Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/63866
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Putuo People's Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית טיפוסית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה דלקתית, דה-מיאלינציה ונזק אקסונאלי. נכון לעכשיו, אין אמצעים לריפוי מלא של טרשת נפוצה, אך קיימים טיפולים רבים המשנים את המחלה (DMT) כדי לשלוט בהתקדמות המחלה ולמתן אותה. ישנם קווי דמיון משמעותיים בין התכונות הפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) לבין חולי טרשת נפוצה. EAE נמצא בשימוש נרחב כמודל מייצג כדי לקבוע את היעילות של תרופות לטרשת נפוצה ולחקור את הפיתוח של טיפולים חדשים למחלת טרשת נפוצה. אינדוקציה פעילה של EAE בעכברים היא בעלת השפעה יציבה וניתנת לשחזור והיא מתאימה במיוחד לחקר ההשפעות של תרופות או גנים על דלקת עצבית אוטואימונית. השיטה לחיסון עכברי C57BL/6J עם גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG35-55) וההערכה היומית של תסמיני המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית משותפת בעיקר. בהתחשב באטיולוגיה המורכבת של טרשת נפוצה עם ביטויים קליניים מגוונים, מערכת הניקוד הקלינית הקיימת אינה יכולה לספק את הערכת הטיפול במחלה. כדי למנוע את החסרונות של התערבות אחת, אינדיקטורים חדשים להערכת EAE בהתבסס על ביטויים קליניים של מצבי רוח דמויי חרדה ואוסטאופורוזיס בחולי טרשת נפוצה נוצרים כדי לספק הערכה מקיפה יותר של טיפול בטרשת נפוצה.

Introduction

מחלות אוטואימוניות הן ספקטרום של הפרעות הנגרמות על ידי התגובה החיסונית של מערכת החיסון לאנטיגנים שלה וכתוצאה מכך נזק לרקמות או תפקוד לקוי1. טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של פולינוירופתיה במערכת העצבים המרכזית (CNS), המאופיינת בחדירה דלקתית, דה-מיאלינציה וניוון אקסונאלי עצבי 2,3. נכון לעכשיו, טרשת נפוצה השפיעה על לא פחות מ-2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם, רובם צעירים ואנשים בגיל העמידה בגילאי 20-40, שהם לעתים קרובות עמוד השדרה של משפחותיהם והחברה. זה גרם להשפעה רבה ופגיעה במשפחות ובחברה 2,4.

טרשת נפוצה היא מחלה רב-גורמית בעלת ביטויים קליניים מגוונים ומורכבים. בנוסף להפרעות נוירולוגיות קלאסיות המאופיינות בחדירה דלקתית ודה-מיאלינציה, טרשת נפוצה מראה לעתים קרובות ליקוי ראייה, דיסקינזיה של הגפיים והפרעות קוגניטיביות ורגשיות 5,6,7. אם חולי טרשת נפוצה לא יקבלו את הטיפול הנכון והראוי, מחציתם יחיו בכיסאות גלגלים לאחר 20 שנה, וכמעט מחציתם יחוו תסמיני דיכאון וחרדה, מה שיוביל לרמות גבוהות בהרבה של מחשבות אובדניות מאשר האוכלוסייה הכללית 8,9.

למרות תקופת מחקר ארוכה, האטיולוגיה של טרשת נפוצה נותרה חמקמקה, והפתוגנזה של טרשת נפוצה עדיין לא הובהרה. מודלים חייתיים של טרשת נפוצה אפשרו לשמש ככלי בדיקה לחקר התפתחות מחלות וגישות טיפוליות חדשות, למרות ההבדלים המשמעותיים בין מערכת החיסון של המכרסם למערכת החיסון האנושית, ובמקביל חולקים כמה עקרונות בסיסיים. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא כיום המודל החי האידיאלי לחקר טרשת נפוצה, המשתמשת בחסינות אוטואנטיגנית מחלבוני מיאלין כדי לגרום לאוטואימוניות למרכיבי CNS בעכברים רגישים, בתוספת אדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) ורעלן שעלת (PTX) כדי לשפר את התגובה החיסונית ההומורלית. בהתאם לרקע הגנטי ולאנטיגנים החיסוניים, מתקבלים תהליכי מחלה שונים, כולל חריפים, חוזרים-חוזרים או כרוניים, כדי לחקות צורות קליניות שונות של טרשת נפוצה10,11,12. האימונוגנים הרלוונטיים המשמשים בדרך כלל לבניית מודלים של EAE מגיעים מחלבוני CNS עצמיים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), חלבון פרוטאוליפיד (PLP), או גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים (MOG). עכברי SJL/L מחוסני MBP או PLP מפתחים מסלול חוזר-חוזר, ו-MOG מפעיל EAE פרוגרסיבי כרוני בעכברי C57BL/611,12,13.

המטרה העיקרית של טיפול משנה מחלה (DMT) היא למזער את תסמיני המחלה ולשפר את התפקוד6. מספר תרופות משמשות קלינית כדי להקל על טרשת נפוצה, אך עדיין לא נעשה שימוש בתרופה כדי לרפא אותה לחלוטין, מה שחושף את הצורך בטיפול סינרגטי. עכברי C57BL/6 הם כיום הנפוצים ביותר לבניית עכברים מהונדסים, ובעבודה זו, מודל EAE המושרה על ידי MOG35-55 בעכברי C57BL/6J עם סולם של 5 נקודות שימש לניטור התקדמות המחלה. דוגמניות EAE סובלות גם ממצבי רוח דמויי חרדה ואובדן עצם, ומהנגעים הידועים בדמילין. כאן מתוארת גם השיטה להעריך את הסימפטומים של EAE מנקודות מבט מרובות באמצעות בדיקת שדה פתוח וניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת טונג'י אישרה את העבודה הנוכחית, וכל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים בוצעו. עכברי C57BL/6J זכרים או נקבות בגילאי 8-12 שבועות שימשו לניסויים. הובטח כי הגיל והמין יהיו זהים בקבוצות הניסוי; אחרת, הרגישות למחלה הושפעה. עכברים שוכנו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים עם מחזורי אור וחושך מתחלפים של 12 שעות בתנאים קבועים (טמפרטורת החדר 23 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות 50% ± 10%), עם גישה חופשית למזון ולמים של עכברים.

1. הכנת תחליבMOG 35-55

  1. הוסף שחפת מיקובקטריום מומת בחום (MTB, H37Ra) כדי להשלים את האדג'ובנט של פרוינד (עצמו מכיל 1 מ"ג/מ"ל של MTB מומת בחום, H37Ra), וכתוצאה מכך ריכוז MTB סופי של 5 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
    הערה: יש להשלים את הפעולה כולה בארון הבטיחות הביולוגית; אין לפתוח את האוויר הנושב.
  2. ממיסים את פפטיד MOG35-55 שעבר ליאופיליזציה (ראו טבלת חומרים) עם תמיסת מלח חצובה (PBS) סטרילית מקוררת מראש (PBS) (ללא יוני סידן ומגנזיום, pH 7.4) כדי להכין את תמיסת האנטיגן בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
  3. קח צינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל והוסף כדור פלדה אחד מעוקר בקוטר 5 מ"מ (ראה טבלת חומרים) לכל צינור.
  4. הוסף 500 μL של אדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל 5 מ"ג/מ"ל של MTB ו-500 μL של תמיסת אנטיגן MOG35-55 לצינור המיקרוצנטריפוגה הנ"ל המכיל כדור פלדה אחד.
  5. מנדנדים את הצינור הנ"ל על TissueLyser (ראו טבלת חומרים) במשך 10 דקות, מצננים על קרח במשך 10 דקות, וחוזרים על הפעולה ארבע פעמים כדי לערבב אותו היטב ולבסוף יוצרים תמיסה צמיגה לבנה.
    הערה: תחליב טוב הוא שלב מפתח בהכנת תחליב MOG35-55 , ולכן נדרש ערבוב יסודי. ה- TissueLyser מוגדר למהירות של 28 הרץ.

2. הכנת רעלן שעלת (PTX)

  1. הכן PTX עם ddH2O לתוך ריכוז 100 מיקרוגרם / מ"ל ולאחסן ב 4 °C.
  2. דלל את תמיסת המלאי PTX 50 פעמים עם PBS סטרילי 1x (ללא יוני סידן ומגנזיום, pH 7.4) כדי ליצור תמיסה של 200 ננוגרם/100 מיקרון לשימוש.

3. הקמת מודל בעלי חיים EAE

  1. בנה את מודל EAE באמצעות עכברי C57BL/6J זכריים או נקביים בני 8-12 שבועות. ודאו שהעכברים התאקלמו כראוי בסביבת ההזנה לפני החיסון.
  2. צנטריפוגה של תחליב MOG35-55 מוכן (שלב 1) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שניות על ידי לחיצה על כפתור הדופק של הציוד (ראה טבלת חומרים) כדי לזרז את כל התחליבים בתחתית הצינור.
    הערה: ניתן לאחסן תחליב MOG35-55 בטמפרטורה של -20°C למשך מספר ימים. כדי למנוע כישלון סמים, מומלץ להשתמש בו בהקדם האפשרי.
  3. חברו מחט של 22 גרם לחבית מזרק של 1 מ"ל, שאפו את תחליב MOG 35-55 והעבירו את תחליב MOG35-55 לחבית מזרק חדשה של 1 מ"ל. אבטחו את החיבור בין חבית מזרק 1 מ"ל למחט 26 גרם עם סרט איטום (ראו טבלת חומרים).
    הערה: יש להימנע מבועות אוויר בעת טעינת תחליב MOG35-55 לתוך חביות מזרק 1 מ"ל.
  4. נגב וחטא את אתר ההזרקה עם 70% אתנול.
  5. להזריק את תחליב MOG35-55 תת עורית בכל צד של עמוד השדרה הגבי של העכברים, 100 μL בכל צד. שימו לב להיווצרות האוטומטית של המוני בולבוסים מתחת לעור הגב של העכברים לאחר השלמת פעולת ההזרקה.
    הערה: ודא שנסיינים מנוסים מבצעים את תהליך החיסון ושההזרקה מתבצעת בעדינות ובאיטיות כדי למזער את הלחץ על עכברים.
  6. להזריק לעכברים הנ"ל באופן תוך-צפקי 100 μL של PTX (שלב 2).
    הערה: יום החיסון הוא יום 0. כמו כן, ודא שניתן לזהות את העכברים במדויק לצורך הערכה יומית עוקבת, כגון שימוש בסמן צבע על זנב העכברים.
  7. להזריק את אותו מינון של PTX ביום 2 לאחר החיסון.
  8. הכינו קבוצה של עכברים לא מחוסנים כעכברים מסוג בר (WT).

4. ניטור קליני של עכברים

  1. רשום את משקל הגוף של עכברי EAE ו- WT מדי יום.
    הערה: חומרת EAE מתואמת באופן חיובי עם ירידה במשקל של עכברים, ולכן משקל הגוף הוא גם מדד ניטור חשוב מאוד.
  2. עקוב אחר מצב העכברים בין 0-21 יום לאחר החיסון באמצעות שיטת הניקוד 0-5 המפורטת בטבלה 1.
    הערה: התסמינים שביניהם נספרים כפלוס או מינוס 0.5 נקודות.

5. מבחן שדה פתוח

הערה: חיות הניסוי שנבחרו לשלב זה הן עכברי EAE בתקופות ההתחלה, השיא וההפוגה המוקדמות. בנוסף, עכברי WT שימשו כבקרה. יש לציין כי כל העכברים נבדקו להתנהגות דמוית חרדה לפני הדוגמנות כדי להוציא עכברים עם הפרעות חרדה למודלים של EAE. בנוסף, עכברי EAE בתקופות שיא והפוגה עם אי כושר מוטורי מלא לא נכללו במבחן.

  1. הכינו תא תגובת שדה פתוח בגודל 40 × 40 × 40 ס"מ3 ומערכת ניתוח וידאו של פעילות תנועה (שדה פתוח) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: המצלמה מותקנת במצב המכסה לחלוטין את הקופסה, חדר התגובה מואר באופן שווה, וחדר הבדיקה נדרש להיות אזור שקט.
  2. הניחו את עכברי הבדיקה בחדר הבדיקה לצורך הרגלה של שעה לפני תחילת הניסוי.
  3. יש לרסס את כל האזור ב-70% אתנול ולנגב במגבת נייר נקייה כדי לוודא שתא התגובה נקי לפני תחילת הבדיקה.
  4. הסר כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו והנח אותו באותה פינה של הזירה לפני שתתחיל לחקור.
    הערה: החלק התחתון של התיבה מחולק ל-16 רשתות, מתוכן אזור ארבע הרשתות האמצעיות הוא האזור המרכזי והסביבה היא האזור ההיקפי.
  5. לחץ על התחל ללכוד כפתור בשורת התפריטים של מערכת ניתוח הווידאו, הקלט זמן והתחל לצלם.
  6. שמרו על השקט בחדר הבדיקה.
  7. תן לעכבר לנוע בחופשיות במשך 5 דקות במהלך תהליך ההקלטה.
  8. עצור את מערכת הרכישה ושמור את הסרטון.
  9. הוציאו את העכבר מהזירה, החזירו אותו לכלוב והמשיכו לעכבר הבא.
    הערה: נקו את אזור הבדיקה עם 70% אתנול בין הריצות כדי להסיר ריחות וחומרים אחרים.
  10. נתח את התוצאות באמצעות מערכת ניתוח הווידאו.

6. ניתוח של פנוטיפ העצם

  1. הרדימו את עכברי EAE ו-WT על ידי נקע צוואר הרחם ביום ה-21.
    הערה: אנשי צוות המבצעים ניתוחי נקע צוואר הרחם חייבים להיות מאומנים היטב כדי למזער את הכאב הנגרם במהלך מותו של החיה.
  2. הפוך את העכבר לשכב שטוח במגש ניתוח ולתקן את הגפיים.
  3. החזק את עור הגפיים האחוריות של העכבר עם מלקחיים ופתח את עור העכבר ורקמת השריר עם מספריים.
  4. מפרידים בזהירות את עצם הירך מהשוקה ואת עצם הירך בעזרת מספריים.
  5. הסר את השריר הנדבק לעצם הירך עם מספריים והנח את עצם הירך ב 70% אתנול בטמפרטורת החדר.
  6. סרוק את עצם הירך הדיסטלית באמצעות מערכת מיקרו-CT (ראו טבלת חומרים) בגודל ווקסל איזוטרופי של 10 מיקרומטר, עם מתח שיא של צינור רנטגן של 70 קילו-וולט ועוצמת רנטגן של 0.114 mA.
    הערה: מסנן גאוס תלת-ממדי מאפשר סימון של תמונות סף דו-ממדיות.
  7. נתחו את 100 הפרוסות שנסרקו מפיר הירך האמצעי כדי למדוד פרמטרים של עצם הירך, כולל נפח עצם, נפח רקמה, צפיפות מינרלים בעצם, הפרדה טרבקולרית, מספר טרבקולרי, צפיפות חיבור טרבקולרי ועובי טרבקולרי וקליפת המוח.
    הערה: החל מהקצה הפרוקסימלי של לוחית הגדילה הדיסטלית של עצם הירך בעכברים, נמצאו מקטעים נטולי מבנים אפיפיזיים לחלוטין והמשיכו להרחיב 100 פרוסות לכיוון עצם הירך הפרוקסימלית, אשר שורטטו ידנית קווי מתאר בכמה ווקסלים הרחק מהמשטח קליפתי הפנימי כדי לזהות טרבקולה אפיפיזית.
  8. צור את השחזורים התלת-ממדיים על-ידי ערימת תמונות סף דו-ממדיות מאזורי קווי מתאר במערכת micro-CT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר חיסון העכברים, משקל הגוף של העכברים נרשם מדי יום, והתסמינים הקליניים שלהם מוערכים על פי הפרוטוקול שתואר לעיל (שלב 4). בעכברי C57BL/6J המחוסנים בפפטיד MOG, מכיוון שמיקום הנגע מוגבל בעיקר לחוט השדרה, הפתוגנזה של עכברי EAE מתפשטת מקצה הזנב לראש. בתחילת המחלה, עכברי EAE מפגינים חולשה וצניחה של הזנב, ולאחר מכן חולשה של הגפיים האחוריות, תנועה לא מתואמת ושיתוק. ככל שהמחלה מחמירה, היא מתפתחת בהדרגה לחולשת הנולדים, שיתוק, ובמקרים חמורים, גורמת לקושי להזיז את העכברים ואף קרובה למוות. כפי שניתן לראות באיור 1A, דיאגרמת המצב של העכברים עם דרגות שונות של פתולוגיה של EAE מתארת תמונה מופתית של קבוצת עכברים המשתנה מתסמיני EAE א-סימפטומטיים לתסמיני EAE בעלי ניקוד גבוה (ציון 4). כמו כן הוזכר קודם לכן כי משקל הגוף של עכברי EAE נמצא בקורלציה עם תסמינים קליניים. בהשוואה לעכברי WT, ירידה במשקל בעכברי EAE עשויה להתחיל להתרחש בימים הראשונים לאחר החיסון, בעוד שהתסמינים הקליניים של עכברי EAE מתחילים בדרך כלל ביום 6-9 לאחר החיסון ויגיעו לשיא ביום 14-16. לאחר מכן, הסימפטומים של עכברי EAE בדרך כלל מחלימים חלקית, ובמקביל הירידה במשקל של העכברים תוקל (איור 1B,C). לפיכך, מהלך ההתחלה של EAE מחולק בדרך כלל לתקופות התחלה מוקדמת, שיא והפוגה, והחיזוי של נקודות זמן אלה חשוב בהערכת פרמטרים של תוצאות. באופן כללי, כדי לנתח את הייצור של תאים חיסוניים וציטוקינים באתר של נגעים EAE, תאים חיסוניים במוח וחוט השדרה של עכברי EAE בשיא המחלה ניתן לבודד ולעבד עוד יותר, אשר ניתן לנתח על ידי ציטומטריה זרימה14,15. רקמת חוט השדרה בשיא הופעתה מתאימה גם להכנת צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E) והכתמה כחולה מהירה של לוקסול כדי לחקור עוד יותר את חדירת תאי הדלקת ודה-מיאלינציה של חוט השדרה14,16. לניטור שינויים במערכת החיסון בזמני התפרצות שונים של EAE, הטחול ובלוטות הלימפה בשלב מוקדם הן גם אפשרויות חיוניות17,18. בנוסף, תאים מהטחול או בלוטות הלימפה של עכברי EAE מחוסנים על ידי MOG משמשים בדרך כלל לבניית מודלים של העברה, אשר מועברים לעכברים מקבלים לאחר רסטימולציה של MOG במבחנה כדי לגרום לחיסון פסיבי של עכברי EAE18.

טרשת נפוצה היא נגע דלקתי אוטואימוני המושרה על ידי מערכת העצבים המרכזית המאופיין בדה-מיאלינציה דלקתית ואובדן עצבי 2,3. מחלה זו מלווה בדרך כלל בתחלואה פסיכיאטרית, כגון הפרעות רגשיות, אשר הפרעת חרדה שכיחה מאוד בחולי טרשת נפוצה, כאשר עד 30% מחולי טרשת נפוצה סובלים מחרדה 9,19. הפרעת חרדה היא חריגה פסיכיאטרית המאופיינת בלחץ נפשי מוגזם ודאגה. מבחן שדה פתוח משמש לעתים קרובות לניתוח התנהגויות לחרדה במכרסמים20,21. בעזרת ניתוח התנהגויות החקירה של עכברי EAE בבדיקות שדה פתוח במהלך תקופות ההתחלה, השיא וההפוגה המוקדמות, נמצא שגם לעכברי EAE היו התנהגויות דמויות חרדה הדומות לאלה של חולי טרשת נפוצה (איור 2A). במבחן שדה פתוח, מכרסמים חרדים נוטים להיות בעלי פעילות מופחתת והתנהגות סטריאוטיפית מוגברת, כולל העדפה להיות קרובים יותר לפינות, הטיה לכיוון הפריפריה וחוסר רצון לחקור את האזור המרכזי. בהשוואה לעכברי WT, לעכברי EAE היה מרחק הליכה וזמן תנועה נמוכים יותר באופן משמעותי בכל שלוש תקופות המחלה, אפילו בתחילת המחלה כאשר לעכברי EAE עדיין לא הייתה פגיעה מוטורית (איור 2B,C). בנוסף, עכברי EAE עוברים מרחק קטן יותר באופן משמעותי ונשארים באזור המרכזי פחות מעכברים רגילים, ואפילו נעים רק באזור ההיקפי, מה שמראה מצב רוח ברור דמוי חרדה (איור 2D,E). עכברי EAE עדיין מפגינים מצב רוח חזק דמוי חרדה כאשר ההתחלה מתונה, כלומר קואורדינציה מוטורית. מחקרים מסוימים מצביעים על כך שניתן לייחס זאת לדלקת עצבית קלה, המשפיעה עוד יותר על הפרשת הנוירוטרנסמיטר22,23. בדיקות בשטח פתוח המנטרות טריגרים של מצב רוח דמוי חרדה בעכברי EAE יכולות לסייע לחוקרים להבין ולטפל בתחלואה פסיכיאטרית בטרשת נפוצה.

עם התקדמות המחלה, טרשת נפוצה מתבטאת בסופו של דבר כדיסקינזיה. מחקרים מצאו כי חולי טרשת נפוצה הם בעלי רגישות גבוהה יותר לאוסטאופורוזיס ולשברים, בעיקר בשל אובדן מסת עצם, וכי חומרת הדיסקינזיה מתואמת מאוד עם צפיפות העצם שלהמטופל 24,25. תופעה דומה ניתן לראות על ידי ניתוח מיקרו-CT בעזרת מודל החיות של EAE (איור 3A,H). מנתוני הניתוח הטרבקולרי של עצם הירך בעכברים, עכברי EAE עברו ירידה משמעותית בצפיפות המינרלים בעצם (BMD) בהשוואה לעכברי WT, המהווים אינדיקטור חשוב לתגובה לחוזק העצם ובסיס חשוב לאבחון אוסטאופורוזיס (איור 3B). ניתוח נוסף הראה כי אובדן עצם טרבקולרי התרחש באופן משמעותי בעכברי EAE בהשוואה לעכברי WT בריאים והיה מלווה בירידה בצפיפות החיבור הטרבקולרי, במספרים הטרבקולריים ובעובי הטרבקולרי. כל אלה אופייניים לירידה במסת העצם, מה שמרמז על כך ש-EAE גורם גם לאובדן עצם טרבקולרית בעצם הירך של עכברים (איור 3C-F). במקביל, המורפולוגיה המבנית של טרבקולה העצם השתנתה, והמרווח של הטרבקולה גדל באופן משמעותי; ככל שהמרווח גדול יותר, כך העצם אוסטאופורוטית יותר (איור 3G). זה עולה בקנה אחד עם הרעיון שחולי טרשת נפוצה נוטים לאוסטאופורוזיס. בעצמות קליפת המוח של דיאפיזה של עצם עצם הירך, עובי העצם בקליפת המוח במודל EAE היה נמוך משמעותית מזה שבעכברים רגילים (איור 3I). בטרשת נפוצה, ירידה בתנועתיות וניוון שרירים מוגבר קשורים קשר הדוק לאוסטאופורוזיס, שבר, וספיגת עצם מוגברת עקב כוחות מכניים מופחתים, ירידה הדרגתית בשלמות העצם, ובכך להגדיל את הסיכון לאוסטאופורוזיס ושבר26. ניתוח מיקרו-CT של עצם הירך בעכברי EAE יכול לפקח היטב על בריאות העצם, וההתערבות מועילה בשליטה על מצב EAE.

Figure 1
איור 1: ניטור תסמינים קליניים של EAE. (A) תמונת המופת של העכברים עם דרגות שונות של פתולוגיה של EAE. (B) שינוי במשקל בעכברי WT ו-EAE. (C) ניקוד קליני בעכברי WT ו-EAE. הנתונים ניתנים כממוצע ± SEM (n = 5), ***p < 0.001 לעומת עכברי WT, מבחן ANOVA דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: התנהגות דמוית חרדה של עכברי EAE במבחן השדה הפתוח. (A) חלקות מסלול מייצגות של מבחן השדה הפתוח. מרחק נסיעה (B), משך הפעילות (C), מרחק הנסיעה במרכז (D) וזמן השהייה במרכז (E) של עכברי WT ועכברי EAE בתקופות של התחלה מוקדמת, שיא והפוגה. הנתונים ממוצעים ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 לעומת עכברי WT, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח מיקרו-CT של בריאות העצם בעכברי EAE. (A) תמונות תלת-ממדיות מייצגות של ארכיטקטורת עצם הירך (פסי קנה מידה, 100 מיקרומטר). צפיפות מינרלי העצם (B), נפח העצם/יחס נפח הרקמה (C), צפיפות החיבור (D), מספרים (E), עובי (F) והפרדה (G) של טרבקולרי הירך נקבעו על ידי ניתוח Micro-CT. (H) תמונות תלת-ממדיות מייצגות של עצם קליפת המוח (פסי קשקשים, 100 מיקרומטר). (I) עובי קליפת המוח המתקבל מנתוני טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. הנתונים ממוצעים ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 לעומת עכברי WT, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הציון סימן קליני
0 ללא סימנים קליניים
0.5 חולשת זנב, צניחת זנב קדמית
1 זנב משותק לחלוטין
2 שיתוק קל של גפיים אחוריות (חולשה של שתי הגפיים האחוריות או שיתוק חד צדדי, הליכה לא מתואמת, תגובה לצביטה)
3 שיתוק מוחלט של גפיים אחוריות, גפיים אחוריות נגררות והולכות, גפיים אחוריות שאינן מגיבות לצביטה
4 שיתוק הגפיים האחוריות וחולשת הגפיים הקדמיות
5 קרוב למוות או למוות

טבלה 1: שיטת הניקוד הקלינית.

אנטיגן זן תכונה יישום מגבלה
PLP SJL/J34 EAE חוזר-מעביר חקר האירועים התאיים והמולקולריים המעורבים בהישנות קלינית מוגבל לתגובות ספציפיות לתאי T; חקר גנים ומסלולים ספציפיים בזן SJL/J הוא מאתגר
מ.ב.פ. SJL/J35 שיתוק חוזר מלווה במושתלים חלקיים או בסך הכל לאחר החלמה משיתוק חריף חקר דלקת עצבית והפעלת מערכת החיסון מוגבל לתגובות ספציפיות לתאי T; חקר גנים ומסלולים ספציפיים בזן SJL/J הוא מאתגר
עמודים35-55 C57BL/631 EAE פרוגרסיבי ראשוני; EAE פרוגרסיבי כרוני לימוד מנגנוני נזק אקסונאליים; חקר מנגנוני מחלה מולקולריים במודלים מהונדסים ובמודלים של נוקאאוט מחקרי דה-מיאלינציה ראשוניים והתחדשות מיאלין הם בעלי ערך מוגבל
הומוגנט של חוט השדרה ביוצי ABH36 EAE חוזר-מעביר חקר התחדשות המיאלין וטיפול נוירו-פרוטקטיבי לטרשת נפוצה לא פרוגרסיבי מבחינה קלינית, עם הצטברות של ליקויים נוירולוגיים לאורך זמן; מוגבל לתגובות ספציפיות של תאי T מסוג CD4
וירוס מורין אנצפלומיאליטיס של תיילר זנים מרובים של עכברים רגישים מאוד, כולל SJL/J, SWR, PL/J 12,31 מודלים ויראליים של דה-מיאלינציה דלקתית מחקר על פגיעה אקסונאלית ודה-מיאלינציה הנגרמת על ידי דלקת לא זוהו זיהומים נגיפיים ספציפיים לטרשת נפוצה; התחדשות המיאלין קשה להערכה, דה-מיאלינציה והתחדשות המיאלין מתרחשות בו זמנית
קופריזון בשימוש נרחב בעכברי C57BL/6, בעוד שזנים אחרים, כגון זן CD1, רגישים פחות לנזק הנגרם על ידי קופריזון נחושת37,38 מודל רעיל של דה-מיאלינציה ורמילינציה חקר דה-מיאלינציה שאינה תלויה בתאי T, במיוחד התחדשות המיאלין ותהליכי תיקון מיאלין בסיסיים התחדשות מיאלין ספונטנית משמעותית מתרחשת לאחר הפסקת פגיעה רעילה; דה-מיאלינציה היא ספציפית לאזור המוח ואינה שימושית לחקר דה-מיאלינציה של חוט השדרה
ליסולציטין SJL / J12, C57BL / 639 וכו '. מודל רעיל של דה-מיאלינציה ורמילינציה חקר דה-מיאלינציה שאינה תלויה בתאי T, במיוחד התחדשות המיאלין ותהליכי תיקון מיאלין בסיסיים חוסר תגובה חיסונית שנצפה במהלך טרשת נפוצה
אתידיום ברומיד C57BL/640 וכו'. מודל רעיל של דה-מיאלינציה ורמילינציה חקר נגעים דמיילינציה מוקדיים וניבוי הקינטיקה של דה-מיאלינציה והתחדשות המיאלין אתידיום ברומיד פוגע בכל הגרעין המכיל תאים; מתאם מוגבל עם טרשת נפוצה

טבלה 2: מודלים שונים של עכברים של טרשת נפוצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית של מערכת העצבים המרכזית והיא אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר הגורמות לנכות כרונית בקרב צעירים, ומטילה נטל עצום על המשפחות והחברה 3,4. טרשת נפוצה תמיד סווגה כמחלה אוטואימונית ספציפית לתאי T בתיווך, מה שגורם למערכת האוטואימונית לשחוק לאט את מערכת העצבים המרכזית, מה שמערב מערכות מרובות בכל הגוף27. תסמינים קליניים אופייניים כוללים ליקוי ראייה, הפרעות מוטוריות, הפרעות קוגניטיביות ורגשיות וכו'6,7. טרשת נפוצה היא מחלה הרסנית שתחמיר בהדרגה אם לא תטופל כראוי, מה שיוביל לעיוורון חמור ושיתוק28. הפתוגנזה של טרשת נפוצה עדיין אינה מובנת במלואה, שכן ביטוייה הקליניים והתקדמותה הפתולוגית הם הטרוגניים, ולכן מודלים של בעלי חיים חיוניים למחקר ופיתוח הטיפול בטרשת נפוצה.

מודל בעלי החיים הנחקר ביותר עבור טרשת נפוצה הוא EAE, הכולל בעיקר שתי שיטות מידול: חיסון אקטיבי וחיסון פסיבי29. הראשון מאומץ באופן נרחב בגלל פשטותו, היעדר הקרנה של עכברים וזמן מחזור קצר. מודל החיסון הפעיל של EAE משרה תגובות אוטואימוניות במערכת העצבים המרכזית על ידי חיסון מכרסמים עם אנטיגנים של מיאלין עצמי או הפפטידים הבאים שלהם, המתבטאים בדרך כלל כחולשת זנב ושיתוק גפיים13. באופן ספציפי, מודל EAE המושרה על ידי MOG 35-55 בעכברי C57BL/6J מאופיין במחזורי הפוגה-הישנות לסירוגין, מלווים בדלקת במערכת העצבים המרכזית, דה-מיאלינציה ופציעה אקסונלית, מה שהופך את ה-EAE המושרה על ידי MOG35-55 לדגםהמועדף 11,12. EAE יכול להיות מושרה היטב בעכברים רגישים על ידי הזרקה תת עורית של פפטיד MOG 35-55, מתחלב עם immunopotentiator CFA מועשר ב- MTB, ומקבל זריקה תוך צפקית של PTX עם מחסום דם-מוח משבש את ההשפעה על ימים0-2 30. האתגר הגדול ביותר למודל EAE הוא השכיחות הנמוכה של תסמינים חלשים, וכמה גורמים משפיעים הם קריטיים למהלך הניסוי. (1) הגיל והסביבה של עכברים ישפיעו על הרגישות ל-EAE. לכן, עכברים באותו גיל צריכים להיבחר לפני הניסוי. יש לשקלל את העכברים ולקבץ אותם באופן אקראי לפני הקצאת הכלובים, ויש לשמור על משקלה של כל קבוצה קרוב. כמו כן, ודא כי התנאים הסביבתיים בין ניסויים עצמאיים דומים. (2) ריכוז ה-PTX: התפקיד העיקרי של PTX הוא להגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח, המאפשר לתאי T פתוגניים להיכנס למערכת העצבים המרכזית כדי להפריש ציטוקינים רלוונטיים ולקדם את התגובה הדלקתית, מה שמוביל בסופו של דבר להידרוליזה של חלבוני מיאלין העטופים בשכבה החיצונית של אקסונים עצביים. הופעת המחלה בעכברי EAE התעכבה עם ירידה בריכוז מתן PTX, וחומרת המחלה תיחלש אם PTX ירד ביותר מ -60%. (3) פירוק אנטיגן MOG 35-55: כדי למנוע הקפאה והפשרה, מומלץ לרכוש את האנטיגן MOG35-55 הlyophilized באריזות נפרדות, 4 מ"ג/צינור, כדי למנוע הקפאה והפשרה. כמו כן, PTX משמש לפירוק במקום מים סטריליים כי עדיף לתחליב עם CFA באמצעות PTX. (4) אנטיגן MOG35-55 ו-CFA חייבים להיות מתחלבים במידה מספקת על ידי תנודה כדי ליצור מבנה של מים בשמן, וטיפות האמולסיה אינן מתפזרות על פני המים במשך זמן רב, מה שמעיד על תחליב טוב. (5) הזרקה דו-נקודתית שימשה למידול EAE בעכבר. אתר ההזרקה עדיף ממוקם מעל המותניים ומתחת לצוואר, קרוב לעמוד השדרה, כדי למנוע מעכברים ללקק ולנשוך את העור, וכתוצאה מכך נשפך של תחליב MOG35-55.

עם זאת, מודל EAE המושרה על ידי אנטיגןMOG 35-55 עדיין יש כמה מגבלות. כמודל אנצפלופתיה דלקתית של פגיעה אקסונאלית ראשונית המתווכת על ידי תאי T CD4, הנגע העיקרי הוא ניוון אקסונאלי מסיבי עם דה-מיאלינציה משנית ופחות דה-מיאלינציה ראשונית, השונה מהפתולוגיה של טרשת נפוצה31,32,33. מודל EAE המושרה על ידי MOG35-55 משקף בעיקר את התגובה החיסונית המונעת על ידי תאי T CD4, בעוד שלתאי חיסון אחרים כגון תאי CD8 T ו- B אין תחושה חזקה של השתתפות במודל31 זה. גורם מגביל נוסף הוא של- EAE המושרה על ידי MOG 35-55 יש הטיה מסוימת כלפי המרכיב החיסוני של פתופיזיולוגיה של טרשת נפוצה,וניתן לשקול מודלים אחרים של בעלי חיים כאשר בוחנים מחקרים המתמקדים בפאתולוגיות CNS, כגון חקר תהליכי דה-מיאלינציה והתחדשות מיאלין 34,35,36,37,38,39,40, כמתואר בטבלה 2 .

EAE הוא מנבא יעיל בחיקוי התכונות האוטואימוניות של טרשת נפוצה, כמו גם מנגנון הדלקת והדה-מיאלינציה שלו12, מה שגורם לחוקרים רבים להוט לחקור את המנגנונים האימונומודולטוריים שלו, תוך התעלמות מתסמינים קליניים אחרים של טרשת נפוצה. מחקרים הראו כי חרדה הקשורה לטרשת נפוצה מיוחסת לתהליכים פתופיזיולוגיים כגון דיסרגולציה חיסונית ודלקת במוח22, 23,41. בעיות נפשיות, כגון חרדה, שכיחות במיוחד בקרב חולי טרשת נפוצה, והפרעת חרדה עלולה לפגוע בביצוע מטלות יומיומיות בסיסיות ולהשפיע באופן משמעותי על איכות החיים42,43. שינויים ביכולת התנועה של עכברי EAE עשויים לחזות שינויים בתהליכים עצביים. בניסויים בשטח פתוח, התנהגויות דמויות חרדה התרחשו בעכברי EAE, כולל ירידה בהתנהגויות חקר שהחלו את הופעתה המוקדמת של המחלה (למעשה, נבדקים עם ציונים קליניים <0.5 ויכולת תנועה טובה כמעט כמו עכברים רגילים), מה שמצביע על כך שהופעת התנהגויות דמויות חרדה קודמת לפגיעה מוטורית. בנוסף, עכברי EAE בתקופת ההפוגה לא שיפרו התנהגות דמוית חרדה עם יכולת מוטורית מוגברת. הופעתה של התגובה הדלקתית עשויה להיות אחראית לפגיעה הנפשית בעכברי EAE באמצעות פעילות עצבית, מה שמוביל לשינויים במצב הרוח, ועלייה ברמות הציטוקינים הדלקתיים מפריעה לתפקוד הסינפטי הסטריאטלי לפני הופעת הפגיעה המוטורית23,41. עם זאת, בדיקת השדה הפתוח דורשת תשומת לב לעובדה שחדר הבדיקה חייב להיות אזור שקט, ועכברי הבדיקה צריכים להתאקלם לחדר למשך שעה מראש כדי למנוע לחץ מוגזם שנגרם על ידי הסביבה החדשה. ניקוי נוסף עם אתנול נדרש בין הבדיקות כדי להסיר ריחות וחומרים אחרים שהותיר אחריו הנבדק האחרון. המגבלה העיקרית של מבחן השדה הפתוח היא ההפרעה הנגרמת על ידי תפקוד מוטורי לקוי בעכברי EAE, והמבחן להערכת התנהגות דמוית חרדה של מכרסמים מבוסס על המרחק, הזמן והטווח של פעילות המכרסמים בתא התגובה, ואינו יכול לשלול את ההשפעה של תפקוד לקוי מוטורי על התנהגות דמוית חרדה. לכן, מחקרים עתידיים צריכים לקחת בחשבון פגיעה לוקומוטורית.

שיטות מסורתיות לניתוח מחקרים הקשורים לרקמת עצם משתמשות לעתים קרובות במיקרוסקופיה דו-ממדית של חתך עצם, אשר יכולה להיות בעלת קשיים גדולים יותר בניתוח מורפולוגיה מבנית, התפלגות צפיפות, התפלגות אוריינטציה ומאפיינים אחרים בשל השפעת מישורים דו-ממדיים ואי-הומוגניות של דגימות ביולוגיות. מחקרים רבים אישרו את הדיוק והיעילות של מערכת Micro-CT לתיאור מורפולוגיה של עצם, ומחקרים רבים44,45,46 אישרו תוצאות זיהוי מיקרו-מבנה. ההדמיה התלת-ממדית של רקמת העצם על ידי Micro-CT מאפשרת תוצאות אינטואיטיביות ומדויקות יותר של היסטומורפומטריה של העצם. הושג לסרוק בעלי חיים קטנים ודגימות מבלי להוציא להורג את החיה או לפגוע בדגימת הרקמה, מה שמאפשר מידע מפורט על מבנה מרחבי תלת מימדי בתוך הרקמה44. מחקרים הראו כי חולי טרשת נפוצה נוטים לאובדן מסת עצם ואוסטאופורוזיס24,25; על ידי סריקה והדמיה של עצם הירך של עכברי EAE עם מערכת Micro-CT, ניתן היה לראות הידרדרות ברורה של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם וירידה בחוזק העצם בעצם הירך של עכברי EAE בהשוואה לעכברי WT שפיתחו אוסטאופורוזיס. ניתוח מיקרו-CT הוא פשוט יחסית לביצוע וזול יחסית, וניתן להשתמש בהדמיה חיה של Micro-CT כדי לנטר את בריאות העצם בעתיד בעת מתן טיפול לעכברי EAE. עם זאת, החיסרון הוא היעדר סמני תחלופת עצם המוערכים באמצעות דגימות דם או היסטומורפומטריה של העצם כדי לבחון שינויים יסודיים בהומאוסטזיס מטבולי של העצם בעכברי EAE47. ויסות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים יכול להיחשב במחקר בעתיד.

טרשת נפוצה היא מחלה מרובת תסמינים, והמטרה היחידה של ניהול המחלה היא למזער את תסמיני המחלה. בפרוטוקול שהוזכר לעיל, ניתן לדמות את הסימפטומים הקליניים של טרשת נפוצה על ידי בניית מודל MOG35-55 המושרה על ידי EAE. עכברי EAE הראו תסמינים קליניים של תפקוד מוטורי לקוי והתנהגות דמוית חרדה, ואוסטאופורוזיס. מערכת הניקוד של 5 נקודות, מבחן שדה פתוח וניתוח Micro-CT המתוארים בפרוטוקול זה יכולים לעקוב אחר הסימפטומים הפתולוגיים של עכברי EAE מנקודות מבט מרובות ולספק ערכת ייחוס לטיפול ב- EAE. בהיעדר תרופות יעילות משנות מחלה, שילוב פוטנציאלי של טיפול סינרגטי יכול לספק את ההזדמנות הטובה ביותר להקל על הסימפטומים ולשפר את התפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מכירים בתמיכת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) והמעבדה הממלכתית לחקר תרופות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
  2. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
  5. O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
  6. Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
  7. Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
  8. Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
  9. Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
  10. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
  11. Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
  12. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
  13. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  14. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
  15. Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
  16. Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
  17. Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
  18. McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
  19. Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
  20. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  21. Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
  22. Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
  23. Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
  24. Hearn, A. P., Silber, E. Osteoporosis in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. 16, 1031-1043 (2010).
  25. Gibson, J. C., Summers, G. D. Bone health in multiple sclerosis. Osteoporosis International. 22, 2935-2949 (2011).
  26. Ye, S., Wu, R., Wu, J. Multiple sclerosis and fracture. The International Journal of Neuroscience. 123, 609-616 (2013).
  27. Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
  28. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  29. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Current Protocols. 1 (6), 185 (2021).
  30. Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
  31. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
  32. Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
  33. Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
  34. McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
  35. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  36. Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
  37. Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
  38. Yu, Q., et al. Strain differences in cuprizone induced demyelination. Cell & Bioscience. 7, 59 (2017).
  39. Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
  40. Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
  41. Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
  42. Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
  43. Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
  44. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  45. Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
  46. Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
  47. Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 187 טרשת נפוצה אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים דלקת עצבית התנהגות דמוית חרדה אוסטאופורוזיס
אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie,… More

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter