Summary
Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.
Abstract
La sclerosi multipla (SM) è una tipica malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e danno assonale. Attualmente, non ci sono misure per curare completamente la SM, ma sono disponibili più terapie modificanti la malattia (DMT) per controllare e mitigare la progressione della malattia. Esistono somiglianze significative tra le caratteristiche patologiche del SNC dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e dei pazienti con SM. L'EAE è stato ampiamente utilizzato come modello rappresentativo per determinare l'efficacia dei farmaci per la SM ed esplorare lo sviluppo di nuove terapie per la malattia della SM. L'induzione attiva di EAE nei topi ha un effetto stabile e riproducibile ed è particolarmente indicata per studiare gli effetti di farmaci o geni sulla neuroinfiammazione autoimmune. Il metodo di immunizzazione dei topi C57BL/6J con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la valutazione giornaliera dei sintomi della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico è principalmente condiviso. Data la complessa eziologia della SM con diverse manifestazioni cliniche, il sistema di punteggio clinico esistente non può soddisfare la valutazione del trattamento della malattia. Per evitare le carenze di un singolo intervento, vengono creati nuovi indicatori per valutare l'EAE sulla base delle manifestazioni cliniche di stati d'animo ansiosi e osteoporosi nei pazienti con SM per fornire una valutazione più completa del trattamento della SM.
Introduction
Le malattie autoimmuni sono uno spettro di disturbi causati dalla risposta immunitaria del sistema immunitario ai propri antigeni con conseguente danno o disfunzione tissutale1. La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica della polineuropatia nel sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e degenerazione assonale neuronale 2,3. Attualmente, la SM ha colpito ben 2,5 milioni di persone in tutto il mondo, per lo più giovani e persone di mezza età di età compresa tra 20 e 40 anni, che sono spesso la spina dorsale delle loro famiglie e della società. Ciò ha causato notevoli ripercussioni e danni alle famiglie e alla società 2,4.
La SM è una malattia multifattoriale con manifestazioni cliniche diverse e complesse. Oltre ai classici disturbi neurologici caratterizzati da infiltrazione infiammatoria e demielinizzazione, la SM mostra spesso deficit visivo, discinesia degli arti e disturbi cognitivi ed emotivi 5,6,7. Se i pazienti con SM non ricevono il trattamento adeguato e corretto, metà di loro vivrà in sedia a rotelle dopo 20 anni e quasi la metà di loro sperimenterà sintomi depressivi e ansiosi, portando a livelli molto più elevati di ideazione suicidaria rispetto alla popolazione generale 8,9.
Nonostante un lungo periodo di ricerca, l'eziologia della SM rimane elusiva e la patogenesi della SM non è stata ancora chiarita. I modelli animali di SM hanno permesso di servire come strumenti di test per esplorare lo sviluppo della malattia e nuovi approcci terapeutici, nonostante le differenze significative tra il sistema immunitario dei roditori e quello umano, condividendo allo stesso tempo alcuni principi di base. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è attualmente il modello animale ideale per lo studio della SM, che utilizza l'immunità autoantigenica dalle proteine della mielina per indurre l'autoimmunità ai componenti del SNC nei topi sensibili, con l'aggiunta di adiuvante completo di Freund (CFA) e tossina della pertosse (PTX) per migliorare la risposta immunitaria umorale. A seconda del background genetico e degli antigeni immunitari, si ottengono diversi processi patologici, tra cui acuto, recidivante-remittente o cronico, per imitare varie forme cliniche di SM10,11,12. Gli immunogeni rilevanti comunemente usati nella costruzione di modelli EAE provengono da proteine del SNC, come la proteina basica della mielina (MBP), la proteina proteolipidica (PLP) o la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG). I topi SJL/L immunizzati con MBP o PLP sviluppano un decorso recidivante-remittente e la MOG innesca EAE cronica progressiva nei topi C57BL/611,12,13.
Lo scopo principale della terapia modificante la malattia (DMT) è ridurre al minimo i sintomi della malattia e migliorare la funzione6. Diversi farmaci sono usati clinicamente per alleviare la SM, ma nessun farmaco è stato ancora usato per curarla completamente, rivelando la necessità di un trattamento sinergico. I topi C57BL / 6 sono attualmente i più comunemente usati per costruire topi transgenici e, in questo lavoro, è stato utilizzato un modello EAE indotto da MOG35-55 in topi C57BL / 6J con una scala a 5 punti per monitorare la progressione della malattia. I modelli EAE soffrono anche di stati d'animo ansiosi e perdita ossea e lesioni demielinizzanti ampiamente note. Qui viene descritto anche il metodo per valutare i sintomi dell'EAE da più prospettive utilizzando test in campo aperto e analisi di tomografia micro-computerizzata (Micro-CT).
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Protocol
Il Comitato per la cura degli animali dell'Università di Tongji ha approvato il presente lavoro e sono state seguite tutte le linee guida per la cura degli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J tra 8-12 settimane di età. È stato assicurato che l'età e il sesso fossero gli stessi nei gruppi sperimentali; Altrimenti, la suscettibilità alla malattia è stata influenzata. I topi sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni con cicli alternati di luce e buio di 12 ore in condizioni costanti (temperatura ambiente 23 ± 1 °C, umidità 50% ± 10%), con libero accesso al cibo e all'acqua per topi.
1. Preparazione dell'emulsione MOG35-55
- Aggiungere il Mycobacterium tuberculosis liofilizzato inattivato termicamente (MTB, H37Ra) per completare l'adiuvante di Freund (a sua volta contenente 1 mg/ml di MTB inattivata dal calore, H37Ra), ottenendo una concentrazione finale di MTB di 5 mg/ml (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: L'intera operazione deve essere completata nell'armadio di biosicurezza; Non aprire l'aria che soffia. - Sciogliere il peptide MOG35-55 liofilizzato (vedere Tabella dei materiali) con soluzione salina tamponata fosfato sterile pre-raffreddata (PBS) (senza ioni calcio e magnesio, pH 7,4) per preparare la soluzione di antigene alla concentrazione di 2 mg/ml.
- Prendere un tubo di microcentrifuga pulito da 2 mL e aggiungere una sfera di acciaio sterilizzata da 5 mm (vedi Tabella dei materiali) a ciascun tubo.
- Aggiungere 500 μL di adiuvante completo di Freund contenente 5 mg/ml di MTB e 500 μL di soluzione di antigene MOG35-55 alla provetta di microcentrifuga sopra riportata contenente una sfera di acciaio.
- Oscillare il tubo sopra su un TissueLyser (vedi Tabella dei materiali) per 10 minuti, raffreddare sul ghiaccio per 10 minuti e ripetere quattro volte per mescolare bene e infine formare una soluzione viscosa bianca.
NOTA: Una buona emulsione è un passo fondamentale nella preparazione dell'emulsione MOG35-55 , quindi è necessaria una miscelazione accurata. Il TissueLyser è impostato su una velocità di 28 Hz.
2. Preparazione della tossina della pertosse (PTX)
- Preparare PTX con ddH2O in una concentrazione di 100 μg/mL e conservare a 4 °C.
- Diluire la soluzione madre di PTX 50 volte con 1x PBS sterile (senza ioni calcio e magnesio, pH 7,4) per ottenere una soluzione da 200 ng/100 μL per l'uso.
3. Definizione del modello animale EAE
- Costruisci il modello EAE usando i topi C57BL/6J maschi o femmine di 8-12 settimane. Assicurarsi che i topi siano adeguatamente acclimatati all'ambiente di alimentazione prima dell'immunizzazione.
- Centrifugare l'emulsione MOG35-55 preparata (fase 1) a 4 °C per 2-3 s premendo il pulsante Pulse dell'apparecchiatura (vedere Tabella dei materiali) per precipitare tutte le emulsioni sul fondo del tubo.
NOTA: L'emulsione MOG35-55 può essere conservata a -20 °C per diversi giorni. Per evitare il fallimento del farmaco, si consiglia di usarlo il prima possibile. - Collegare un ago da 22 G a un cilindro di siringa da 1 ml, aspirare l'emulsione MOG 35-55 e trasferire l'emulsione MOG35-55 in un nuovo cilindro di siringa da 1 ml. Fissare il collegamento tra il cilindro della siringa da 1 mL e un ago da 26 G con pellicola sigillante (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Evitare bolle d'aria durante il caricamento dell'emulsione MOG35-55 in barili di siringa da 1 ml. - Pulire e disinfettare il sito di iniezione con etanolo al 70%.
- Iniettare l'emulsione MOG35-55 per via sottocutanea su ciascun lato della spina dorsale dei topi, 100 μL su ciascun lato. Osservare la formazione automatica di masse bulbose sotto la pelle del dorso dei topi dopo il completamento dell'operazione di iniezione.
NOTA: Assicurarsi che gli sperimentatori esperti eseguano il processo di immunizzazione e che l'iniezione venga eseguita delicatamente e lentamente per ridurre al minimo la pressione sui topi. - Iniettare i topi di cui sopra per via intraperitoneale con 100 μL di PTX (fase 2).
NOTA: Il giorno dell'immunizzazione è il giorno 0. Inoltre, assicurarsi che i topi possano essere identificati con precisione per la successiva valutazione giornaliera, ad esempio utilizzando un marcatore colorato sulla coda dei topi. - Iniettare la stessa dose di PTX il giorno 2 dopo l'immunizzazione.
- Preparare un gruppo di topi non immunizzati come topi wild-type (WT).
4. Monitoraggio clinico dei topi
- Registra quotidianamente il peso corporeo dei topi EAE e WT.
NOTA: La gravità dell'EAE è positivamente correlata alla perdita di peso dei topi, quindi anche il peso corporeo è un indice di monitoraggio molto importante. - Monitorare lo stato dei topi da 0 a 21 giorni dopo l'immunizzazione utilizzando il sistema di punteggio 0-5 elencato nella Tabella 1.
NOTA: i sintomi intermedi vengono conteggiati come più o meno 0,5 punti.
5. Test in campo aperto
NOTA: Gli animali da esperimento selezionati per questa fase sono topi EAE nei periodi di esordio precoce, picco e remissione. Inoltre, i topi WT sono stati utilizzati come controllo. Va notato che tutti i topi sono stati testati per il comportamento simile all'ansia prima della modellazione per escludere i topi con disturbi d'ansia per la modellazione EAE. Inoltre, i topi EAE nei periodi di picco e di remissione con incapacità motoria completa sono stati esclusi dal test.
- Preparare una camera di reazione in campo aperto da 40 × 40 × 40 cm3 e un sistema di analisi video dell'attività di locomozione (campo aperto) (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: la telecamera è installata in una posizione che copre completamente la scatola, la sala di reazione è illuminata uniformemente e la sala prove deve essere un'area silenziosa. - Posizionare i topi di prova nella stanza di prova per l'assuefazione 1 ora prima di iniziare l'esperimento.
- Spruzzare l'intera area con etanolo al 70% e pulire con un tovagliolo di carta pulito per assicurarsi che la camera di reazione sia pulita prima di iniziare il test.
- Rimuovi ogni topo individualmente dalla sua gabbia e posizionalo nello stesso angolo dell'arena prima di iniziare a esplorare.
NOTA: Il fondo della scatola è diviso in 16 griglie, di cui l'area centrale delle quattro griglie è l'area centrale e l'area circostante è l'area periferica. - Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione nella barra dei menu del sistema di analisi video, registrare il tempo e iniziare le riprese.
- Stai zitto nella sala prove.
- Lascia che il mouse si muova liberamente per 5 minuti durante il processo di registrazione.
- Arrestare il sistema di acquisizione e salvare il video.
- Porta il mouse fuori dall'arena, rimettilo nella gabbia e procedi al mouse successivo.
NOTA: Pulire l'area di prova con etanolo al 70% tra una corsa e l'altra per rimuovere odori e altre sostanze. - Analizza i risultati utilizzando il sistema di analisi video.
6. Analisi del fenotipo osseo
- Eutanasia i topi EAE e WT per lussazione cervicale il 21 ° giorno.
NOTA: Il personale che esegue operazioni di dislocazione cervicale deve essere ben addestrato per ridurre al minimo il dolore sopportato durante la morte dell'animale. - Fai sdraiare il mouse in un vassoio da dissezione e fissa le estremità.
- Tenere la pelle dell'arto posteriore del topo con una pinza e aprire la pelle del topo e il tessuto muscolare con le forbici.
- Separare accuratamente il femore dalla tibia e dall'osso dell'anca con le forbici.
- Rimuovere il muscolo aderente al femore con le forbici e posizionare il femore in etanolo al 70% a temperatura ambiente.
- Scansione del femore distale utilizzando un sistema micro-CT (vedi Tabella dei materiali) con una dimensione isotropa del voxel di 10 μm, con una tensione del tubo a raggi X di picco di 70 kV e un'intensità di raggi X di 0,114 mA.
NOTA: un filtro gaussiano 3D consente il denoising di immagini di soglia 2D. - Analizzare le 100 fette scansionate dall'albero femorale medio per misurare i parametri del femore, tra cui volume osseo, volume tissutale, densità minerale ossea, separazione trabecolare, numero trabecolare, densità di connessione trabecolare e spessore trabecolare e corticale.
NOTA: A partire dall'estremità prossimale della piastra di crescita distale del femore nei topi, sono state trovate sezioni completamente prive di strutture epifisarie del cappuccio e hanno continuato ad estendere 100 fette verso il femore prossimale, che sono state delineate manualmente i contorni a diversi voxel lontano dalla superficie corticale interna per identificare le trabecole epifisarie. - Crea le ricostruzioni 3D impilando immagini 2D di soglia dalle regioni di contorno nel sistema micro-CT.
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Representative Results
Dopo l'immunizzazione dei topi, il peso corporeo dei topi viene registrato quotidianamente e i loro sintomi clinici vengono valutati secondo il protocollo sopra descritto (fase 4). Nei topi C57BL/6J immunizzati con peptide MOG, poiché la posizione della lesione è principalmente limitata al midollo spinale, la patogenesi dei topi EAE si diffonde dalla coda alla testa. All'inizio della malattia, i topi EAE mostrano debolezza e abbassamento della coda, seguiti da debolezza degli arti posteriori, movimento scoordinato e paralisi. Man mano che la malattia peggiora, si sviluppa gradualmente nella debolezza degli arti anteriori, nella paralisi e, nei casi più gravi, causa difficoltà nel muovere i topi e persino vicino alla morte. Come mostrato nella Figura 1A, il diagramma di stato dei topi con diversi gradi di patologia EAE raffigura un quadro esemplare di un gruppo di topi che passa da sintomi EAE asintomatici a sintomi EAE ad alto punteggio (punteggio 4). È stato anche menzionato in precedenza che il peso corporeo dei topi EAE è correlato ai sintomi clinici. Rispetto ai topi WT, la perdita di peso nei topi EAE può iniziare a verificarsi nei primi giorni dopo l'immunizzazione, mentre i sintomi clinici dei topi EAE di solito iniziano il giorno 6-9 dopo l'immunizzazione e raggiungeranno un picco il giorno 14-16. Dopo questo, i sintomi dei topi EAE generalmente recuperano parzialmente e, allo stesso tempo, la perdita di peso dei topi sarà alleviata (Figura 1B, C). Pertanto, il decorso dell'insorgenza dell'EAE è solitamente suddiviso in periodi di esordio precoce, picco e remissione, e la previsione di questi punti temporali è importante per valutare i parametri di esito. In generale, per analizzare la produzione di cellule immunitarie e citochine nel sito delle lesioni EAE, le cellule immunitarie nel cervello e nel midollo spinale dei topi EAE al picco della malattia possono essere isolate e ulteriormente elaborate, che possono essere analizzate mediante citometria a flusso14,15. Il tessuto del midollo spinale al picco di insorgenza è anche più adatto per preparare la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) e la colorazione blu veloce Luxol per indagare ulteriormente l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e la demielinizzazione del midollo spinale14,16. Per monitorare i cambiamenti nel sistema immunitario in diversi momenti di insorgenza di EAE, milza e linfonodi a esordio precoce sono anche opzioni essenziali17,18. Inoltre, le cellule della milza o dei linfonodi dei topi EAE immunizzati MOG sono comunemente utilizzate per costruire modelli di trasferimento, che vengono trasferiti ai topi riceventi dopo la restimolazione di MOG in vitro per indurre l'immunizzazione passiva dei topi EAE18.
La SM è una lesione demielinizzante autoimmune indotta da infiammatori del sistema nervoso centrale caratterizzata da demielinizzazione infiammatoria e perdita neuronale 2,3. Questa malattia è solitamente accompagnata da comorbidità psichiatriche, come i disturbi affettivi, di cui il disturbo d'ansia è molto comune nei pazienti con SM, con fino al 30% dei pazienti con SM che soffrono di ansia 9,19. Il disturbo d'ansia è un'anomalia psichiatrica caratterizzata da eccessivo stress emotivo e preoccupazione. Il test in campo aperto viene spesso utilizzato per analizzare i comportamenti per l'ansia nei roditori20,21. Con l'aiuto dell'analisi dei comportamenti di esplorazione dei topi EAE nei test in campo aperto durante i periodi di esordio precoce, picco e remissione, è stato scoperto che i topi EAE avevano anche comportamenti ansiosi simili a quelli dei pazienti con SM (Figura 2A). Nel test in campo aperto, i roditori ansiosi tendono ad avere un'attività ridotta e un aumento del comportamento stereotipato, tra cui una preferenza per essere più vicini agli angoli, un pregiudizio verso il dominio periferico e una mancanza di desiderio di esplorare l'area centrale. Rispetto ai topi WT, i topi EAE avevano una distanza a piedi e un tempo di movimento significativamente inferiori in tutti e tre i periodi della malattia, anche nell'esordio precoce della malattia quando i topi EAE non avevano ancora una compromissione motoria (Figura 2B, C). Inoltre, i topi EAE passano significativamente meno distanza e rimangono nell'area centrale meno dei topi normali, e si muovono anche solo nell'area periferica, mostrando un evidente stato d'animo ansioso (Figura 2D, E). I topi EAE mostrano ancora un forte stato d'animo ansioso quando l'esordio è lieve, cioè la coordinazione motoria. Alcuni studi suggeriscono che questo può essere attribuito a lieve neuroinfiammazione, che colpisce ulteriormente la secrezione di neurotrasmettitore22,23. I test sul campo aperto che monitorano i trigger dell'umore ansiosi nei topi EAE potrebbero aiutare i ricercatori a comprendere e trattare le comorbidità psichiatriche della SM.
Con il progredire della malattia, la SM si manifesta essenzialmente come discinesia. Gli studi hanno scoperto che i pazienti con SM hanno una maggiore suscettibilità all'osteoporosi e alle fratture, principalmente a causa della perdita di massa ossea, e che la gravità della discinesia è fortemente correlata con la densità ossea del paziente24,25. Un fenomeno simile può essere osservato dall'analisi Micro-CT con l'aiuto del modello animale EAE (Figura 3A,H). Dai dati di analisi trabecolare del femore nei topi, i topi EAE hanno subito una significativa diminuzione della densità minerale ossea (BMD) rispetto ai topi WT, che è un importante indicatore della risposta alla resistenza ossea e una base importante per la diagnosi di osteoporosi (Figura 3B). Ulteriori analisi hanno mostrato che la perdita ossea trabecolare si è verificata in modo significativo nei topi EAE rispetto ai topi WT sani ed è stata accompagnata da una riduzione della densità di connessione trabecolare, del numero di trabecolari e dello spessore trabecolare. Queste sono tutte caratteristiche della ridotta massa ossea, suggerendo che EAE causa anche la perdita ossea trabecolare nel femore dei topi (Figura 3C-F). Allo stesso tempo, la morfologia strutturale delle trabecole ossee è cambiata e la spaziatura delle trabecole è aumentata in modo significativo; maggiore è la spaziatura, più osteoporotico è l'osso (Figura 3G). Ciò è coerente con l'idea che i pazienti con SM siano inclini all'osteoporosi. Nelle ossa corticali della diafisi del femore, lo spessore dell'osso corticale nel modello EAE era significativamente inferiore a quello dei topi normali (Figura 3I). Nella SM, la diminuzione della motilità e l'aumento della distrofia muscolare sono fortemente associati all'osteoporosi, alla frattura e all'aumento del riassorbimento osseo a causa delle ridotte forze meccaniche, diminuendo gradualmente l'integrità ossea, aumentando così il rischio di osteoporosi e frattura26. L'analisi micro-CT del femore nei topi EAE può monitorare bene la salute delle ossa e l'intervento è utile nel controllare la condizione di EAE.
Figura 1: Monitoraggio dei sintomi clinici dell'EAE. (A) Il quadro esemplare dei topi con diversi gradi di patologia EAE. (B) Variazione di peso nei topi WT e EAE. (C) Punteggio clinico nei topi WT e EAE. I dati sono forniti come media ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 rispetto ai topi WT, test ANOVA a due vie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Comportamento ansioso dei topi EAE nel test in campo aperto. (A) Grafici rappresentativi della prova in campo aperto. Distanza di viaggio (B), durata dell'attività (C), distanza di viaggio nel centro (D) e tempo trascorso nel centro (E) di topi WT e topi EAE nei periodi di esordio precoce, picco e remissione. I dati sono medi ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto ai topi WT, test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi micro-CT della salute ossea nei topi EAE. (A) Immagini 3D rappresentative dell'architettura trabecolare femorale (barre di scala, 100 μm). La densità minerale ossea (B), il rapporto volume osseo/volume tissutale (C), la densità di connessione (D), i numeri (E), lo spessore (F) e la separazione (G) del trabecolare femorale sono stati determinati mediante analisi Micro-CT. (H) Immagini 3D rappresentative dell'osso corticale (barre di scala, 100 μm). (I) Spessore corticale ottenuto da dati di tomografia microcomputerizzata. I dati sono medi ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto ai topi WT, test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Punteggio | Segno clinico | ||
| 0 | Nessun segno clinico | ||
| 0.5 | Debolezza della coda, caduta della parte anteriore della coda | ||
| 1 | Coda completamente paralizzata | ||
| 2 | Lieve paralisi degli arti posteriori (debolezza di entrambi gli arti posteriori o paralisi unilaterale, camminata scoordinata, risposta al pizzico) | ||
| 3 | Paralisi completa degli arti posteriori, arti posteriori che trascinano e camminano, arti posteriori che non rispondono al pizzicamento | ||
| 4 | Paralisi degli arti posteriori e debolezza degli arti anteriori | ||
| 5 | Vicino alla morte o morire | ||
Tabella 1: Sistema di punteggio clinico.
| Antigene | Sforzo | Caratteristico | Applicazione | Limitazione | ||
| PLP | SJL/J34 | EAE recidivante-remittente | Studio degli eventi cellulari e molecolari coinvolti nella recidiva clinica | Limitato alle risposte specifiche delle cellule T; Lo studio di geni e percorsi specifici nel ceppo SJL/J è impegnativo | ||
| MBP · | SJL/J35 | Paralisi recidivante seguita in riceventi parziali o totali dopo il recupero dalla paralisi acuta | Studio della neuroinfiammazione e dell'attivazione del sistema immunitario | Limitato alle risposte specifiche delle cellule T; Lo studio di geni e percorsi specifici nel ceppo SJL/J è impegnativo | ||
| MOG35-55 | C57BL/631 | EAE primarie progressive; EAE cronica progressiva | Studio dei meccanismi di danno assonale; Studio dei meccanismi molecolari delle malattie in modelli transgenici e knockout | Gli studi di demielinizzazione primaria e di rigenerazione della mielina sono di valore limitato | ||
| Omogenato del midollo spinale | Biozzi ABH36 | EAE recidivante-remittente | Studio della rigenerazione della mielina e della terapia neuroprotettiva per la SM | Non clinicamente progressivo, con accumulo di deficit neurologici nel tempo; Limitato alle risposte specifiche delle cellule T CD4 | ||
| Virus dell'encefalomielite murina di Theiler | Ceppi multipli di topi sono altamente sensibili, tra cui SJL/J, SWR, PL/J12,31 | Modelli virali di demielinizzazione infiammatoria | Studio del danno assonale e della demielinizzazione indotta da infiammazione | Non sono state identificate infezioni virali specifiche per la SM; La rigenerazione della mielina è difficile da valutare, la demielinizzazione e la rigenerazione della mielina avvengono simultaneamente | ||
| Cuprizone | Ampiamente usato nei topi C57BL/6, mentre altri ceppi, come il ceppo CD1, sono meno suscettibili ai danni indotti dalla cuprizone di rame37,38 | Modello tossico di demielinizzazione e rimielinizzazione | Studio della demielinizzazione indipendente dalle cellule T, in particolare della rigenerazione della mielina e dei processi di riparazione della mielina di base | Una significativa rigenerazione spontanea della mielina si verifica dopo la cessazione del danno tossico; La demielinizzazione è specifica della regione del cervello e non è utile per studiare la demielinizzazione del midollo spinale | ||
| Lisolecitina | SJL/J12, C57BL/639, ecc. | Modello tossico di demielinizzazione e rimielinizzazione | Studio della demielinizzazione indipendente dalle cellule T, in particolare della rigenerazione della mielina e dei processi di riparazione della mielina di base | Mancanza di risposta immunitaria osservata durante la SM | ||
| Bromuro di etidio | C57BL/640, ecc. | Modello tossico di demielinizzazione e rimielinizzazione | Studio delle lesioni demielinizzanti focali e predizione della cinetica della demielinizzazione e della rigenerazione della mielina | Il bromuro di etidio danneggia tutte le cellule contenenti nucleolo; Correlazione limitata con la SM | ||
Tabella 2: Diversi modelli murini di SM.
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Discussion
La SM è una malattia infiammatoria demielinizzante del SNC ed è uno dei disturbi neurologici più comuni che causano disabilità cronica nei giovani, imponendo un enorme onere alle famiglie e alla società 3,4. La SM è sempre stata classificata come una malattia autoimmune mediata dalle cellule T organo-specifiche, inducendo il sistema autoimmune a erodere lentamente il SNC, che coinvolgerà più sistemi in tutto il corpo27. I sintomi clinici tipici includono deficit visivo, disturbi motori, disturbi cognitivi ed emotivi, ecc 6,7. La SM è una malattia devastante che peggiorerà progressivamente se non adeguatamente trattata, portando a grave cecità e paralisi28. La patogenesi della SM non è ancora completamente compresa, poiché le sue manifestazioni cliniche e la progressione patologica sono eterogenee, e quindi i modelli animali sono essenziali per la ricerca e lo sviluppo del trattamento della SM.
Il modello animale più frequentemente studiato per la SM è EAE, che ha principalmente due metodi di modellazione: immunizzazione attiva e immunizzazione passiva29. Il primo è ampiamente adottato per la sua semplicità, la mancanza di irradiazione del topo e il breve tempo di ciclo. Il modello immunitario attivo EAE induce risposte autoimmuni nel SNC immunizzando i roditori con antigeni auto-mielinici o i loro peptidi successivi, che di solito si manifestano come debolezza della coda e paralisi degli arti13. In particolare, il modello EAE indotto da MOG 35-55 nei topi C57BL/6J è caratterizzato da cicli alternati di remissione-recidiva, accompagnati da infiammazione del SNC, demielinizzazione e danno assonale, che rende l'EAE indotto da MOG35-55 il modello preferito11,12. L'EAE può essere ben indotta nei topi sensibilizzati mediante iniezione sottocutanea di peptide MOG 35-55, emulsionata con immunopotenziatore CFA arricchito con MTB e somministrata un'iniezione intraperitoneale di PTX con effetto di interferenza della barriera emato-encefalica nei giorni 0-2 30. La più grande sfida per il modello EAE è la bassa incidenza di sintomi deboli e diversi fattori di influenza sono fondamentali per il corso dell'esperimento. (1) L'età e l'ambiente dei topi influenzeranno la suscettibilità alle EAE. Pertanto, i topi della stessa età devono essere selezionati prima dell'esperimento. I topi devono essere ponderati e raggruppati casualmente prima dell'assegnazione della gabbia e il peso di ciascun gruppo deve essere tenuto vicino. Inoltre, assicurarsi che le condizioni ambientali tra esperimenti indipendenti siano comparabili. (2) La concentrazione di PTX: Il ruolo principale del PTX è quello di aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, che consente alle cellule T patogene di entrare nel SNC per secernere citochine rilevanti e promuovere la risposta infiammatoria, portando infine all'idrolisi delle proteine della mielina avvolte nello strato esterno degli assoni nervosi. L'insorgenza della malattia nei topi EAE è stata ritardata con la diminuzione della concentrazione di somministrazione di PTX e la gravità della malattia sarebbe indebolita se il PTX diminuisse di oltre il 60%. (3) La dissoluzione dell'antigene MOG 35-55: Per evitare il congelamento e lo scongelamento, si raccomanda di procurarsi l'antigene MOG35-55 liofilizzato in confezioni separate, 4 mg/tubo, per evitare il congelamento e lo scongelamento. Inoltre, PTX viene utilizzato per la dissoluzione al posto dell'acqua sterile perché è meglio emulsionare con CFA usando PTX. (4) L'antigene MOG35-55 e il CFA devono essere sufficientemente emulsionati oscillando per formare una struttura acqua-in-olio e le goccioline di emulsione non si disperdono sulla superficie dell'acqua per lungo tempo, indicando una buona emulsione. (5) L'iniezione a due punti è stata utilizzata per la modellazione dell'EAE del topo. Il sito di iniezione si trova preferibilmente sopra la vita e sotto il collo, vicino alla colonna vertebrale, per evitare che i topi lecchino e mordano la pelle, con conseguente fuoriuscita di emulsione MOG35-55.
Tuttavia, il modello EAE indotto dall'antigene MOG35-55 presenta ancora alcune limitazioni. Come modello di encefalopatia infiammatoria di danno assonale primario mediato da cellule T CD4, la lesione principale è la degenerazione assonale massiva con demielinizzazione secondaria e meno demielinizzazione primaria, che è diversa dalla patologia SM31,32,33. Il modello EAE indotto da MOG35-55 riflette principalmente la risposta immunitaria guidata dalle cellule T CD4, mentre altre cellule immunitarie come le cellule T e B CD8 non hanno un forte senso di partecipazione a questo modello31. Un altro fattore limitante è che l'EAE indotta da MOG35-55 ha una certa propensione verso la componente immunologica della fisiopatologia della SM, e altri modelli animali possono essere considerati quando si considerano studi incentrati sulle patologie del SNC, come lo studio della demielinizzazione e dei processi di rigenerazione della mielina 34,35,36,37,38,39,40, come descritto nella Tabella 2 .
EAE è un predittore efficace nell'imitare le proprietà autoimmuni della SM, così come il suo meccanismo di infiammazione e demielinizzazione12, che rende molti studiosi desiderosi di studiare i suoi meccanismi immunomodulatori, ignorando altri sintomi clinici della SM. Gli studi hanno dimostrato che l'ansia associata alla SM è attribuita a processi fisiopatologici come la disregolazione immunitaria e l'infiammazione cerebrale22, 23,41. I problemi di salute mentale, come l'ansia, sono particolarmente comuni nelle persone con SM e il disturbo d'ansia può impedire lo svolgimento delle attività quotidiane di base e influire significativamente sulla qualità della vita42,43. Alterazioni nella capacità locomotoria dei topi EAE possono predire alterazioni nei processi neurali. Negli esperimenti in campo aperto, si sono verificati comportamenti ansiosi nei topi EAE, inclusa una diminuzione dei comportamenti esplorativi che hanno iniziato l'insorgenza precoce della malattia (essenzialmente, soggetti di test con punteggi clinici <0,5 e capacità locomotoria quasi pari a quella dei topi normali), suggerendo che l'insorgenza di comportamenti ansiosi precede la compromissione motoria. Inoltre, i topi EAE nel periodo di remissione non hanno migliorato il comportamento ansioso con una maggiore capacità motoria. L'emergere della risposta infiammatoria può essere responsabile della compromissione mentale nei topi EAE attraverso l'attività neuronale, portando a cambiamenti di umore, e la sovraregolazione dei livelli di citochine infiammatorie interferisce con la funzione sinaptica striatale prima dell'insorgenza della compromissione motoria23,41. Tuttavia, il test in campo aperto richiede attenzione al fatto che la sala di prova deve essere un'area tranquilla e i topi di prova devono acclimatarsi alla stanza per 1 ora in anticipo per evitare un'eccessiva pressione causata dal nuovo ambiente. È necessaria un'ulteriore pulizia con etanolo tra i test per rimuovere gli odori e altre sostanze lasciate dall'ultimo soggetto del test. La principale limitazione del test in campo aperto è l'interferenza causata dalla disfunzione motoria nei topi EAE e il test per valutare il comportamento ansioso dei roditori si basa sulla distanza, il tempo e la gamma di attività dei roditori nella camera di reazione e non può escludere l'effetto della disfunzione motoria sul comportamento ansioso. Pertanto, gli studi futuri devono tenere conto della compromissione locomotoria.
I metodi tradizionali per analizzare gli studi relativi al tessuto osseo utilizzano spesso la microscopia bidimensionale a sezione ossea, che può avere maggiori difficoltà nell'analisi della morfologia strutturale, della distribuzione della densità, della distribuzione dell'orientamento e di altre caratteristiche a causa dell'influenza dei piani bidimensionali e della disomogeneità dei campioni biologici. Molti studi hanno confermato l'accuratezza e l'efficacia del sistema Micro-CT per descrivere la morfologia ossea, e molti studi44,45,46 hanno confermato i risultati del rilevamento della microstruttura. L'imaging tridimensionale del tessuto osseo mediante Micro-CT consente risultati istomorfometrici ossei più intuitivi e accurati. È stato raggiunto per scansionare piccoli animali e campioni senza giustiziare l'animale o danneggiare il campione di tessuto, consentendo informazioni dettagliate sulla struttura spaziale tridimensionale all'interno del tessuto44. Gli studi hanno dimostrato che i pazienti con SM sono inclini alla perdita di massa ossea e all'osteoporosi24,25; Scansionando e visualizzando il femore dei topi EAE con un sistema Micro-CT, è stato possibile osservare un evidente deterioramento della microarchitettura ossea e una diminuzione della resistenza ossea nel femore dei topi EAE rispetto ai topi WT che avevano sviluppato l'osteoporosi. L'analisi Micro-CT è relativamente semplice da eseguire e relativamente poco costosa, e l'imaging live Micro-CT può essere utilizzato per monitorare la salute delle ossa in futuro quando si somministra il trattamento ai topi EAE. Tuttavia, lo svantaggio è l'assenza di marcatori di turnover osseo valutati attraverso campioni di sangue o istomorfometria ossea per osservare cambiamenti fondamentali nell'omeostasi metabolica ossea nei topi EAE47. La regolazione degli osteoblasti e degli osteoclasti potrebbe essere presa in considerazione nell'ambito dello studio in futuro.
La SM è una malattia multi-sintomo e l'unico scopo della gestione della malattia è ridurre al minimo i sintomi della malattia. Nel protocollo sopra menzionato, i sintomi clinici della SM possono essere simulati costruendo il modello EAE indotto MOG35-55 . I topi EAE hanno mostrato sintomi clinici di disfunzione motoria e comportamento ansioso e osteoporosi. Il sistema di punteggio a 5 punti, il test in campo aperto e l'analisi Micro-CT descritti in questo protocollo possono monitorare i sintomi patologici dei topi EAE da più prospettive e fornire uno schema di riferimento per il trattamento degli EAE. In assenza di farmaci modificanti la malattia efficaci, una potenziale combinazione di terapia sinergica può fornire la migliore opportunità per alleviare i sintomi e migliorare la funzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno della National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e dello State Key Laboratory of Drug Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
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