Summary
Настоящий протокол описывает индукцию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в мышиной модели с использованием миелинового олигодендроцитарного гликопротеина и мониторинг процесса заболевания с использованием клинической системы оценки. Экспериментальные симптомы, связанные с аутоиммунным энцефаломиелитом, анализируются с использованием микрокомпьютерного томографического анализа бедренной кости мыши и теста в открытом поле для всесторонней оценки процесса заболевания.
Abstract
Рассеянный склероз (РС) является типичным аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), характеризующимся воспалительной инфильтрацией, демиелинизацией и повреждением аксонов. В настоящее время нет мер по полному излечению РС, но доступны множественные методы лечения, модифицирующие заболевание (ДМТ), для контроля и смягчения прогрессирования заболевания. Имеются существенные сходства между патологическими особенностями ЦНС экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) и больных РС. EAE широко используется в качестве репрезентативной модели для определения эффективности лекарств от РС и изучения разработки новых методов лечения заболевания РС. Активная индукция EAE у мышей обладает стабильным и воспроизводимым эффектом и особенно подходит для изучения влияния лекарств или генов на аутоиммунное нейровоспаление. Метод иммунизации мышей C57BL/6J миелиновым олигодендроцитарным гликопротеином (MOG35-55) и ежедневная оценка симптомов заболевания с использованием клинической системы оценки в основном распространены. Учитывая сложную этиологию РС с разнообразными клиническими проявлениями, существующая клиническая балльная система не может удовлетворить оценку лечения заболевания. Чтобы избежать недостатков одного вмешательства, создаются новые показатели для оценки EAE на основе клинических проявлений тревожно-подобных настроений и остеопороза у пациентов с РС, чтобы обеспечить более всестороннюю оценку лечения РС.
Introduction
Аутоиммунные заболевания представляют собой спектр расстройств, вызванных иммунным ответом иммунной системы на собственные антигены, что приводит к повреждению тканей или дисфункции1. Рассеянный склероз (РС) — хроническое аутоиммунное заболевание полинейропатии центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся воспалительной инфильтрацией, демиелинизацией и нейрональной аксональной дегенерацией 2,3. В настоящее время РС затронул до 2,5 миллионов человек во всем мире, в основном молодых людей и людей среднего возраста в возрасте 20-40 лет, которые часто являются основой своих семей и общества. Это нанесло значительный ущерб семьям и обществу 2,4.
РС – это многофакторное заболевание с разнообразными и сложными клиническими проявлениями. Помимо классических неврологических расстройств, характеризующихся воспалительной инфильтрацией и демиелинизацией, РС часто проявляет нарушения зрения, дискинезию конечностей, когнитивные и эмоциональные расстройства 5,6,7. Если пациенты с РС не получают надлежащего и правильного лечения, половина из них будет жить в инвалидных колясках через 20 лет, и почти половина из них будет испытывать депрессивные и тревожные симптомы, что приведет к гораздо более высоким уровням суицидальных мыслей, чем население в целом 8,9.
Несмотря на длительный период исследований, этиология РС остается неуловимой, а патогенез РС до сих пор не выяснен. Животные модели РС позволили служить инструментами тестирования для изучения развития заболеваний и новых терапевтических подходов, несмотря на значительные различия между иммунной системой грызунов и человека, в то же время разделяя некоторые основные принципы. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) в настоящее время является идеальной животной моделью для изучения РС, которая использует аутоантигенный иммунитет к белкам миелина для индуцирования аутоиммунитета к компонентам ЦНС у восприимчивых мышей с добавлением полного адъюванта Фройнда (CFA) и коклюшного токсина (PTX) для усиления гуморального иммунного ответа. В зависимости от генетического фона и иммунных антигенов получают различные болезненные процессы, в том числе острые, рецидивирующе-ремиттирующие или хронические, имитирующие различные клинические формы РС 10,11,12. Соответствующие иммуногены, обычно используемые при построении моделей EAE, поступают из собственных белков ЦНС, таких как основной белок миелина (MBP), протеолипидный белок (PLP) или миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG). У мышей, иммунизированных MBP или PLP, развивается рецидивирующе-ремиттирующий курс, а MOG вызывает хронический прогрессирующий EAE у мышей C57BL/6 11,12,13.
Основной целью модифицирующей болезнь терапии (ДМТ) является минимизация симптомов заболевания и улучшение функции6. Несколько препаратов используются клинически для облегчения рассеянного склероза, но ни один препарат еще не был использован для его полного излечения, что свидетельствует о необходимости синергетического лечения. Мыши C57BL/6 в настоящее время наиболее часто используются для построения трансгенных мышей, и в этой работе модель EAE, индуцированная MOG35-55 у мышей C57BL/6J с 5-балльной шкалой, была использована для мониторинга прогрессирования заболевания. Модели EAE также страдают от тревожного настроения и потери костной массы, а также от широко известных демиелинизирующих поражений. Здесь также описан метод оценки симптомов ЭАЭ с нескольких точек зрения с использованием теста в открытом поле и микрокомпьютерного томографического анализа (Микро-КТ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по уходу за животными Университета Тунцзи одобрил настоящую работу, и все руководящие принципы по уходу за животными были соблюдены. Для экспериментов использовались самцы или самки мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 12 недель. Было обеспечено, чтобы возраст и пол были одинаковыми в экспериментальных группах; в противном случае была затронута восприимчивость к заболеванию. Мышей размещали в специфической свободной от патогенов среде с чередованием 12-часового светового и темного циклов в постоянных условиях (комнатная температура 23 ± 1 °C, влажность 50% ± 10%), со свободным доступом к мышиной пище и воде.
1. Приготовление эмульсии MOG35-55
- Добавьте термоинактивированный лиофилизированный Микобактерий туберкулеза (MTB, H37Ra) к дополнению адъюванта Фройнда (который сам по себе содержит 1 мг/мл термоинактивированного MTB, H37Ra), в результате чего конечная концентрация МТБ составляет 5 мг/мл (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся операция должна быть завершена в шкафу биобезопасности; не открывайте продуваемый воздух. - Растворить лиофилизированный пептид MOG35-55 (см. Таблицу материалов) стерильным предварительно охлажденным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (без ионов кальция и магния, рН 7,4) для получения раствора антигена в концентрации 2 мг/мл.
- Возьмите чистую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл и добавьте в каждую трубку по одному стерилизованному стальному шарику размером 5 мм (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 500 мкл полного адъюванта Фройнда, содержащего 5 мг/мл MTB и 500 мкл раствора антигена MOG35-55 , в вышеуказанную микроцентрифужную трубку, содержащую один стальной шарик.
- Осциллируйте вышеуказанную трубку на TissueLyser (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин, охладите на льду в течение 10 мин и повторите четыре раза, чтобы хорошо перемешать и, наконец, сформировать белый вязкий раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая эмульгация является ключевым этапом в приготовлении эмульсии MOG35-55 , поэтому требуется тщательное перемешивание. TissueLyser настроен на скорость 28 Гц.
2. Препарат коклюшного токсина (PTX)
- Готовят PTX с ddH2Oв концентрации 100 мкг/мл и хранят при 4 °C.
- Разбавьте раствор PTX 50 раз стерильным 1x PBS (без ионов кальция и магния, рН 7,4), чтобы получить раствор 200 нг/100 мкл для использования.
3. Создание модели животных EAE
- Постройте модель EAE, используя 8-12-недельных самцов или самок мышей C57BL/6J. Убедитесь, что мыши адекватно акклиматизированы к кормовой среде до иммунизации.
- Центрифугируют приготовленную эмульсию MOG35-55 (стадия 1) при 4 °C в течение 2-3 с нажатием кнопки Pulse оборудования (см. Таблицу материалов) для осаждения всех эмульсий в нижней части трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсия MOG35-55 может храниться при -20 °C в течение нескольких дней. Чтобы избежать лекарственной недостаточности, рекомендуется использовать его как можно скорее. - Прикрепите иглу весом 22 г к стволу шприца объемом 1 мл, аспирируйте эмульсию MOG35-55 и перенесите эмульсию MOG35-55 в новый ствол шприца объемом 1 мл. Закрепите соединение между стволом шприца объемом 1 мл и иглой 26 г с помощью уплотнительной пленки (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха при загрузке эмульсии MOG35-55 в шприцевые бочки объемом 1 мл. - Протрите и продезинфицируйте место инъекции 70% этанолом.
- Вводят эмульсию MOG35-55 подкожно с каждой стороны спинного отдела мышей, по 100 мкл с каждой стороны. Наблюдайте за автоматическим образованием луковичных масс под кожей спины мышей после завершения операции инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что опытные экспериментаторы выполняют процесс иммунизации и что инъекция делается мягко и медленно, чтобы свести к минимуму давление на мышей. - Вводят вышеуказанным мышам внутрибрюшинно со 100 мкл PTX (шаг 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Днем иммунизации является день 0. Кроме того, убедитесь, что мыши могут быть точно идентифицированы для последующей ежедневной оценки, например, с использованием цветового маркера на хвосте мышей. - Вводят ту же дозу PTX на 2-й день после иммунизации.
- Подготовьте группу неиммунизированных мышей как мышей дикого типа (WT).
4. Клинический мониторинг мышей
- Записывайте массу тела мышей EAE и WT ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжесть EAE положительно коррелирует с потерей веса мышей, поэтому масса тела также является очень важным показателем мониторинга. - Контролировать состояние мышей через 0-21 день после иммунизации с помощью системы 0-5 баллов, указанной в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промежуточные симптомы засчитываются как плюс-минус 0,5 балла.
5. Испытание в открытом поле
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные животные, отобранные для этого этапа, являются мышами EAE в раннем начале, пике и периодах ремиссии. Кроме того, в качестве контроля использовались мыши WT. Следует отметить, что все мыши были протестированы на тревожное поведение перед моделированием, чтобы исключить мышей с тревожными расстройствами для моделирования EAE. Кроме того, мыши EAE в пиковый и ремиссионный периоды с полной двигательной неспособностью были исключены из теста.
- Подготовьте систему видеоанализа 40 × 40 × 40см3 открытого поля и систему видеоанализа активности передвижения (открытого поля) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера установлена в положении, которое полностью закрывает коробку, реакционная комната равномерно освещена, а испытательная комната должна быть тихой зоной. - Поместите подопытных мышей в испытательную комнату для привыкания за 1 ч до начала эксперимента.
- Распылите всю область 70% этанола и протрите чистым бумажным полотенцем, чтобы убедиться, что реакционная камера чистая перед началом теста.
- Извлеките каждую мышь по отдельности из своей клетки и поместите ее в один и тот же угол арены, прежде чем начать исследовать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя часть коробки разделена на 16 сеток, из которых средняя область четырех сеток является центральной областью, а окружающая область - периферийной областью. - Нажмите кнопку «Начать захват» в строке меню системы анализа видео, запишите время и начните съемку.
- Сохраняйте тишину в тестовой комнате.
- Позвольте мыши свободно двигаться в течение 5 минут во время процесса записи.
- Остановите систему сбора и сохраните видео.
- Вытащите мышь с арены, поместите ее обратно в клетку и приступайте к следующей мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите испытательную зону 70% этанолом между прогонами для удаления запахов и других веществ. - Анализируйте результаты с помощью системы видеоанализа.
6. Анализ фенотипа кости
- Усыпление мышей EAE и WT путем вывиха шейки матки на 21-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Персонал, выполняющий операции по вывиху шейки матки, должен быть хорошо обучен, чтобы свести к минимуму боль, перенесенную во время смерти животного. - Заставьте мышь лежать ровно в рассекающем лотке и зафиксируйте конечности.
- Зажмите кожу задних конечностей мыши щипцами и вскройте ножницами кожу и мышечную ткань мыши.
- Отделите бедренную кость от большеберцовой и тазобедренной костей аккуратно ножницами.
- Удалите мышцу, прилипшую к бедренной кости, ножницами и поместите бедренную кость в 70% этанол при комнатной температуре.
- Сканирование дистальной бедренной кости с помощью системы микро-КТ (см. Таблицу материалов) с изотропным размером вокселя 10 мкм, с пиковым напряжением рентгеновской трубки 70 кВ и интенсивностью рентгеновского излучения 0,114 мА.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-фильтр Гаусса позволяет расшучивать 2D-пороговые изображения. - Проанализируйте 100 срезов, отсканированных от среднего бедренного ствола, чтобы измерить параметры бедренной кости, включая объем кости, объем ткани, минеральную плотность кости, трабекулярное разделение, трабекулярное число, плотность трабекулярного соединения, а также толщину трабекулярной и корковой мышц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с проксимального конца дистальной пластины роста бедренной кости у мышей, были обнаружены участки, полностью лишенные структур эпифизарной шапки, которые продолжали простираться на 100 срезов в сторону проксимальной бедренной кости, которые были вручную очерчены контурами на нескольких вокселях от внутренней поверхности коры для идентификации эпифизарных трабекул. - Создавайте 3D-реконструкции путем укладки пороговых 2D-изображений из контурных областей в системе микро-КТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После иммунизации мышей массу тела мышей регистрируют ежедневно, а их клинические симптомы оценивают по протоколу, описанному выше (этап 4). У мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом MOG, поскольку расположение поражения в основном ограничено спинным мозгом, патогенез мышей EAE распространяется от хвостового конца к голове. В начале заболевания мыши EAE проявляют слабость и опущение хвоста, за которыми следует слабость задних конечностей, нескоординированное движение и паралич. По мере обострения заболевания оно постепенно перерастает в слабость передних конечностей, паралич, а в тяжелых случаях вызывает затруднение перемещения мышей и даже близкую смерть. Как показано на рисунке 1A, диаграмма состояния мышей с различной степенью патологии EAE изображает примерную картину группы мышей, меняющихся от бессимптомных до высокорезультативных симптомов EAE (оценка 4). Ранее также упоминалось, что масса тела мышей EAE коррелирует с клиническими симптомами. По сравнению с мышами WT, потеря веса у мышей EAE может начать происходить в первые несколько дней после иммунизации, в то время как клинические симптомы мышей EAE обычно начинаются на 6-9 день после иммунизации и достигают пика на 14-16 день. После этого симптомы мышей EAE обычно частично восстанавливаются, и в то же время потеря веса мышей будет облегчена (рисунок 1B, C). Таким образом, течение начала EAE обычно делится на периоды раннего начала, пика и ремиссии, и прогнозирование этих временных точек важно при оценке параметров результата. В целом, для анализа продукции иммунных клеток и цитокинов в месте поражения EAE иммунные клетки в головном и спинном мозге мышей EAE на пике заболевания могут быть выделены и дополнительно обработаны, что может быть проанализировано методом проточной цитометрии14,15. Ткань спинного мозга в пиковом начале также наиболее подходит для получения окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) и быстрого синего окрашивания Luxol для дальнейшего исследования воспалительной инфильтрации клеток и демиелинизации спинного мозга14,16. Для мониторинга изменений в иммунной системе в разное время начала ЭАЕ, селезенка и лимфатические узлы в раннем начале также являются важными вариантами17,18. Кроме того, клетки из селезенки или лимфатических узлов мышей, иммунизированных MOG, обычно используются для построения моделей переноса, которые передаются мышам-реципиентам после рестимуляции MOG in vitro, чтобы индуцировать пассивную иммунизацию мышей EAE18.
РС представляет собой аутоиммунное воспалительное индуцированное демиелинизирующее поражение центральной нервной системы, характеризующееся воспалительной демиелинизацией и потерей нейронов 2,3. Это заболевание обычно сопровождается психическими сопутствующими заболеваниями, такими как аффективные расстройства, из которых тревожное расстройство очень распространено у пациентов с РС, причем до 30% пациентов с РС страдают от тревоги 9,19. Тревожное расстройство — это психиатрическая аномалия, характеризующаяся чрезмерным эмоциональным стрессом и беспокойством. Открытый полевой тест часто используется для анализа поведения на предмет тревоги у грызунов20,21. С помощью анализа исследовательского поведения мышей EAE в тестах в открытом поле во время раннего начала, пика и периода ремиссии было обнаружено, что мыши EAE также имели тревожное поведение, аналогичное поведению пациентов с РС (рисунок 2A). В тесте в открытом поле тревожные грызуны, как правило, имеют пониженную активность и повышенное стереотипное поведение, включая предпочтение быть ближе к углам, уклон в сторону периферийной области и отсутствие желания исследовать центральную область. По сравнению с мышами WT, мыши EAE имели значительно более низкое расстояние ходьбы и время движения во всех трех периодах заболевания, даже в раннем начале заболевания, когда мыши EAE еще не имели двигательных нарушений (рисунок 2B, C). Кроме того, мыши EAE проходят значительно меньшее расстояние и остаются в центральной области меньше, чем обычные мыши, и даже перемещаются только в периферической области, демонстрируя явное тревожное настроение (рисунок 2D,E). Мыши EAE по-прежнему демонстрируют сильное тревожное настроение, когда начало мягкое, то есть координацию движений. Некоторые исследования показывают, что это может быть связано с легким нейровоспалением, которое дополнительно влияет на секрецию нейротрансмиттеров22,23. Открытые полевые тесты, отслеживающие тревожные триггеры настроения у мышей EAE, могут помочь исследователям понять и лечить психические сопутствующие заболевания РС.
С прогрессированием заболевания РС по существу со временем проявляется в виде дискинезии. Исследования показали, что пациенты с РС имеют более высокую восприимчивость к остеопорозу и переломам, в основном из-за потери костной массы, и что тяжесть дискинезии сильно коррелирует с плотностью костной ткани пациента24,25. Подобное явление можно наблюдать с помощью микро-КТ анализа с помощью животной модели EAE (рисунок 3A,H). Из данных трабекулярного анализа бедренной кости у мышей у мышей EAE произошло значительное снижение минеральной плотности кости (МПК) по сравнению с мышами WT, что является важным показателем ответа на прочность кости и важной основой для диагностики остеопороза (рисунок 3B). Дальнейший анализ показал, что потеря трабекулярной костной массы произошла значительно у мышей EAE по сравнению со здоровыми мышами WT и сопровождалась снижением плотности трабекулярного соединения, трабекулярных чисел и толщины трабекуляра. Все они характерны для снижения костной массы, предполагая, что EAE также вызывает потерю трабекулярной кости в бедренной кости мышей (рисунок 3C-F). При этом изменилась структурная морфология костных трабекул, а расстояние между трабекулами значительно увеличилось; чем больше расстояние, тем больше остеопороз кости (рисунок 3G). Это согласуется с представлением о том, что пациенты с РС склонны к остеопорозу. В корковых костях диафиза бедренной кости толщина кортикальной кости в модели EAE была значительно меньше, чем у нормальных мышей (Рисунок 3I). При РС снижение моторики и усиление мышечной дистрофии тесно связаны с остеопорозом, переломом и повышенной резорбцией кости из-за снижения механических сил, постепенно уменьшая целостность кости, тем самым увеличивая риск остеопороза и перелома26. Микро-КТ анализ бедренной кости у мышей EAE может хорошо контролировать здоровье костей, и вмешательство полезно для контроля состояния EAE.
Рисунок 1: Мониторинг клинических симптомов ЭАЕ. (А) Примерная картина мышей с различной степенью патологии EAE. (B) Изменение веса у мышей WT и EAE. (C) Клинический балл у мышей WT и EAE. Данные приведены в виде среднего ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 по сравнению с мышами WT, двусторонним тестом ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Тревожно-подобное поведение мышей EAE в тесте в открытом поле. (A) Репрезентативные графики трека теста в открытом поле. Расстояние перемещения (B), продолжительность активности (C), расстояние перемещения в центре (D) и время, проведенное в центре (E) мышей WT и мышей EAE в периоды раннего начала, пика и ремиссии. Данные являются средними ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 по сравнению с мышами WT, t-тест Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Микро-КТ анализ здоровья костей у мышей EAE. (A) Репрезентативные 3D-изображения бедренной трабекулярной архитектуры (шкала, 100 мкм). Минеральная плотность кости (B), отношение объема кости к объему ткани (C), плотность соединения (D), числа (E), толщина (F) и разделение (G) бедренного трабекуляра были определены с помощью анализа Микро-КТ. (H) Репрезентативные 3D-изображения кортикальной кости (шкала, 100 мкм). (I) Толщина коры, полученная из данных микровычисленной томографии. Данные являются средними ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 по сравнению с мышами WT, t-тест Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Счёт | Клинический признак | ||
| 0 | Отсутствие клинических признаков | ||
| 0.5 | Слабость хвоста, передняя часть хвоста опускается | ||
| 1 | Хвост полностью парализован | ||
| 2 | Легкий паралич задних конечностей (слабость обеих задних конечностей или односторонний паралич, нескоординированная ходьба, реакция на защемление) | ||
| 3 | Полный паралич задних конечностей, задние конечности волочатся и ходят, задние конечности не реагируют на защемление | ||
| 4 | Паралич задних конечностей и слабость передних конечностей | ||
| 5 | Близкий к смерти или умирающий | ||
Таблица 1: Клиническая система подсчета баллов.
| Антиген | Напряжение | Характерный | Приложение | Ограничение | ||
| ПЛП | SJL/J34 | Рецидивирующе-ремиттирующую ЭАЭ | Изучение клеточных и молекулярных событий, участвующих в клиническом рецидиве | Ограничен т-клеточными специфическими реакциями; Изучение конкретных генов и путей в штамме SJL/J является сложной задачей | ||
| ПМБП | SJL/J35 | Рецидивирующий паралич, наблюдаемый у частичных или полных реципиентов после выздоровления от острого паралича | Исследование нейровоспаления и активации иммунной системы | Ограничен т-клеточными специфическими реакциями; Изучение конкретных генов и путей в штамме SJL/J является сложной задачей | ||
| МОГ35-55 | С57БЛ/631 | Первичная прогрессивная ЕАЭ; Хроническая прогрессирующая ЭАЭ | Изучение механизмов повреждения аксонов; Изучение молекулярных механизмов заболеваний в трансгенных и нокаутных моделях | Исследования первичной демиелинизации и регенерации миелина имеют ограниченную ценность | ||
| Гомогенат спинного мозга | Биоцци АБХ36 | Рецидивирующе-ремиттирующую ЭАЭ | Изучение регенерации миелина и нейропротекторная терапия при РС | Не клинически прогрессирует, с накоплением неврологического дефицита с течением времени; Ограничено специфическими реакциями CD4 Т-клеток | ||
| Вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера | Несколько штаммов мышей очень восприимчивы, включая SJL/J, SWR, PL/J12,31 | Вирусные модели воспалительной демиелинизации | Исследование аксональных повреждений и демиелинизации, вызванной воспалением | Вирусных инфекций, специфичных для РС, выявлено не было; Регенерацию миелина трудно оценить, демиелинизация и регенерация миелина происходят одновременно. | ||
| Купризон | Широко используется у мышей C57BL/6, в то время как другие штаммы, такие как штамм CD1, менее восприимчивы к повреждению, вызванному медным купризоном37,38 | Токсическая модель демиелинизации и ремиелинизации | Изучение Т-клеточной независимой демиелинизации, особенно регенерации миелина и основных процессов восстановления миелина | Значительная спонтанная регенерация миелина происходит после прекращения токсического поражения; Демиелинизация специфична для области головного мозга и не полезна для изучения демиелинизации спинного мозга | ||
| Лизолецитин | SJL/J12, C57BL/639 и т.д. | Токсическая модель демиелинизации и ремиелинизации | Изучение Т-клеточной независимой демиелинизации, особенно регенерации миелина и основных процессов восстановления миелина | Отсутствие иммунного ответа, наблюдаемое при РС | ||
| Бромид этидия | C57BL/640 и т.д. | Токсическая модель демиелинизации и ремиелинизации | Исследование очаговых демиелинизирующих поражений и прогнозирование кинетики демиелинизации и регенерации миелина | Бромид этидия повреждает все клетки, содержащие ядра; Ограниченная корреляция с РС | ||
Таблица 2: Различные мышиные модели MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РС является демиелинизирующим воспалительным заболеванием ЦНС и является одним из наиболее распространенных неврологических расстройств, вызывающих хроническую инвалидность у молодых людей, налагающих огромную нагрузку на семьи и общество 3,4. РС всегда классифицировался как орган-специфическое Т-клеточное аутоиммунное заболевание, индуцирующее аутоиммунную систему медленно разрушать ЦНС, которая будет включать в себя несколько систем по всему телу27. Типичные клинические симптомы включают нарушения зрения, двигательные расстройства, когнитивные и эмоциональные нарушения и т.д. 6,7. РС является разрушительным заболеванием, которое будет постепенно ухудшаться, если его не лечить должным образом, что приводит к тяжелой слепоте и параличу28. Патогенез РС еще не до конца изучен, так как его клинические проявления и патологическое прогрессирование неоднородны, и поэтому животные модели имеют важное значение для исследования и разработки лечения РС.
Наиболее часто изучаемой животной моделью для РС является EAE, которая в основном имеет два метода моделирования: активная иммунизация и пассивная иммунизация29. Первый широко распространен из-за его простоты, отсутствия облучения мыши и короткого времени цикла. Активная иммунная модель EAE индуцирует аутоиммунные реакции в ЦНС путем иммунизации грызунов самомиелинными антигенами или их последующими пептидами, обычно проявляющимися в виде слабости хвоста и паралича конечностей13. В частности, модель EAE, индуцированная MOG35-55 у мышей C57BL/6J, характеризуется чередованием циклов ремиссии-рецидива, сопровождающихся воспалением ЦНС, демиелинизацией и повреждением аксонов, что делает индуцированную MOG35-55 EAE предпочтительной моделью 11,12. EAE может быть хорошо индуцирован у мышей, сенсибилизированных подкожной инъекцией пептида MOG35-55, эмульгированных иммунопотенциатором CFA, обогащенным MTB, и получавших внутрибрюшинную инъекцию PTX с эффектом нарушения гематоэнцефалического барьера на 0-230 день. Самой большой проблемой для модели EAE является низкая частота слабых симптомов, и несколько влияющих факторов имеют решающее значение для хода эксперимента. (1) Возраст и окружающая среда мышей будут влиять на восприимчивость к EAE. Поэтому мышей того же возраста нужно отбирать перед экспериментом. Мыши должны быть взвешены и случайным образом сгруппированы перед распределением клеток, и вес каждой группы должен быть близок. Кроме того, убедитесь, что условия окружающей среды между независимыми экспериментами сопоставимы. (2) Концентрация PTX: Основная роль PTX заключается в повышении проницаемости гематоэнцефалического барьера, что позволяет патогенным Т-клеткам проникать в ЦНС для секреции соответствующих цитокинов и стимулирования воспалительной реакции, что в конечном итоге приводит к гидролизу миелиновых белков, обернутых во внешний слой нервных аксонов. Начало заболевания у мышей EAE было отложено с уменьшением концентрации приема PTX, и тяжесть заболевания была бы ослаблена, если бы PTX уменьшился более чем на 60%. (3) Растворение антигена MOG35-55: Чтобы избежать замораживания и оттаивания, рекомендуется приобретать лиофилизированный антиген MOG35-55 в отдельных упаковках, 4 мг / пробирка, чтобы избежать замораживания и оттаивания. Кроме того, PTX используется для растворения вместо стерильной воды, потому что лучше эмульгировать CFA с использованием PTX. (4) Антиген MOG35-55 и CFA должны быть достаточно эмульгированы путем колебаний, чтобы образовать структуру «вода в масле», а капли эмульсии не рассеиваются на поверхности воды в течение длительного времени, что указывает на хорошее эмульгирование. (5) Двухточечная инъекция использовалась для моделирования EAE мыши. Место инъекции предпочтительно расположено выше талии и ниже шеи, близко к позвоночнику, чтобы мыши не облизывали и не кусали кожу, что приводило к разливу эмульсии MOG35-55.
Однако модель EAE, индуцированная антигеном MOG35-55, все еще имеет некоторые ограничения. В качестве модели воспалительной энцефалопатии первичного аксонального повреждения, опосредованного CD4 Т-клетками, основным поражением является массивная аксональная дегенерация со вторичной демиелинизацией и менее первичной демиелинизацией, которая отличается от патологии РС 31,32,33. Модель EAE, индуцированная MOG35-55, в основном отражает иммунный ответ, обусловленный CD4 Т-клетками, в то время как другие иммунные клетки, такие как CD8 Т- и В-клетки, не имеют сильного чувства участия в этой модели31. Другим ограничивающим фактором является то, что EAE, индуцированная MOG35-55, имеет определенный уклон в сторону иммунологического компонента патофизиологии РС, и другие модели на животных могут быть рассмотрены при рассмотрении исследований, ориентированных на патологии ЦНС, таких как изучение демиелинизации и процессов регенерации миелина 34,35,36,37,38,39,40, как описано в таблице 2 .
EAE является эффективным предиктором в имитации аутоиммунных свойств РС, а также его механизма воспаления и демиелинизации12, что заставляет многих ученых стремиться изучать его иммуномодулирующие механизмы, игнорируя другие клинические симптомы РС. Исследования показали, что РС-ассоциированная тревога приписывается патофизиологическим процессам, таким как иммунная дисрегуляция и воспаление мозга22, 23,41. Проблемы психического здоровья, такие как тревога, особенно распространены у людей с РС, а тревожное расстройство может препятствовать выполнению основных повседневных задач и значительно влиять на качество жизни42,43. Изменения в двигательной способности мышей EAE могут предсказать изменения в нейронных процессах. В экспериментах в открытом поле тревожное поведение происходило у мышей EAE, включая снижение исследовательского поведения, которое начало раннее начало заболевания (по сути, испытуемые с клиническими баллами <0,5 и двигательной способностью почти так же хороши, как у нормальных мышей), предполагая, что начало тревожного поведения предшествует двигательным нарушениям. Кроме того, мыши EAE в период ремиссии не улучшали тревожное поведение с повышенной двигательной способностью. Возникновение воспалительной реакции может быть ответственным за психические нарушения у мышей EAE через нейронную активность, приводящую к изменениям настроения, а повышение уровня воспалительных цитокинов нарушает синаптическую функцию стриатального нерва до начала двигательных нарушений23,41. Однако испытание в открытом поле требует внимания к тому факту, что испытательная комната должна быть тихой зоной, а испытуемым мышам необходимо акклиматизироваться в помещении за 1 ч, чтобы избежать чрезмерного давления, вызванного новой средой. Дополнительная очистка этанолом требуется между испытаниями для удаления запахов и других веществ, оставленных последним испытуемым. Основным ограничением теста в открытом поле является интерференция, вызванная двигательной дисфункцией у мышей EAE, а тест для оценки тревожного поведения грызунов основан на расстоянии, времени и диапазоне активности грызунов в реакционной камере и не может исключать влияние двигательной дисфункции на тревожно-подобное поведение. Поэтому в будущих исследованиях необходимо учитывать нарушения опорно-двигательного аппарата.
Традиционные методы анализа исследований, связанных с костной тканью, часто используют двумерную микроскопию костного сечения, которая может иметь большие трудности при анализе структурной морфологии, распределения плотности, распределения ориентации и других характеристик из-за влияния двумерных плоскостей и неоднородности биологических образцов. Многие исследования подтвердили точность и эффективность системы Micro-CT для описания морфологии кости, а многие исследования44,45,46 подтвердили результаты обнаружения микроструктуры. Трехмерная визуализация костной ткани с помощью Микро-КТ позволяет получить более интуитивные и точные результаты костной гистоморфометрии. Было достигнуто сканирование мелких животных и образцов без выполнения животного или повреждения образца ткани, что позволяет получить подробную трехмерную информацию о пространственной структуре внутри ткани44. Исследования показали, что больные рассеянным склерозом склонны к потере костной массы и остеопорозу24,25; При сканировании и визуализации бедренной кости мышей EAE с помощью системы Micro-CT можно было наблюдать очевидное ухудшение микроархитектуры кости и снижение прочности кости в бедренной кости мышей EAE по сравнению с мышами WT, у которых развился остеопороз. Микро-КТ анализ относительно прост в выполнении и относительно недорог, а микро-КТ живая визуализация может быть использована для мониторинга здоровья костей в будущем при назначении лечения мышам EAE. Однако недостатком является отсутствие маркеров костного оборота, оцениваемых с помощью образцов крови или костной гистоморфометрии для наблюдения фундаментальных изменений в костном метаболическом гомеостазе у мышей EAE47. Регуляция остеобластов и остеокластов может быть рассмотрена в рамках исследования в будущем.
РС является многосимптомным заболеванием, и единственной целью лечения заболевания является минимизация симптомов заболевания. В протоколе, упомянутом выше, клинические симптомы РС могут быть смоделированы путем построения модели EAE, индуцированной MOG35-55 . Мыши EAE показали клинические симптомы двигательной дисфункции и тревожного поведения, а также остеопороза. 5-балльная система подсчета баллов, открытый полевой тест и микро-КТ-анализ, описанные в этом протоколе, могут отслеживать патологические симптомы мышей EAE с разных точек зрения и предоставлять эталонную схему для лечения EAE. В отсутствие эффективных препаратов, модифицирующих заболевание, потенциальная комбинация синергетической терапии может обеспечить наилучшую возможность облегчить симптомы и улучшить функцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) и Государственной ключевой лаборатории исследований лекарственных средств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
