다5.
본 프로토콜은 아디포겐 분화 및 지방세포 비대증이 육계 병아리 배아8에서 피크에 있는 단계(E16-E18) 동안 지방 조직으로부터 지방전구세포의 분리를 최적화한다. 이 절차는 암탉 식단과 같은 난소 식단과 같은 난소 발달 배아가 오보에 노출되는 요인이 지방세포 발달 및 아디포겐 잠재력 ex 생체에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 또한, 다양한 조작(예를 들어, 저산소증, 영양소 첨가, 약리학적 작용제 및 길항제)이 지방세포 전구물질의 지방발생 또는 다양한 ‘옴(예를 들어, 전사체, 대사체, 메틸롬)’에 미치는 영향을 시험할 수 있다. 지방 형성의 초기 단계를 나타내는 것으로,이 프로토콜을 사용하여 얻은 세포는 가금류 및 인간과 관련된 연구를위한 귀중한 모델입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
몇몇 잘 기술된 프로토콜이 지방전구세포14,15,16,17의 단리를 보고했지만, 배아 지방전구세포에 대한 단리가 최적화되었으며, 이는 육계 병아리의 초기 생활 지방 성장 및 발달의 기능적 분석에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 높은 분화 잠재력을 가진 높은 생존력 배아 지방세포 전구 인자를 산출한다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로토콜을 지원하고 최적화 한 UT AgResearch와 동물 과학부에 감사드립니다. 이 작품은 USDA 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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