Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Induktion og forskellige vurderingsindikatorer for eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/63866
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Putuo People's Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol beskriver induktionen af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis i en musemodel ved hjælp af myelin oligodendrocytglykoprotein og overvågning af sygdomsprocessen ved hjælp af et klinisk scoringssystem. Eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis-relaterede symptomer analyseres ved hjælp af muselårbensmikrocomputertomografianalyse og åben felttest for at vurdere sygdomsprocessen omfattende.

Abstract

Multipel sklerose (MS) er en typisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) præget af inflammatorisk infiltration, demyelinisering og axonal skade. I øjeblikket er der ingen foranstaltninger til at helbrede MS fuldstændigt, men flere sygdomsmodificerende terapier (DMT) er tilgængelige for at kontrollere og afbøde sygdomsprogression. Der er betydelige ligheder mellem de CNS patologiske træk ved eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) og MS-patienter. EAE er i vid udstrækning blevet brugt som en repræsentativ model til at bestemme MS-lægemidlers effektivitet og udforske udviklingen af nye terapier til MS-sygdom. Aktiv induktion af EAE hos mus har en stabil og reproducerbar effekt og er særligt velegnet til at studere virkningerne af lægemidler eller gener på autoimmun neuroinflammation. Metoden til immunisering af C57BL/6J-mus med myelin oligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) og den daglige vurdering af sygdomssymptomer ved hjælp af et klinisk scoringssystem deles hovedsageligt. I betragtning af den komplekse ætiologi af MS med forskellige kliniske manifestationer kan det eksisterende kliniske scoringssystem ikke tilfredsstille vurderingen af sygdomsbehandling. For at undgå manglerne ved en enkelt intervention oprettes nye indikatorer til vurdering af EAE baseret på kliniske manifestationer af angstlignende stemninger og osteoporose hos MS-patienter for at give en mere omfattende vurdering af MS-behandling.

Introduction

Autoimmune sygdomme er et spektrum af lidelser forårsaget af immunsystemets immunrespons på dets egne antigener, hvilket resulterer i vævsskade eller dysfunktion1. Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sygdom af polyneuropati i centralnervesystemet (CNS), karakteriseret ved inflammatorisk infiltration, demyelinering og neuronal axonal degeneration 2,3. På nuværende tidspunkt har MS påvirket så mange som 2,5 millioner mennesker rundt om i verden, for det meste unge og midaldrende mennesker i alderen 20-40 år, som ofte er rygraden i deres familier og samfund. Dette har forårsaget betydelig indvirkning og skade på familier og samfund 2,4.

MS er en multifaktoriel sygdom med forskellige og komplekse kliniske manifestationer. Ud over klassiske neurologiske lidelser præget af inflammatorisk infiltration og demyelinisering viser MS ofte synshandicap, lemmer dyskinesi og kognitive og følelsesmæssige lidelser 5,6,7. Hvis MS-patienter ikke får den rette og korrekte behandling, vil halvdelen af dem leve i kørestole efter 20 år, og næsten halvdelen af dem vil opleve depressive og angstsymptomer, hvilket fører til meget højere niveauer af selvmordstanker end den generelle befolkning 8,9.

På trods af en lang forskningsperiode forbliver ætiologien af MS undvigende, og patogenesen af MS er endnu ikke blevet belyst. Dyremodeller af MS har gjort det muligt at tjene som testværktøjer til at udforske sygdomsudvikling og nye terapeutiske tilgange på trods af de betydelige forskelle mellem gnaveren og det menneskelige immunsystem, samtidig med at de deler nogle grundlæggende principper. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er i øjeblikket den ideelle dyremodel til undersøgelse af MS, som bruger autoantigenimmunitet fra myelinproteiner til at inducere autoimmunitet over for CNS-komponenter hos modtagelige mus med tilsætning af komplet Freunds adjuvans (CFA) og kighostetoksin (PTX) for at forbedre det humorale immunrespons. Afhængigt af den genetiske baggrund og immunantigener opnås forskellige sygdomsprocesser, herunder akutte, recidiverende-remitterende eller kroniske, for at efterligne forskellige kliniske former for MS10,11,12. De relevante immunogener, der almindeligvis anvendes til konstruktion af EAE-modeller, kommer fra selv-CNS-proteiner, såsom myelinbasisk protein (MBP), proteolipidprotein (PLP) eller myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG). MBP- eller PLP-immuniserede SJL/L-mus udvikler et recidiverende-remitterende forløb, og MOG udløser kronisk progressiv EAE hos C57BL/6 mus11,12,13.

Hovedformålet med sygdomsmodificerende terapi (DMT) er at minimere sygdomssymptomer og forbedre funktion6. Flere lægemidler bruges klinisk til at lindre MS, men der er endnu ikke brugt noget lægemiddel til fuldstændigt at helbrede det, hvilket afslører nødvendigheden af synergistisk behandling. C57BL/6-mus er i øjeblikket de mest almindeligt anvendte til at konstruere transgene mus, og i dette arbejde blev en EAE-model induceret af MOG35-55 i C57BL/6J-mus med en 5-punkts skala brugt til at overvåge sygdomsprogressionen. EAE-modeller lider også af angstlignende stemninger og knogletab og de almindeligt kendte demyeliniserende læsioner. Her beskrives også metoden til at vurdere symptomerne på EAE fra flere perspektiver ved hjælp af open-field test og mikrocomputertomografi (Micro-CT) analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal Care Committee of Tongji University godkendte det nuværende arbejde, og alle retningslinjer for dyrepleje blev fulgt. Mandlige eller kvindelige C57BL / 6J mus mellem 8-12 uger blev brugt til forsøgene. Det blev sikret, at alder og køn var det samme i forsøgsgrupperne; Ellers blev modtageligheden for sygdommen påvirket. Mus blev anbragt i et specifikt patogenfrit miljø med skiftevis 12 timers lyse og mørke cyklusser under konstante forhold (stuetemperatur 23 ± 1 ° C, fugtighed 50% ± 10%) med fri adgang til musemad og vand.

1. Fremstilling af MOG35-55 emulsion

  1. Tilsæt varmeinaktiveret lyofiliseret Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) for at fuldføre Freunds adjuvans (selv indeholdende 1 mg / ml varmeinaktiveret MTB, H37Ra), hvilket resulterer i en endelig MTB-koncentration på 5 mg / ml (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Hele operationen skal udføres i biosikkerhedsskabet; Åbn ikke blæseluften.
  2. Det frysetørrede MOG35-55 peptid (se Materialetabel) opløses med sterilt forkølet fosfatbufferet saltvand (PBS) (uden calcium- og magnesiumioner, pH 7,4) for at fremstille antigenopløsningen i en koncentration på 2 mg/ml.
  3. Tag et rent 2 ml mikrocentrifugerør og tilsæt en steriliseret 5 mm stålkugle (se Materialetabel) til hvert rør.
  4. Der tilsættes 500 μL komplet Freunds adjuvans indeholdende 5 mg/ml MTB og 500 μL MOG35-55 antigenopløsning til ovennævnte mikrocentrifugerør indeholdende en stålkugle.
  5. Oscilerer ovenstående rør på en TissueLyser (se Materialetabel) i 10 minutter, afkøles på is i 10 minutter og gentages fire gange for at blande det godt og til sidst danne en hvid tyktflydende opløsning.
    BEMÆRK: God emulgering er et vigtigt trin i forberedelsen af MOG35-55 emulsion, så grundig blanding er påkrævet. TissueLyser er indstillet til en hastighed på 28 Hz.

2. Fremstilling af kighostetoksin (PTX)

  1. PTX med ddH2O tilberedes i en koncentration på 100 μg/ml og opbevares ved 4 °C.
  2. PTX-stamopløsningen fortyndes 50 gange med steril 1x PBS (uden calcium- og magnesiumioner, pH 7,4) for at fremstille en 200 ng/100 μL opløsning til brug.

3. Etablering af EAE-dyremodel

  1. Konstruer EAE-modellen ved hjælp af de 8-12 uger gamle C57BL/6J-hanmus eller -hunmus. Sørg for, at musene er tilstrækkeligt akklimatiseret til fodringsmiljøet inden immunisering.
  2. Den tilberedte MOG35-55 emulsion (trin 1) centrifugeres ved 4 °C i 2-3 s ved at trykke på udstyrets pulsknap (se Materialetabel) for at udfælde alle emulsioner i bunden af røret.
    BEMÆRK: MOG35-55 emulsion kan opbevares ved -20 °C i flere dage. For at undgå lægemiddelsvigt anbefales det at bruge det så hurtigt som muligt.
  3. Fastgør en 22 G nål til en 1 ml sprøjte tønde, opsug MOG 35-55 emulsionen, og overfør MOG35-55 emulsionen til en ny 1 ml sprøjte tønde. Fastgør forbindelsen mellem 1 ml sprøjtetønde og en 26 G nål med tætningsfilm (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Undgå luftbobler, når du lægger MOG35-55 emulsion i 1 ml sprøjtetønder.
  4. Tør og desinficer injektionsstedet med 70% ethanol.
  5. Injicer MOG35-55 emulsionen subkutant på hver side af musenes rygsøjle, 100 μL på hver side. Overhold den automatiske dannelse af pæremasser under huden på musens dorsum, efter at injektionsoperationen er afsluttet.
    BEMÆRK: Sørg for, at erfarne eksperimenter udfører immuniseringsprocessen, og at injektionen udføres forsigtigt og langsomt for at minimere trykket på mus.
  6. Injicer ovennævnte mus intraperitonealt med 100 μL PTX (trin 2).
    BEMÆRK: Dagen for immunisering er dag 0. Sørg også for, at musene kan identificeres nøjagtigt til efterfølgende daglig evaluering, såsom at bruge en farvemarkør på musens hale.
  7. Injicer den samme dosis PTX på dag 2 efter immunisering.
  8. Forbered en gruppe uimmuniserede mus som vildtype (WT) mus.

4. Klinisk monitorering af mus

  1. Optag kropsvægten af EAE- og WT-mus dagligt.
    BEMÆRK: Sværhedsgraden af EAE er positivt korreleret med vægttabet af mus, så kropsvægt er også et meget vigtigt overvågningsindeks.
  2. Overvåg status for mus fra 0-21 dage efter immunisering ved hjælp af 0-5 scoringssystemet, der er anført i tabel 1.
    BEMÆRK: Symptomer imellem tælles som plus eller minus 0,5 point.

5. Åben feltprøve

BEMÆRK: De forsøgsdyr, der er valgt til dette trin, er EAE-mus i de tidlige begyndelses-, peak- og remissionperioder. Derudover blev WT-mus brugt som kontrol. Det skal bemærkes, at alle mus blev testet for angstlignende adfærd forud for modellering for at udelukke mus med angstlidelser til EAE-modellering. Desuden blev EAE-mus i spidsbelastnings- og remissionsperioder med fuldstændig motorisk uarbejdsdygtighed udelukket fra testen.

  1. Forbered et 40 × 40 × 40 cm3 åbent feltreaktionskammer og et bevægelsesaktivitet (åbent felt) videoanalysesystem (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Kameraet er installeret i en position, der helt dækker kassen, reaktionsrummet er jævnt oplyst, og testrummet skal være et roligt område.
  2. Placer testmusene i testrummet til tilvænning 1 time, før forsøget påbegyndes.
  3. Sprøjt hele området med 70% ethanol og tør af med et rent papirhåndklæde for at sikre, at reaktionskammeret er rent, inden testen påbegyndes.
  4. Fjern hver mus individuelt fra sit bur og placer den i samme hjørne af arenaen, før du begynder at udforske.
    BEMÆRK: Bunden af boksen er opdelt i 16 gitre, hvoraf det midterste fire gitterområde er det centrale område og det omkringliggende område er det perifere område.
  5. Klik på Start optagelse knappen i menulinjen i videoanalysesystemet, optag tid og begynd at optage.
  6. Hold stille i testrummet.
  7. Lad musen bevæge sig frit i 5 minutter under optagelsesprocessen.
  8. Stop anskaffelsessystemet, og gem videoen.
  9. Tag musen ud af arenaen, sæt den tilbage i buret, og fortsæt til den næste mus.
    BEMÆRK: Rengør testområdet med 70% ethanol mellem kørsler for at fjerne lugt og andre stoffer.
  10. Analyser resultaterne ved hjælp af videoanalysesystemet.

6. Analyse af knoglefænotype

  1. Afliv EAE- og WT-musene ved cervikal dislokation på den 21. dag.
    BEMÆRK: Personale, der udfører cervikal dislokationsoperationer, skal være veluddannet for at minimere smerten under dyrets død.
  2. Lad musen ligge fladt i en dissekeringsbakke og fastgør ekstremiteterne.
  3. Hold musens bagbenshud med tang og åbn musens hud og muskelvæv med en saks.
  4. Adskil lårbenet fra skinnebenet og hoftebenet forsigtigt med en saks.
  5. Fjern musklen, der klæber til lårbenet med en saks, og læg lårbenet i 70% ethanol ved stuetemperatur.
  6. Scan det distale lårben ved hjælp af et mikro-CT-system (se Materialetabel) med en isotrop voxelstørrelse på 10 μm, med en maksimal røntgenrørspænding på 70 kV og en røntgenintensitet på 0,114 mA.
    BEMÆRK: Et 3D Gaussisk filter tillader denoising af 2D-tærskelbilleder.
  7. Analyser de 100 skiver, der er scannet fra det midterste lårbensskaft for at måle lårbensparametre, herunder knoglevolumen, vævsvolumen, knoglemineraltæthed, trabekulær adskillelse, trabekulært antal, trabekulær forbindelsestæthed og trabekulær og kortikal tykkelse.
    BEMÆRK: Fra den proksimale ende af den distale lårbensvækstplade hos mus blev der fundet sektioner helt blottet for epifysekappestrukturer og fortsatte med at strække 100 skiver mod det proksimale lårben, som manuelt blev skitseret konturer ved flere voxels væk fra den indre kortikale overflade for at identificere epifyseal trabeculae.
  8. Opret 3D-rekonstruktionerne ved at stable tærskel 2D-billeder fra konturområder i mikro-CT-systemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter immunisering af musene registreres musenes kropsvægt dagligt, og deres kliniske symptomer evalueres i henhold til protokollen beskrevet ovenfor (trin 4). I C57BL/6J mus immuniseret med MOG peptid, fordi placeringen af læsionen hovedsageligt er begrænset til rygmarven, spredes patogenesen af EAE-mus fra haleenden til hovedet. I begyndelsen af sygdommen udviser EAE-mus svaghed og hængende hale efterfulgt af svaghed i bagbenene, ukoordineret bevægelse og lammelse. Efterhånden som sygdommen forværres, udvikler den sig gradvist til svaghed i forbenene, lammelse og forårsager i alvorlige tilfælde vanskeligheder med at flytte musene og endda nær døden. Som vist i figur 1A viser tilstandsdiagrammet for musene med forskellige grader af EAE-patologi et eksemplarisk billede af en gruppe mus, der skifter fra asymptomatiske til højt scorende EAE-symptomer (score 4). Det er også tidligere blevet nævnt, at kropsvægten af EAE-mus er korreleret med kliniske symptomer. Sammenlignet med WT-mus kan vægttab hos EAE-mus begynde at forekomme i de første par dage efter immunisering, mens de kliniske symptomer på EAE-mus normalt begynder på dag 6-9 efter immunisering og vil nå et højdepunkt på dag 14-16. Herefter kommer symptomerne på EAE-mus sig generelt delvist, og samtidig lindres musenes vægttab (figur 1B,C). Således er EAE-starten normalt opdelt i perioder med tidlig begyndelse, top og remission, og forudsigelsen af disse tidspunkter er vigtig for at vurdere resultatparametre. Generelt kan immunceller i hjernen og rygmarven hos EAE-mus på toppen af sygdommen isoleres og behandles yderligere for at analysere produktionen af immunceller og cytokiner på stedet for EAE-læsioner, som kan analyseres ved flowcytometri14,15. Rygmarvsvævet ved maksimal begyndelse er også bedst egnet til fremstilling af hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og luxol hurtig blå farvning for yderligere at undersøge den inflammatoriske celleinfiltration og demyelinering af rygmarven14,16. Til overvågning af ændringer i immunsystemet ved forskellige begyndelsestider af EAE er milt og lymfeknuder ved tidlig begyndelse også vigtige muligheder17,18. Derudover bruges celler fra milten eller lymfeknuderne hos MOG-immuniserede EAE-mus almindeligvis til at konstruere overførselsmodeller, som overføres til modtagermus efter restimulering af MOG in vitro for at inducere passiv immunisering af EAE-mus18.

MS er en autoimmun inflammatorisk induceret demyeliniserende læsion i centralnervesystemet karakteriseret ved inflammatorisk demyelinisering og neuronalt tab 2,3. Denne sygdom ledsages normalt af psykiatriske comorbiditeter, såsom affektive lidelser, hvoraf angstlidelse er meget almindelig hos MS-patienter, hvor op til 30% af MS-patienter lider af angst 9,19. Angstlidelse er en psykiatrisk abnormitet præget af overdreven følelsesmæssig stress og bekymring. Åben felttest bruges ofte til at analysere adfærd for angst hos gnavere20,21. Ved hjælp af analyse af EAE-muses udforskningsadfærd i åbne feltforsøg i tidlige debut-, peak- og remissionperioder blev det konstateret, at EAE-mus også havde angstlignende adfærd svarende til MS-patienter (figur 2A). I den åbne felttest har ængstelige gnavere tendens til at have reduceret aktivitet og øget stereotyp adfærd, herunder en præference for at være tættere på hjørner, en bias mod det perifere domæne og manglende lyst til at udforske det centrale område. Sammenlignet med WT-mus havde EAE-mus signifikant lavere gangafstand og bevægelsestid i alle tre perioder af sygdommen, selv i sygdommens tidlige begyndelse, da EAE-mus endnu ikke havde en motorisk svækkelse (figur 2B, C). Derudover passerer EAE-mus betydeligt mindre afstand og forbliver i det centrale område mindre end normale mus og bevæger sig endda kun i det perifere område, hvilket viser tydeligt angstlignende humør (figur 2D, E). EAE-mus udviser stadig et stærkt angstlignende humør, når starten er mild, det vil sige motorisk koordination. Nogle undersøgelser tyder på, at dette kan tilskrives mild neuroinflammation, som yderligere påvirker neurotransmittersekretion22,23. Åbne feltforsøg, der overvåger angstlignende humørudløsere hos EAE-mus, kan hjælpe forskere med at forstå og behandle MS psykiatriske comorbiditeter.

Med sygdommens fremskridt manifesterer MS i det væsentlige i sidste ende som dyskinesi. Undersøgelser har vist, at MS-patienter har en højere modtagelighed for osteoporose og brud, hovedsageligt på grund af knoglemassetab, og at sværhedsgraden af dyskinesi er stærkt korreleret med patientens knogletæthed24,25. Et lignende fænomen kan observeres ved mikro-CT-analyse ved hjælp af EAE-dyremodellen (figur 3A, H). Fra de trabekulære analysedata for lårben hos mus gennemgik EAE-mus et signifikant fald i knoglemineraltætheden (BMD) sammenlignet med WT-mus, hvilket er en vigtig indikator for responsen på knoglestyrke og et vigtigt grundlag for diagnosen osteoporose (figur 3B). Yderligere analyse viste, at trabekulært knogletab forekom signifikant hos EAE-mus sammenlignet med raske WT-mus og blev ledsaget af en reduktion i trabekulær forbindelsestæthed, trabekulære tal og trabekulær tykkelse. Disse er alle karakteristiske for reduceret knoglemasse, hvilket tyder på, at EAE også forårsager trabekulært knogletab i lårbenet hos mus (figur 3C-F). Samtidig ændrede knogletrabeculaens strukturelle morfologi sig, og afstanden mellem trabeculae steg betydeligt; jo større afstand, jo mere osteoporotisk knoglen (figur 3G). Dette er i overensstemmelse med forestillingen om, at MS-patienter er tilbøjelige til osteoporose. I kortikale knogler i lårbensdiafysen var tykkelsen af kortikal knogle i EAE-modellen signifikant mindre end hos normale mus (figur 3I). Ved MS er nedsat bevægelighed og øget muskeldystrofi stærkt forbundet med osteoporose, brud og øget knogleresorption på grund af reducerede mekaniske kræfter, der gradvist reducerer knogleintegriteten og derved øger risikoen for osteoporose og brud26. Mikro-CT-analyse af lårbenet i EAE-mus kan overvåge knoglesundheden godt, og interventionen er gavnlig til at kontrollere tilstanden af EAE.

Figure 1
Figur 1: Overvågning af kliniske symptomer på EAE. (A) Det eksemplariske billede af musene med forskellige grader af EAE-patologi. (B) Vægtændring hos WT- og EAE-mus. (C) Klinisk score i WT- og EAE-mus. Data er angivet som gennemsnit ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 versus WT-mus, tovejs ANOVA-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: EAE-muses angstlignende opførsel i åben marktesten. (A) Repræsentative sporplotter for den åbne feltprøve. Rejseafstand (B), aktivitetsvarighed (C), rejseafstand i midten (D) og tid brugt i midten (E) for WT-mus og EAE-mus i perioder med tidlig begyndelse, top og remission. Data er gennemsnitlige ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus WT-mus, Student's t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Mikro-CT-analyse af knoglesundhed hos EAE-mus. (A) Repræsentative 3D-billeder af lårbens trabekulær arkitektur (skalastænger, 100 μm). Knoglemineraltæthed (B), knoglevolumen / vævsvolumenforhold (C), forbindelsestæthed (D), tal (E), tykkelse (F) og adskillelse (G) af lårbenstrabekulær blev bestemt ved mikro-CT-analyse. (H) Repræsentative 3D-billeder af kortikal knogle (skalastænger, 100 μm). (I) Kortikal tykkelse opnået fra mikrocomputertomografidata. Data er gennemsnitlige ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ** *p < 0,001 versus WT-mus, Student's t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Score Klinisk tegn
0 Ingen kliniske tegn
0.5 Hale svaghed, forsiden af halen falder
1 Halen helt lammet
2 Mild lammelse af bagben (svaghed i begge bagben eller ensidig lammelse, ukoordineret gang, reaktion på klemning)
3 Fuldstændig lammelse af bagben, bagben trækker og går, bagben, der ikke reagerer på klemme
4 Lammelse af bagbenene og svaghed i forbenene
5 Nær død eller døende

Tabel 1: Klinisk pointsystem.

Antigen Stamme Karakteristisk Ansøgning Begrænsning
PLP SJL/J34 Recidiverende-remitterende EAE Undersøgelse af de cellulære og molekylære hændelser involveret i klinisk tilbagefald Begrænset til T-cellespecifikke reaktioner; At studere specifikke gener og veje i SJL / J-stammen er udfordrende
Mbp SJL/J35 Recidiverende lammelse fulgt hos delvise eller totale modtagere efter genopretning fra akut lammelse Undersøgelse af neuroinflammation og aktivering af immunsystemet Begrænset til T-cellespecifikke reaktioner; At studere specifikke gener og veje i SJL / J-stammen er udfordrende
MOG35-55 C57BL/631 Primær progressiv EAE; Kronisk progressiv EAE Undersøgelse af aksonale skademekanismer; Undersøgelse af molekylære sygdomsmekanismer i transgene og knockout-modeller Undersøgelser af primær demyelinisering og myelinregenerering er af begrænset værdi
Rygmarvshomogenat Biozzi ABH36 Recidiverende-remitterende EAE Undersøgelse af myelin regenerering og neurobeskyttende terapi for MS Ikke klinisk progressiv, med ophobning af neurologiske underskud over tid; Begrænset til CD4 T-cellespecifikke svar
Theilers murine encephalomyelitis virus Flere stammer af mus er meget modtagelige, herunder SJL / J, SWR, PL / J12,31 Virale modeller af inflammatorisk demyelinisering Undersøgelse af axonal skade og inflammationsinduceret demyelinisering Ingen MS-specifikke virusinfektioner er blevet identificeret; Myelin regenerering er vanskelig at vurdere, demyelinering og myelin regenerering forekommer samtidigt
Cuprizone Udbredt i C57BL/6 mus, mens andre stammer, såsom CD1-stammen, er mindre modtagelige for kobber cuprizon-induceret skade37,38 Giftig model for demyelinisering og remyelinering Undersøgelse af T-celler-uafhængig demyelinering, især myelinregenerering og grundlæggende myelinreparationsprocesser Signifikant spontan myelinregenerering opstår efter ophør af toksisk skade; Demyelinering er hjerneregionsspecifik og ikke nyttig til at studere rygmarvsdemyelinisering
Lysolecithin SJL/J12, C57BL/639 osv. Giftig model for demyelinisering og remyelinering Undersøgelse af T-celler-uafhængig demyelinering, især myelinregenerering og grundlæggende myelinreparationsprocesser Manglende immunrespons observeret under MS
Ethidiumbromid C57BL/640 osv. Giftig model for demyelinisering og remyelinering Undersøgelse af fokale demyeliniserende læsioner og forudsigelse af kinetikken af demyelinisering og myelinregenerering Ethidiumbromid beskadiger alle nukleolusholdige celler; Begrænset korrelation med MS

Tabel 2: Forskellige musemodeller af MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MS er en demyeliniserende inflammatorisk sygdom i CNS og er en af de mest almindelige neurologiske lidelser, der forårsager kronisk handicap hos unge, hvilket pålægger familierog samfund en enorm byrde 3,4. MS har altid været klassificeret som en organspecifik T-cellemedieret autoimmun sygdom, der inducerer det autoimmune system til langsomt at erodere CNS, hvilket vil involvere flere systemer i hele kroppen27. Typiske kliniske symptomer omfatter synshandicap, motoriske lidelser, kognitive og følelsesmæssige forstyrrelser osv. 6,7. MS er en ødelæggende sygdom, der gradvist vil forværres, hvis den ikke behandles ordentligt, hvilket fører til alvorlig blindhed og lammelse28. Patogenesen af MS er endnu ikke fuldt ud forstået, da dens kliniske manifestationer og patologiske progression er heterogene, og derfor er dyremodeller afgørende for forskning og udvikling af behandling af MS.

Den hyppigst undersøgte dyremodel for MS er EAE, som hovedsageligt har to modelleringsmetoder: aktiv immunisering og passiv immunisering29. Førstnævnte er bredt vedtaget på grund af dets enkelhed, mangel på musebestråling og kort cyklustid. EAE's aktive immunmodel inducerer autoimmune reaktioner i CNS ved at immunisere gnavere med selvmyelinantigener eller deres efterfølgende peptider, der normalt manifesterer sig som halesvaghed og lammelse af lemmer13. Specifikt er EAE-modellen induceret af MOG 35-55 i C57BL / 6J-mus kendetegnet ved vekslende remission-tilbagefaldscyklusser ledsaget af CNS-betændelse, demyelinering og axonal skade, hvilket gør MOG35-55-induceret EAE til den foretrukne model 11,12. EAE kan induceres godt hos mus, der sensibiliseres ved subkutan injektion af MOG 35-55 peptid, emulgeret med immunpotentiator CFA beriget med MTB og gives en intraperitoneal injektion af PTX med blod-hjerne-barriereforstyrrende virkning på dag0-2 30. Den største udfordring for EAE-modellen er den lave forekomst af svage symptomer, og flere påvirkningsfaktorer er kritiske for eksperimentets forløb. (1) Musens alder og miljø vil påvirke modtageligheden for EAE. Derfor skal mus i samme alder vælges før forsøget. Musene skal vejes og grupperes tilfældigt inden tildeling af bur, og vægten af hver gruppe skal holdes tæt. Sørg også for, at miljøforholdene mellem uafhængige eksperimenter er sammenlignelige. (2) Koncentrationen af PTX: PTX's vigtigste rolle er at øge permeabiliteten af blod-hjerne-barrieren, som gør det muligt for patogene T-celler at komme ind i CNS for at udskille relevante cytokiner og fremme det inflammatoriske respons, hvilket i sidste ende fører til hydrolyse af myelinproteiner indpakket i det ydre lag af nerveaksoner. Sygdomsudbruddet hos EAE-mus blev forsinket med faldende PTX-administrationskoncentration, og sygdommens sværhedsgrad ville blive svækket, hvis PTX faldt med mere end 60%. (3) Opløsning af MOG 35-55 antigen: For at undgå frysning og optøning anbefales det at anskaffe det frysetørrede MOG35-55-antigen i separate pakninger, 4 mg/rør, for at undgå frysning og optøning. PTX bruges også til opløsning i stedet for sterilt vand, fordi det er bedre at emulgere med CFA ved hjælp af PTX. (4) MOG35-55-antigen og CFA skal emulgeres tilstrækkeligt ved hjælp af oscillerende til at danne en vand-i-olie-struktur, og emulsionsdråberne spredes ikke på vandoverfladen i lang tid, hvilket indikerer god emulgering. (5) Topunktsinjektion blev brugt til EAE-modellering af mus. Injektionsstedet er fortrinsvis placeret over taljen og under nakken, tæt på rygsøjlen, for at undgå, at mus slikker og bider huden, hvilket resulterer i spild af MOG35-55 emulsion.

EAE-modellen induceret af MOG35-55-antigenet har dog stadig nogle begrænsninger. Som en inflammatorisk encefalopatimodel af primær axonal skade medieret af CD4 T-celler er hovedlæsionen massiv axonal degeneration med sekundær demyelinisering og mindre primær demyelinisering, som er forskellig fra MS-patologien31,32,33. EAE-modellen induceret af MOG 35-55 afspejler hovedsageligt immunresponset drevet af CD4 T-celler, mens andre immunceller såsom CD8 T- og B-celler ikke har en stærk følelse af deltagelse i denne model31. En anden begrænsende faktor er, at EAE induceret af MOG 35-55 har en vis bias mod den immunologiske komponent i MS-patofysiologi, og andre dyremodeller kan overvejes, når man overvejer undersøgelser med fokus på CNS-patologier, såsom undersøgelsen af demyelinisering og myelinregenereringsprocesser 34,35,36,37,38,39,40, som beskrevet i tabel 2 .

EAE er en effektiv forudsigelse til at efterligne MS's autoimmune egenskaber såvel som dets inflammations- og demyelineringsmekanisme12, hvilket gør mange forskere ivrige efter at studere dets immunmodulerende mekanismer og ignorerer andre kliniske symptomer på MS. Undersøgelser har vist, at MS-associeret angst tilskrives patofysiologiske processer såsom immundysregulering og hjernebetændelse22, 23,41. Psykiske problemer, såsom angst, er særligt almindelige hos mennesker med MS, og angstlidelse kan hindre udførelsen af grundlæggende daglige opgaver og påvirke livskvaliteten betydeligt42,43. Ændringer i EAE-musens bevægelsesevne kan forudsige ændringer i neurale processer. I åbne felteksperimenter forekom angstlignende adfærd hos EAE-mus, herunder et fald i sonderende adfærd, der startede tidligt sygdomsdebut (i det væsentlige forsøgspersoner med kliniske score <0,5 og lokomotorisk evne næsten lige så god som normale mus), hvilket tyder på, at begyndelsen af angstlignende adfærd går forud for motorisk svækkelse. Derudover forbedrede EAE-mus i remissionsperioden ikke angstlignende adfærd med øget motorisk evne. Fremkomsten af det inflammatoriske respons kan være ansvarlig for den mentale svækkelse hos EAE-mus gennem neuronal aktivitet, hvilket fører til ændringer i humør, og opregulering af inflammatoriske cytokinniveauer forstyrrer striatal synaptisk funktion før begyndelsen af motorisk svækkelse23,41. Den åbne felttest kræver dog opmærksomhed på, at testrummet skal være et stille område, og testmusene skal akklimatisere sig til rummet i 1 time på forhånd for at undgå for stort pres forårsaget af det nye miljø. Yderligere rengøring med ethanol er påkrævet mellem test for at fjerne lugt og andre stoffer efterladt af den sidste testperson. Hovedbegrænsningen af den åbne felttest er interferensen forårsaget af motorisk dysfunktion hos EAE-mus, og testen til evaluering af gnaverangstlignende adfærd er baseret på afstanden, tiden og rækkevidden af gnaveraktivitet i reaktionskammeret og kan ikke udelukke effekten af motorisk dysfunktion på angstlignende adfærd. Derfor skal fremtidige undersøgelser tage hensyn til bevægelseshæmning.

Traditionelle metoder til analyse af knoglevævsrelaterede undersøgelser bruger ofte todimensionel knoglesektionsmikroskopi, som kan have større vanskeligheder med at analysere strukturel morfologi, densitetsfordeling, orienteringsfordeling og andre egenskaber på grund af indflydelsen af todimensionale planer og inhomogenitet af biologiske prøver. Mange undersøgelser har bekræftet nøjagtigheden og effektiviteten af Micro-CT-systemet til at beskrive knoglemorfologi, og mange undersøgelser 44,45,46 har bekræftet mikrostrukturdetektionsresultater. Den tredimensionelle billeddannelse af knoglevæv af Micro-CT giver mulighed for mere intuitive og nøjagtige knoglehistomorphometryresultater. Det er opnået at scanne små dyr og prøver uden at udføre dyret eller beskadige vævsprøven, hvilket giver mulighed for detaljeret tredimensionel rumlig strukturinformation inde i vævet44. Undersøgelser har vist, at MS-patienter er tilbøjelige til knoglemassetab og osteoporose24,25; Ved at scanne og billeddanne lårbenet af EAE-mus med et Micro-CT-system kunne en tydelig forringelse af knoglemikroarkitekturen og nedsat knoglestyrke observeres i lårbenet hos EAE-mus sammenlignet med WT-mus, der havde udviklet osteoporose. Micro-CT-analyse er relativt enkel at udføre og relativt billig, og Micro-CT live imaging kan bruges til at overvåge knoglesundhed i fremtiden, når behandling administreres til EAE-mus. Ulempen er imidlertid fraværet af knogleomsætningsmarkører vurderet gennem blodprøver eller knoglehistomorphometry for at observere grundlæggende ændringer i knoglemetabolisk homeostase hos EAE-mus47. Regulering af osteoblaster og osteoklaster kan overvejes inden for undersøgelsen i fremtiden.

MS er en multi-symptom sygdom, og det eneste formål med sygdomshåndtering er at minimere sygdomssymptomer. I ovennævnte protokol kan de kliniske symptomer på MS simuleres ved at konstruere MOG35-55-induceret EAE-model . EAE-mus viste kliniske symptomer på motorisk dysfunktion og angstlignende adfærd og osteoporose. 5-punkts scoringssystemet, åben felttest og mikro-CT-analyse beskrevet i denne protokol kan overvåge de patologiske symptomer hos EAE-mus fra flere perspektiver og give et referenceskema til behandling af EAE. I mangel af effektive sygdomsmodificerende lægemidler kan en potentiel kombination af synergistisk terapi give den bedste mulighed for at lindre symptomer og forbedre funktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtten fra National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) og State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
  2. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
  5. O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
  6. Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
  7. Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
  8. Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
  9. Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
  10. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
  11. Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
  12. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
  13. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  14. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
  15. Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
  16. Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
  17. Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
  18. McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
  19. Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
  20. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  21. Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
  22. Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
  23. Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
  24. Hearn, A. P., Silber, E. Osteoporosis in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. 16, 1031-1043 (2010).
  25. Gibson, J. C., Summers, G. D. Bone health in multiple sclerosis. Osteoporosis International. 22, 2935-2949 (2011).
  26. Ye, S., Wu, R., Wu, J. Multiple sclerosis and fracture. The International Journal of Neuroscience. 123, 609-616 (2013).
  27. Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
  28. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  29. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Current Protocols. 1 (6), 185 (2021).
  30. Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
  31. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
  32. Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
  33. Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
  34. McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
  35. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  36. Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
  37. Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
  38. Yu, Q., et al. Strain differences in cuprizone induced demyelination. Cell & Bioscience. 7, 59 (2017).
  39. Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
  40. Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
  41. Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
  42. Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
  43. Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
  44. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  45. Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
  46. Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
  47. Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).

Tags

Biologi udgave 187 multipel sklerose eksperimentel autoimmun encephalomyelitis myelin oligodendrocytglycoprotein neuroinflammation angstlignende adfærd osteoporose
Induktion og forskellige vurderingsindikatorer for eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie,… More

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter