Isolering av preadipocyter från Broiler Chick Embryos
Summary
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att isolera preadipocyter från fettvävnad i broilerembryon. Denna metod möjliggör isolering med högt utbyte, primärkultur och adipogen differentiering av preadipocyter. Oil Red O-färgning och lipid / DNA-fläck mätte den adipogena förmågan hos isolerade celler inducerade med differentieringsmedier.
Abstract
Primära preadipocyter är ett värdefullt experimentellt system för att förstå de molekylära vägar som styr adipocytdifferentiering och metabolism. Kycklingembryon ger möjlighet att isolera preadipocyter från det tidigaste stadiet av fettutveckling. Denna primära cell kan användas för att identifiera faktorer som påverkar preadipocytproliferation och adipogen differentiering, vilket gör dem till en värdefull modell för studier relaterade till barnfetma och kontroll av överflödig fettavsättning hos fjäderfä. Den snabba tillväxten av postnatal fettvävnad slösar effektivt bort foder genom att fördela det bort från muskeltillväxt hos slaktkycklingar. Därför kan metoder för att förstå de tidigaste stadierna av fettvävnadsutveckling ge ledtrådar för att reglera denna tendens och identifiera sätt att begränsa fettutvidgningen tidigt i livet. Den aktuella studien utformades för att utveckla en effektiv metod för isolering, primärkultur och adipogen differentiering av preadipocyter isolerade från att utveckla fettvävnad av kommersiella kycklingembryon av kötttyp. Förfarandet har optimerats för att ge celler med hög livskraft (~ 98%) och ökad kapacitet att differentiera till mogna adipocyter. Denna enkla metod för embryonal preadipocytisolering, kultur och differentiering stöder funktionella analyser av fetttillväxt och utveckling i början av livet.
Introduction
Fetma är ett globalt hälsohot mot både vuxna och barn. Barn som är överviktiga eller feta är ungefär fem gånger mer benägna att vara överviktiga som vuxna, vilket placerar dem i signifikant ökad risk för hjärt-kärlsjukdom, diabetes och många andra comorbiditeter. Cirka 13.4% av amerikanska barn i åldern 2-5 år har fetma1, vilket illustrerar att tendensen att ackumulera överflödigt kroppsfett kan sättas i rörelse mycket tidigt i livet. Av mycket olika skäl är ackumuleringen av överskott av fettvävnad ett problem för slaktkycklingar (kötttyp). Moderna broilers är otroligt effektiva men ackumulerar fortfarande mer lipid än vad som är fysiologiskt nödvändigt 2,3. Denna tendens börjar strax efter luckan och slösar effektivt bort foder, den dyraste produktionskomponenten, genom att fördela den bort från muskeltillväxt. För både barn och slaktkycklingar, om än av mycket olika skäl, finns det därför ett behov av att förstå faktorer som påverkar fettvävnadsutvecklingen och identifiera sätt att begränsa fettutvidgningen tidigt i livet.
Adipocyter bildas från preadipocyter, fettvävnadsderiverade stamceller som genomgår differentiering för att utveckla mogna, lipidlagrande fettceller. Följaktligen är preadipocyter in vitro en värdefull experimentell modell för fetmastudier. Dessa celler, isolerade från den stromala vaskulära fraktionen av fettdepåer, kan ge en grundläggande förståelse för molekylära vägar som styr adipocytdifferentiering och metabolism 4,5. Kycklingembryon är en gynnsam experimentell modell i utvecklingsstudier eftersom odling av ägg enligt önskat schema underlättar experimentell manipulation, eftersom det gör det möjligt att erhålla embryon utan moderns offer för att observera en serie utvecklingsstadier av embryon. Dessutom krävs inte komplicerade kirurgiska ingrepp och långa tidsperioder för att få embryon i förhållande till större djurmodeller. Därför ger kycklingembryomet en möjlighet att erhålla preadipocyter från de tidigaste stadierna av fettvävnadsutveckling. Subkutan fettvävnad blir synlig i kycklingen runt embryonal dag 12 (E12) som en tydligt definierad depå belägen runt låret. Denna depå är berikad med mycket proliferativa preadipocyter som aktivt genomgår differentiering under utvecklingssignaler för att bilda mogna adipocyter 6,7. Processen med adipogen differentiering är jämförbar mellan kycklingar och människor. Därför kan preadipocyter isolerade från kycklingembryon användas som en dubbelfunktionsmodell för studier som är relevanta för människor och fjäderfä. Utbytet av preadipocyter minskar emellertid med åldrande när celler växer till mogna adipocyter5.
Det nuvarande protokollet optimerar isoleringen av preadipocyter från fettvävnad under scenen (E16-E18) vid vilken adipogen differentiering och adipocythypertrofi är på topp i broiler chick embryon8. Denna procedur kan bedöma effekterna av faktorer som det utvecklande embryot exponeras för i ovo, såsom hönsdieten, på adipocytutveckling och adipogen potential ex vivo. Det kan också testa effekterna av olika manipuleringar (t.ex. hypoxi, näringstillsatser, farmakologiska agonister och antagonister) på adipogenes eller de olika omerna (t.ex. transkriptom, metabolom, metylom) hos adipocytprofäder. Som en representation av det tidigaste stadiet av fettbildning är celler erhållna med hjälp av detta protokoll värdefulla modeller för studier som är relevanta för fjäderfä och människor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om flera väl beskrivna protokoll har rapporterat isolering av preadipocyter 14,15,16,17, har isolering för embryonala preadipocyter optimerats, vilket kan användas för funktionella analyser av fetttillväxt och utveckling i början av livet hos slaktkycklingar. Detta protokoll ger embryonala adipocytprogenitorer med hög differentieringspotential med hög livskraft. Dessutom är det p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar UT AgResearch och Institutionen för husdjursvetenskap för att stödja och optimera detta protokoll. Detta arbete finansierades av USDA-bidrag.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. . Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolution of the modern broiler and feed efficiency. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).
- Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005. Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates. Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).
- Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).
- Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler. Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).
- Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development. Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).
- Claver, J. A., Quaglia, A. I. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).
- . Corning Cell Counter Demo Video Available from: https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg (2022)
- Nema, R., Khare, S. An animal cell culture: Advance technology for modern research. Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).
- Regassa, A., Kim, W. K. Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes. Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).
- Temkin, A. M. Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen. Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. . Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).
- Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes. Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).
- Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).
- Yang, X., et al. Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria. bioRxiv. , 366906 (2018).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).
