Summary
Detta protokoll beskriver induktionen av experimentell autoimmun encefalomyelit i en musmodell med myelinoligodendrocytglykoprotein och övervakning av sjukdomsprocessen med hjälp av ett kliniskt poängsystem. Experimentella autoimmuna encefalomyelitrelaterade symtom analyseras med hjälp av muslårmikrodatortomografianalys och öppet fälttest för att bedöma sjukdomsprocessen omfattande.
Abstract
Multipel skleros (MS) är en typisk autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av inflammatorisk infiltration, demyelinering och axonal skada. För närvarande finns det inga åtgärder för att bota MS helt, men flera sjukdomsmodifierande terapier (DMT) finns tillgängliga för att kontrollera och mildra sjukdomsprogressionen. Det finns signifikanta likheter mellan de CNS-patologiska egenskaperna hos experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) och MS-patienter. EAE har använts i stor utsträckning som en representativ modell för att bestämma MS-läkemedels effekt och utforska utvecklingen av nya terapier för MS-sjukdom. Aktiv induktion av EAE hos möss har en stabil och reproducerbar effekt och är särskilt lämplig för att studera effekterna av läkemedel eller gener på autoimmun neuroinflammation. Metoden för immunisering av C57BL/6J-möss med myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) och den dagliga bedömningen av sjukdomssymtom med hjälp av ett kliniskt poängsystem delas huvudsakligen. Med tanke på den komplexa etiologin för MS med olika kliniska manifestationer kan det befintliga kliniska poängsystemet inte tillfredsställa bedömningen av sjukdomsbehandling. För att undvika bristerna i en enda intervention skapas nya indikatorer för att bedöma EAE baserat på kliniska manifestationer av ångestliknande stämningar och osteoporos hos MS-patienter för att ge en mer omfattande bedömning av MS-behandling.
Introduction
Autoimmuna sjukdomar är ett spektrum av störningar som orsakas av immunsystemets immunsvar mot sina egna antigener som resulterar i vävnadsskada eller dysfunktion1. Multipel skleros (MS) är en kronisk autoimmun sjukdom av polyneuropati i centrala nervsystemet (CNS), kännetecknad av inflammatorisk infiltration, demyelinering och neuronal axonal degeneration 2,3. För närvarande har MS påverkat så många som 2,5 miljoner människor runt om i världen, mestadels unga och medelålders människor i åldern 20-40 år, som ofta är ryggraden i deras familjer och samhälle. Detta har orsakat betydande konsekvenser och skador för familjer och samhälle 2,4.
MS är en multifaktoriell sjukdom med olika och komplexa kliniska manifestationer. Förutom klassiska neurologiska störningar som kännetecknas av inflammatorisk infiltration och demyelinering visar MS ofta synnedsättning, bendyskinesi och kognitiva och känslomässiga störningar 5,6,7. Om MS-patienter inte får rätt och korrekt behandling kommer hälften av dem att leva i rullstol efter 20 år, och nästan hälften av dem kommer att uppleva depressiva och ångestsymtom, vilket leder till mycket högre nivåer av självmordstankar än den allmänna befolkningen 8,9.
Trots en lång forskningsperiod är etiologin för MS fortfarande svårfångad, och patogenesen av MS har ännu inte klarlagts. Djurmodeller av MS har gjort det möjligt att fungera som testverktyg för att utforska sjukdomsutveckling och nya terapeutiska metoder, trots de betydande skillnaderna mellan gnagare och människors immunsystem, samtidigt som de delar vissa grundläggande principer. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är för närvarande den idealiska djurmodellen för att studera MS, som använder autoantigenimmunitet från myelinproteiner för att inducera autoimmunitet mot CNS-komponenter hos mottagliga möss, med tillägg av komplett Freunds adjuvans (CFA) och kikhosttoxin (PTX) för att förbättra det humorala immunsvaret. Beroende på den genetiska bakgrunden och immunantigener erhålls olika sjukdomsprocesser, inklusive akut, skovvis förlöpande eller kronisk, för att efterlikna olika kliniska former av MS10,11,12. De relevanta immunogenerna som vanligtvis används vid konstruktion av EAE-modeller kommer från själv-CNS-proteiner, såsom myelinbasiskt protein (MBP), proteolipidprotein (PLP) eller myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG). MBP- eller PLP-immuniserade SJL/L-möss utvecklar en skovvis förlöpande kurs, och MOG utlöser kronisk progressiv EAE hos C57BL/6-möss11,12,13.
Huvudsyftet med sjukdomsmodifierande terapi (DMT) är att minimera sjukdomssymtom och förbättra funktion6. Flera läkemedel används kliniskt för att lindra MS, men inget läkemedel har ännu använts för att fullständigt bota det, vilket avslöjar behovet av synergistisk behandling. C57BL/6-möss är för närvarande de vanligaste för att konstruera transgena mus, och i detta arbete användes en EAE-modell inducerad av MOG35-55 i C57BL/6J-möss med en 5-punktsskala för att övervaka sjukdomsprogressionen. EAE-modeller lider också av ångestliknande stämningar och benförlust och de allmänt kända demyeliniserande lesionerna. Här beskrivs också metoden för att bedöma symtomen på EAE ur flera perspektiv med hjälp av open-field test och mikro-datortomografi (Micro-CT) analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvårdskommittén vid Tongji University godkände det nuvarande arbetet och alla riktlinjer för djurvård följdes. Manliga eller kvinnliga C57BL/6J-möss mellan 8-12 veckors ålder användes för experimenten. Det säkerställdes att ålder och kön var desamma i experimentgrupperna; Annars påverkades mottagligheten för sjukdomen. Möss inhystes i en specifik patogenfri miljö med alternerande 12 timmars ljus och mörka cykler under konstanta förhållanden (rumstemperatur 23 ± 1 °C, luftfuktighet 50% ± 10%), med fri tillgång till musmat och vatten.
1. Beredning av MOG35-55-emulsion
- Tillsätt värmeinaktiverad frystorkad Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) för att slutföra Freunds adjuvans (i sig innehållande 1 mg/ml värmeinaktiverad MTB, H37Ra), vilket resulterar i en slutlig MTB-koncentration på 5 mg/ml (se materialförteckning).
OBS: Hela operationen måste slutföras i biosäkerhetsskåpet; Öppna inte blåsluften. - Lös upp den frystorkade MOG35-55-peptiden (se materialtabell) med steril förkyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (utan kalcium- och magnesiumjoner, pH 7.4) för att bereda antigenlösningen i en koncentration av 2 mg/ml.
- Ta ett rent 2 ml mikrocentrifugrör och tillsätt en steriliserad 5 mm stålkula (se materialtabell) till varje rör.
- Tillsätt 500 μl komplett Freunds adjuvans innehållande 5 mg/ml MTB och 500 μl MOG35-55 antigenlösning till ovanstående mikrocentrifugrör innehållande en stålkula.
- Sväng ovanstående rör på en TissueLyser (se materialtabell) i 10 min, svalna på is i 10 min och upprepa fyra gånger för att blanda det väl och slutligen bilda en vit viskös lösning.
OBS: Bra emulgering är ett viktigt steg vid beredning av MOG35-55-emulsion , så noggrann blandning krävs. TissueLyser är inställd på en hastighet av 28 Hz.
2. Beredning av kikhosttoxin (PTX)
- Bered PTX medddH 2O i en koncentration på 100 μg/ml och förvara vid 4 °C.
- Späd PTX-stamlösningen 50 gånger med steril 1x PBS (utan kalcium- och magnesiumjoner, pH 7,4) för att göra en 200 ng/100 μl lösning för användning.
3. Fastställande av EAE-djurmodell
- Konstruera EAE-modellen med hjälp av de 8-12 veckor gamla manliga eller kvinnliga C57BL/6J-mössen. Se till att mössen är tillräckligt acklimatiserade till utfodringsmiljön före immunisering.
- Centrifugera den förberedda MOG35-55-emulsionen (steg 1) vid 4 °C i 2–3 s genom att trycka på utrustningens pulsknapp (se materialförteckning) för att fälla ut alla emulsioner i botten av röret.
OBS: MOG35-55 emulsion kan förvaras vid -20 °C i flera dagar. För att undvika läkemedelsfel rekommenderas det att använda det så snart som möjligt. - Fäst en 22 G nål på en 1 ml sprutpipa, aspirera MOG 35-55-emulsionen och överför MOG35-55-emulsionen till en ny 1 ml sprutpipa. Säkra anslutningen mellan sprutcylindern på 1 ml och en 26 G nål med förslutningsfilm (se materialförteckning).
OBS: Undvik luftbubblor när du laddar MOG35-55 emulsion i 1 ml sprutfat. - Torka och desinficera injektionsstället med 70% etanol.
- Injicera MOG35-55-emulsionen subkutant på varje sida av mössens rygg, 100 μl på varje sida. Observera den automatiska bildningen av bulbous massor under huden på mössens dorsum efter att injektionsoperationen är klar.
OBS: Se till att erfarna experimenter utför immuniseringsprocessen och att injektionen görs försiktigt och långsamt för att minimera trycket på möss. - Injicera ovanstående möss intraperitonealt med 100 μL PTX (steg 2).
OBS: Dagen för immunisering är dag 0. Se också till att mössen kan identifieras exakt för efterföljande daglig utvärdering, till exempel att använda en färgmarkör på mössens svans. - Injicera samma dos av PTX på dag 2 efter immunisering.
- Förbered en grupp oimmuniserade möss som vilda (WT) möss.
4. Klinisk övervakning av möss
- Registrera kroppsvikten hos EAE- och WT-möss dagligen.
OBS: Svårighetsgraden av EAE är positivt korrelerad med viktminskningen hos möss, så kroppsvikt är också ett mycket viktigt övervakningsindex. - Övervaka status för möss från 0-21 dagar efter immunisering med hjälp av 0-5-poängsystemet som anges i tabell 1.
OBS: Symtom däremellan räknas som plus eller minus 0,5 poäng.
5. Test av öppna fält
OBS: De försöksdjur som valts ut för detta steg är EAE-möss i början av början, topp och remissionsperioder. Dessutom användes WT-möss som kontroll. Det bör noteras att alla möss testades för ångestliknande beteende före modellering för att utesluta möss med ångeststörningar för EAE-modellering. Dessutom uteslöts EAE-möss i topp- och remissionsperioder med fullständig motorisk inkapacitet från testet.
- Förbered en 40 × 40 × 40 cm3 öppen fältreaktionskammare och ett rörelseaktivitet (öppet fält) videoanalyssystem (se materialtabell).
OBS: Kameran är installerad i ett läge som helt täcker lådan, reaktionsrummet är jämnt upplyst och testrummet måste vara ett tyst område. - Placera testmössen i testrummet för tillvänjning 1 h innan du startar experimentet.
- Spraya hela området med 70% etanol och torka av med en ren pappershandduk för att säkerställa att reaktionskammaren är ren innan testet påbörjas.
- Ta bort varje mus individuellt från buren och placera den i samma hörn av arenan innan du börjar utforska.
OBS: Botten av lådan är uppdelad i 16 rutnät, varav det mellersta fyra rutnätområdet är det centrala området och det omgivande området är det perifera området. - Klicka på Start Capture-knappen i menyraden i videoanalyssystemet, spela in tid och börja fotografera.
- Håll tyst i testrummet.
- Låt musen röra sig fritt i 5 minuter under inspelningsprocessen.
- Stoppa förvärvssystemet och spara videon.
- Ta musen ut ur arenan, sätt tillbaka den i buret och fortsätt till nästa mus.
OBS: Rengör testområdet med 70% etanol mellan körningarna för att ta bort lukt och andra ämnen. - Analysera resultaten med hjälp av videoanalyssystemet.
6. Analys av benfenotyp
- Avliva EAE- och WT-mössen genom cervikal dislokation den 21: a dagen.
OBS: Personal som utför livmoderhalsförskjutningsoperationer måste vara välutbildad för att minimera smärtan som uthärdas under djurets död. - Låt musen ligga platt i en dissekeringsbricka och fixa extremiteterna.
- Håll musens bakbenshud med pincett och öppna mushuden och muskelvävnaden med sax.
- Separera lårbenet från skenbenet och höftbenet försiktigt med sax.
- Ta bort muskeln som fäster vid lårbenet med sax och placera lårbenet i 70% etanol vid rumstemperatur.
- Skanna det distala lårbenet med ett mikro-CT-system (se materialtabell) med en isotrop voxelstorlek på 10 μm, med en maximal röntgenrörspänning på 70 kV och en röntgenintensitet på 0,114 mA.
OBS: Ett 3D Gaussian-filter gör det möjligt att denoisera 2D-tröskelbilder. - Analysera de 100 skivor som skannats från den mellersta lårbensaxeln för att mäta lårbensparametrar, inklusive benvolym, vävnadsvolym, benmineraltäthet, trabekulär separation, trabekulärt anslutningstäthet och trabekulär och kortikal tjocklek.
OBS: Från och med den proximala änden av den distala lårbenstillväxtplattan hos möss hittades sektioner som helt saknade epifyseala lockstrukturer och fortsatte att sträcka sig 100 skivor mot det proximala lårbenet, som manuellt skisserades konturer vid flera voxlar bort från den inre kortikala ytan för att identifiera epifyseal trabeculae. - Skapa 3D-rekonstruktioner genom att stapla 2D-bilder med tröskelvärde från konturregioner i mikro-CT-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter immunisering av mössen registreras mössens kroppsvikt dagligen och deras kliniska symtom utvärderas enligt protokollet som beskrivs ovan (steg 4). I C57BL / 6J möss immuniserade med MOG peptid, eftersom platsen för lesionen huvudsakligen är begränsad till ryggmärgen,patogenesen av EAE-möss sprider sig från svansänden till huvudet. I början av sjukdomen uppvisar EAE-möss svaghet och hängande i svansen, följt av svaghet i bakbenen, okoordinerad rörelse och förlamning. När sjukdomen förvärras utvecklas den gradvis till svagheten i frambenen, förlamning och i allvarliga fall orsakar svårigheter att flytta mössen och till och med nära döden. Som visas i figur 1A visar tillståndsdiagrammet för mössen med olika grader av EAE-patologi en exemplarisk bild av en grupp möss som förändras från asymptomatiska till högpoängande EAE-symtom (poäng 4). Det har också nämnts tidigare att kroppsvikten hos EAE-möss är korrelerad med kliniska symtom. Jämfört med WT-möss kan viktminskning hos EAE-möss börja inträffa under de första dagarna efter immunisering, medan de kliniska symtomen hos EAE-möss vanligtvis börjar på dag 6-9 efter immunisering och når en topp på dag 14-16. Efter detta återhämtar sig symtomen på EAE-möss i allmänhet delvis, och samtidigt kommer mössens viktminskning att lindras (figur 1B,C). Således är förloppet av EAE-debut vanligtvis uppdelat i tidiga debut-, topp- och remissionsperioder, och förutsägelsen av dessa tidpunkter är viktig för att bedöma resultatparametrar. I allmänhet, för att analysera produktionen av immunceller och cytokiner på platsen för EAE-lesioner, kan immunceller i hjärnan och ryggmärgen hos EAE-möss vid toppen av sjukdomen isoleras och bearbetas ytterligare, vilket kan analyseras med flödescytometri14,15. Ryggmärgsvävnaden vid toppdebut är också mest lämpad för beredning av hematoxylin och eosin (H&E) färgning och Luxol snabb blå färgning för att ytterligare undersöka den inflammatoriska cellinfiltrationen och demyelineringen av ryggmärgen14,16. För övervakning av förändringar i immunsystemet vid olika starttider för EAE är mjälte och lymfkörtlar vid tidig debut också viktiga alternativ17,18. Dessutom används celler från mjälten eller lymfkörtlarna hos MOG-immuniserade EAE-möss vanligtvis för att konstruera överföringsmodeller, som överförs till mottagarmöss efter restimulering av MOG in vitro för att inducera passiv immunisering av EAE-möss18.
MS är en autoimmun inflammatorisk inducerad demyeliniserande lesion i centrala nervsystemet som kännetecknas av inflammatorisk demyelinering och neuronal förlust 2,3. Denna sjukdom åtföljs vanligtvis av psykiatriska comorbiditeter, såsom affektiva störningar, varav ångestsyndrom är mycket vanligt hos MS-patienter, med upp till 30% av MS-patienter som lider av ångest 9,19. Ångestsyndrom är en psykiatrisk abnormitet som kännetecknas av överdriven känslomässig stress och oro. Öppet fälttest används ofta för att analysera beteenden för ångest hos gnagare20,21. Med hjälp av att analysera utforskningsbeteenden hos EAE-möss i öppna fälttester under tidiga debut-, topp- och remissionsperioder fann man att EAE-möss också hade ångestliknande beteenden som liknar MS-patienter (Figur 2A). I det öppna fälttestet tenderar oroliga gnagare att ha minskad aktivitet och ökat stereotypt beteende, inklusive en preferens för att vara närmare hörnen, en bias mot den perifera domänen och brist på lust att utforska det centrala området. Jämfört med WT-möss hade EAE-möss signifikant lägre gångavstånd och rörelsetid under alla tre perioderna av sjukdomen, även i början av sjukdomen när EAE-möss ännu inte hade en motorisk försämring (figur 2B,C). Dessutom passerar EAE-möss betydligt mindre avstånd och stannar i det centrala området mindre än vanliga möss och rör sig till och med bara i det perifera området, vilket visar uppenbart ångestliknande humör (figur 2D,E). EAE-möss uppvisar fortfarande ett starkt ångestliknande humör när debuten är mild, det vill säga motorisk koordination. Vissa studier tyder på att detta kan hänföras till mild neuroinflammation, vilket ytterligare påverkar neurotransmittorsekretion22,23. Öppna fälttester som övervakar ångestliknande humörutlösare hos EAE-möss kan hjälpa forskare att förstå och behandla MS-psykiatriska comorbiditeter.
Med sjukdomsframstegen manifesteras MS i huvudsak så småningom som dyskinesi. Studier har visat att MS-patienter har en högre känslighet för osteoporos och fraktur, främst på grund av förlust av benmassa, och att svårighetsgraden av dyskinesi är starkt korrelerad med patientens bentäthet24,25. Ett liknande fenomen kan observeras genom mikro-CT-analys med hjälp av EAE-djurmodellen (figur 3A,H). Från trabekulära analysdata för lårbenet hos möss genomgick EAE-möss en signifikant minskning av benmineraltätheten (BMD) jämfört med WT-möss, vilket är en viktig indikator på svaret på benstyrka och en viktig grund för diagnos av osteoporos (Figur 3B). Ytterligare analys visade att trabekulär benförlust inträffade signifikant hos EAE-möss jämfört med friska WT-möss och åtföljdes av en minskning av trabekulär anslutningstäthet, trabekulärt antal och trabekulär tjocklek. Dessa är alla karakteristiska för minskad benmassa, vilket tyder på att EAE också orsakar trabekulär benförlust i lårbenet hos möss (figur 3C-F). Samtidigt förändrades den strukturella morfologin hos bentrabeculae, och avståndet mellan trabeculae ökade signifikant; ju större avstånd, desto mer osteoporotiskt ben (figur 3G). Detta överensstämmer med uppfattningen att MS-patienter är benägna att osteoporos. I kortikala ben i lårbensdiafysen var tjockleken på kortikala ben i EAE-modellen signifikant mindre än hos normala möss (figur 3I). Vid MS är minskad rörlighet och ökad muskeldystrofi starkt förknippade med osteoporos, fraktur och ökad benresorption på grund av minskade mekaniska krafter, vilket gradvis minskar benintegriteten, vilket ökar risken för osteoporos och fraktur26. Mikro-CT-analys av lårbenet hos EAE-möss kan övervaka benhälsan väl, och interventionen är fördelaktig för att kontrollera tillståndet för EAE.
Figur 1: Övervakning av kliniska symtom på EAE. (A) Den exemplariska bilden av mössen med olika grader av EAE-patologi. B) Viktförändring för WT- och EAE-möss. (C) Klinisk poäng hos WT- och EAE-möss. Data ges som medelvärde ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 jämfört med WT-möss, tvåvägs ANOVA-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ångestliknande beteende hos EAE-möss i testet av öppna fält. (A) Representativa spårytor för testet med öppna fält. Reseavstånd (B), aktivitetens varaktighet (C), reseavstånd i mitten (D) och tid i mitten (E) av WT-möss och EAE-möss i tidiga debut-, topp- och remissionsperioder. Data är medelvärde ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med WT-möss, Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikro-CT-analys av benhälsa hos EAE-möss. (A) Representativa 3D-bilder av femoral trabekulär arkitektur (skalstreck, 100 μm). Benmineraltäthet (B), benvolym/vävnadsvolymförhållande (C), anslutningstäthet (D), antal (E), tjocklek (F) och separation (G) av lårbenets trabekulära bestämdes genom mikro-CT-analys. (H) Representativa 3D-bilder av kortikalt ben (skalstänger, 100 μm). (I) Kortikal tjocklek erhållen från mikrodatortomografidata. Data är medelvärde ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med WT-möss, Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tjog | Kliniskt tecken | ||
| 0 | Inga kliniska tecken | ||
| 0.5 | Svanssvaghet, framsida av svans som tappar | ||
| 1 | Svansen helt förlamad | ||
| 2 | Mild förlamning av bakbenen (svaghet i båda bakbenen eller ensidig förlamning, okoordinerad gång, svar på nypa) | ||
| 3 | Fullständig förlamning av bakbenen, bakbenen som drar och går, bakbenen som inte svarar på nypa | ||
| 4 | Förlamning av bakbenen och svaghet i frambenen | ||
| 5 | Nära döden eller döende | ||
Tabell 1: Kliniskt poängsystem.
| Antigen | Anstränga | Kännetecken | Tillämpning | Begränsning | ||
| PLP | SJL/J34 | Återfallsremitterande EAE | Studie av cellulära och molekylära händelser involverade i kliniskt återfall | Begränsad till T-cellsspecifika svar; Att studera specifika gener och vägar i SJL/J-stammen är utmanande | ||
| Mbp | SJL/J35 | Återfallande förlamning följde hos partiella eller totala mottagare efter återhämtning från akut förlamning | Studie av neuroinflammation och aktivering av immunsystemet | Begränsad till T-cellsspecifika svar; Att studera specifika gener och vägar i SJL/J-stammen är utmanande | ||
| MOG35-55 | C57BL/631 | Primär progressiv EAE; Kronisk progressiv EAE | Studie av axonala skademekanismer; Studie av molekylära sjukdomsmekanismer i transgena och knockoutmodeller | Studier av primär demyelinisering och myelinregenerering är av begränsat värde | ||
| Ryggmärgshomogenat | Biozzi ABH36 | Återfallsremitterande EAE | Studie av myelinregenerering och neuroprotektiv behandling för MS | Inte kliniskt progressiv, med ackumulering av neurologiska underskott över tiden; Begränsad till CD4 T-cellsspecifika svar | ||
| Theilers murina encefalomyelitvirus | Flera stammar av möss är mycket mottagliga, inklusive SJL/J, SWR, PL/J 12,31 | Virala modeller av inflammatorisk demyelinering | Studie av axonal skada och inflammationsinducerad demyelinering | Inga MS-specifika virusinfektioner har identifierats. Myelinregenerering är svår att bedöma, demyelinering och myelinregenerering sker samtidigt | ||
| Cuprizone | Används ofta i C57BL / 6-möss, medan andra stammar, såsom CD1-stammen, är mindre mottagliga för kopparkopparkuprizoninducerad skada37,38 | Toxisk modell av demyelinisering och remyelinering | Studie av T-cellsoberoende demyelinering, särskilt myelinregenerering och grundläggande myelinreparationsprocesser | Signifikant spontan myelinregenerering sker efter upphörande av giftig skada; Demyelinisering är hjärnregionspecifik och inte användbar för att studera ryggmärgsdemyelinering | ||
| Lysolecitin | SJL/J12, C57BL/639 m.m. | Toxisk modell av demyelinisering och remyelinering | Studie av T-cellsoberoende demyelinering, särskilt myelinregenerering och grundläggande myelinreparationsprocesser | Brist på immunsvar observerat vid MS | ||
| Etidiumbromid | C57BL/640 m.m. | Toxisk modell av demyelinisering och remyelinering | Studie av fokala demyeliniserande lesioner och förutsägelse av kinetiken för demyelinering och myelinregenerering | Etidiumbromid skadar alla nukleolusinnehållande celler; Begränsad korrelation med MS | ||
Tabell 2: Olika musmodeller av MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MS är en demyeliniserande inflammatorisk sjukdom i CNS och är en av de vanligaste neurologiska störningarna som orsakar kronisk funktionsnedsättning hos unga människor, vilket innebär en enorm börda för familjer och samhälle 3,4. MS har alltid klassificerats som en organspecifik T-cellsmedierad autoimmun sjukdom, vilket får det autoimmuna systemet att långsamt erodera CNS, vilket kommer att involvera flera system i hela kroppen27. Typiska kliniska symtom inkluderar synnedsättning, motoriska störningar, kognitiva och känslomässiga störningar etc 6,7. MS är en förödande sjukdom som gradvis kommer att förvärras om den inte behandlas ordentligt, vilket leder till svår blindhet och förlamning28. Patogenesen av MS är ännu inte helt klarlagd, eftersom dess kliniska manifestationer och patologiska progression är heterogena, och därför är djurmodeller avgörande för forskning och utveckling av behandling av MS.
Den mest studerade djurmodellen för MS är EAE, som huvudsakligen har två modelleringsmetoder: aktiv immunisering och passiv immunisering29. Den förstnämnda är allmänt antagen på grund av dess enkelhet, brist på musbestrålning och kort cykeltid. EAE-aktiv immunmodell inducerar autoimmuna svar i CNS genom att immunisera gnagare med självmyelinantigener eller deras efterföljande peptider, vanligtvis manifesterar sig som svanssvaghet och lemförlamning13. Specifikt kännetecknas EAE-modellen inducerad av MOG 35-55 i C57BL / 6J-möss av alternerande remission-återfallscykler, åtföljd av CNS-inflammation, demyelinering och axonal skada, vilket gör MOG35-55-inducerad EAE till den föredragna modellen11,12. EAE kan induceras väl hos möss som sensibiliseras genom subkutan injektion av MOG 35-55 peptid, emulgeras med immunpotentiator CFA berikad med MTB och ges en intraperitoneal injektion av PTX med blod-hjärnbarriär störande effekt på dag0-2 30. Den största utmaningen för EAE-modellen är den låga förekomsten av svaga symtom, och flera påverkande faktorer är avgörande för experimentets gång. (1) Mössens ålder och miljö kommer att påverka känsligheten för EAE. Därför måste möss av samma ålder väljas före experimentet. Mössen ska viktas och slumpmässigt grupperas före burtilldelning, och vikten för varje grupp måste hållas nära. Se också till att miljöförhållandena mellan oberoende experiment är jämförbara. (2) Koncentrationen av PTX: PTX: PTX: s huvudroll är att öka permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären, vilket gör det möjligt för patogena T-celler att komma in i CNS för att utsöndra relevanta cytokiner och främja det inflammatoriska svaret, vilket i slutändan leder till hydrolys av myelinproteiner insvept i det yttre skiktet av nervaxoner. Sjukdomsdebuten hos EAE-möss försenades med minskande PTX-administreringskoncentration, och svårighetsgraden av sjukdomen skulle försvagas om PTX minskade med mer än 60%. (3) Upplösning av MOG 35-55-antigen: För att undvika frysning och upptining rekommenderas att det frystorkade MOG35-55-antigenet införskaffas i separata förpackningar, 4 mg/rör, för att undvika frysning och upptining. PTX används också för upplösning istället för sterilt vatten eftersom det är bättre att emulgera med CFA med PTX. (4) MOG35-55-antigen och CFA måste emulgeras tillräckligt genom oscillering för att bilda en vatten-i-olja-struktur, och emulsionsdropparna sprids inte på vattenytan under lång tid, vilket indikerar god emulgering. (5) Tvåpunktsinjektion användes för EAE-modellering av mus. Injektionsstället är företrädesvis beläget ovanför midjan och under nacken, nära ryggraden, för att undvika att möss slickar och biter i huden, vilket resulterar i spill av MOG35-55-emulsion.
EAE-modellen som induceras av MOG35-55-antigenet har dock fortfarande vissa begränsningar. Som en inflammatorisk encefalopatimodell av primär axonal skada medierad av CD4 T-celler är huvudlesionen massiv axonal degeneration med sekundär demyelinisering och mindre primär demyelinisering, vilket skiljer sig från MS-patologin31,32,33. EAE-modellen inducerad av MOG 35-55 återspeglar huvudsakligen immunsvaret som drivs av CD4 T-celler, medan andra immunceller som CD8 T- och B-celler inte har en stark känsla av deltagande i denna modell31. En annan begränsande faktor är att EAE inducerad av MOG35-55 har en viss bias mot den immunologiska komponenten i MS-patofysiologi, och andra djurmodeller kan övervägas när man överväger studier fokuserade på CNS-patologier, såsom studier av demyelinisering och myelinregenereringsprocesser 34,35,36,37,38,39,40, som beskrivs i tabell 2 .
EAE är en effektiv prediktor för att imitera de autoimmuna egenskaperna hos MS, liksom dess inflammations- och demyeliniseringsmekanism12, vilket gör många forskare angelägna om att studera dess immunmodulerande mekanismer och ignorerar andra kliniska symtom på MS. Studier har visat att MS-associerad ångest tillskrivs patofysiologiska processer som immundysreglering och hjärninflammation22, 23,41. Psykiska problem, såsom ångest, är särskilt vanliga hos personer med MS, och ångestsyndrom kan hindra utförandet av grundläggande dagliga uppgifter och avsevärt påverka livskvaliteten42,43. Förändringar i EAE-mössens lokomotoriska förmåga kan förutsäga förändringar i neurala processer. I öppna fältexperiment inträffade ångestliknande beteenden hos EAE-möss,inklusive en minskning av undersökande beteenden som startade tidigt sjukdomsuppkomst (i huvudsak testpersoner med kliniska poäng <0,5 och rörelseförmåga nästan lika bra som normala möss), vilket tyder på att uppkomsten av ångestliknande beteenden föregår motorisk försämring. Dessutom förbättrade EAE-möss i remissionsperioden inte ångestliknande beteende med ökad motorisk förmåga. Framväxten av det inflammatoriska svaret kan vara ansvarig för den mentala försämringen hos EAE-möss genom neuronal aktivitet, vilket leder till förändringar i humör, och uppreglering av inflammatoriska cytokinnivåer stör striatal synaptisk funktion före början av motorisk försämring23,41. Det öppna fälttestet kräver dock uppmärksamhet på det faktum att testrummet måste vara ett lugnt område, och testmössen måste acklimatisera sig till rummet i 1 timme i förväg för att undvika alltför stort tryck orsakat av den nya miljön. Ytterligare rengöring med etanol krävs mellan testerna för att avlägsna lukt och andra ämnen som lämnats kvar av den sista testpersonen. Huvudbegränsningen för det öppna fälttestet är störningen orsakad av motorisk dysfunktion hos EAE-möss, och testet för utvärdering av gnagarångestliknande beteende baseras på avstånd, tid och intervall för gnagaraktivitet i reaktionskammaren och kan inte utesluta effekten av motorisk dysfunktion på ångestliknande beteende. Därför måste framtida studier ta hänsyn till lokomotorisk försämring.
Traditionella metoder för att analysera benvävnadsrelaterade studier använder ofta tvådimensionell bensektionsmikroskopi, vilket kan ha större svårigheter att analysera strukturell morfologi, densitetsfördelning, orienteringsfördelning och andra egenskaper på grund av påverkan av tvådimensionella plan och inhomogenitet hos biologiska prover. Många studier har bekräftat noggrannheten och effektiviteten hos Micro-CT-systemet för att beskriva benmorfologi, och många studier44,45,46 har bekräftat mikrostrukturdetekteringsresultat. Den tredimensionella avbildningen av benvävnad med Micro-CT möjliggör mer intuitiva och exakta benhistomorfometriresultat. Det har uppnåtts att skanna små djur och prover utan att avrätta djuret eller skada vävnadsprovet, vilket möjliggör detaljerad tredimensionell rumslig strukturinformation inuti vävnaden44. Studier har visat att MS-patienter är benägna att förlora benmassa och osteoporos24,25; Genom att skanna och avbilda lårbenet hos EAE-möss med ett mikro-CT-system kunde en uppenbar försämring av benmikroarkitekturen och minskad benstyrka observeras i lårbenet hos EAE-möss jämfört med WT-möss som hade utvecklat osteoporos. Mikro-CT-analys är relativt enkel att utföra och relativt billig, och Micro-CT live imaging kan användas för att övervaka benhälsan i framtiden vid administrering av behandling till EAE-möss. Nackdelen är emellertid frånvaron av benomsättningsmarkörer bedömda genom blodprover eller benhistomorfometri för att observera grundläggande förändringar i benmetabolisk homeostas hos EAE-möss47. Reglering av osteoblaster och osteoklaster kan övervägas inom studien i framtiden.
MS är en sjukdom med flera symtom, och det enda syftet med sjukdomshantering är att minimera sjukdomssymptom. I protokollet som nämns ovan kan de kliniska symtomen på MS simuleras genom att konstruera MOG35-55-inducerad EAE-modell . EAE-möss visade kliniska symtom på motorisk dysfunktion och ångestliknande beteende och osteoporos. 5-punkts poängsystemet, öppet fälttest och mikro-CT-analys som beskrivs i detta protokoll kan övervaka de patologiska symtomen hos EAE-möss ur flera perspektiv och ge ett referensschema för behandling av EAE. I avsaknad av effektiva sjukdomsmodifierande läkemedel kan en potentiell kombination av synergistisk terapi ge den bästa möjligheten att lindra symtomen och förbättra funktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner stödet från National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658 32270754) och State Key Laboratory of Drug Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
