Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करके माउस मॉडल में प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस के प्रेरण का वर्णन करता है और नैदानिक स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग करके रोग प्रक्रिया की निगरानी करता है। प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस से संबंधित लक्षणों का विश्लेषण माउस फीमर माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी विश्लेषण और रोग प्रक्रिया का व्यापक रूप से आकलन करने के लिए ओपन फील्ड टेस्ट का उपयोग करके किया जाता है।
Abstract
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक विशिष्ट ऑटोइम्यून बीमारी है जो भड़काऊ घुसपैठ, डिमाइलिनेशन और अक्षीय क्षति की विशेषता है। वर्तमान में, एमएस को पूरी तरह से ठीक करने के लिए कोई उपाय नहीं हैं, लेकिन रोग की प्रगति को नियंत्रित करने और कम करने के लिए कई रोग-संशोधित उपचार (डीएमटी) उपलब्ध हैं। प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) और एमएस रोगियों की सीएनएस पैथोलॉजिकल विशेषताओं के बीच महत्वपूर्ण समानताएं हैं। ईएई का व्यापक रूप से एमएस दवाओं की प्रभावकारिता निर्धारित करने और एमएस रोग के लिए नए उपचारों के विकास का पता लगाने के लिए एक प्रतिनिधि मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। चूहों में ईएई के सक्रिय प्रेरण का एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रभाव होता है और ऑटोइम्यून न्यूरोइन्फ्लेमेशन पर दवाओं या जीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त होता है। माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी35-55) के साथ सी 57बीएल / 6 जे चूहों को प्रतिरक्षित करने की विधि और नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करके रोग के लक्षणों का दैनिक मूल्यांकन मुख्य रूप से साझा किया जाता है। विभिन्न नैदानिक अभिव्यक्तियों के साथ एमएस के जटिल एटियलजि को देखते हुए, मौजूदा नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली रोग उपचार के मूल्यांकन को संतुष्ट नहीं कर सकती है। एकल हस्तक्षेप की कमियों से बचने के लिए, एमएस रोगियों में चिंता जैसे मूड और ऑस्टियोपोरोसिस की नैदानिक अभिव्यक्तियों के आधार पर ईएई का आकलन करने के लिए नए संकेतक एमएस उपचार का अधिक व्यापक मूल्यांकन प्रदान करने के लिए बनाए गए हैं।
Introduction
ऑटोइम्यून रोग अपने स्वयं के एंटीजन के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण होने वाले विकारों का एक स्पेक्ट्रम है जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति या शिथिलताहोती है। मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में पॉलीन्यूरोपैथी की एक पुरानी ऑटोइम्यून बीमारी है, जो भड़काऊ घुसपैठ, डिमाइलिनेशन और न्यूरोनल अक्षीय अध: पतन 2,3 की विशेषता है। वर्तमान में, एमएस ने दुनिया भर में 2.5 मिलियन लोगों को प्रभावित किया है, ज्यादातर 20-40 वर्ष की आयु के युवा और मध्यम आयु वर्ग के लोग, जो अक्सर अपने परिवारों और समाज की रीढ़ होते हैं। इसने परिवारोंऔर समाज को काफी प्रभाव और नुकसान पहुंचाया है।
एमएस विविध और जटिल नैदानिक अभिव्यक्तियों के साथ एक बहुक्रियात्मक बीमारी है। भड़काऊ घुसपैठ और डिमाइलिनेशन की विशेषता वाले क्लासिक न्यूरोलॉजिकल विकारों के अलावा, एमएस अक्सर दृश्य हानि, अंग डिस्केनेसिया और संज्ञानात्मक और भावनात्मक विकार 5,6,7 दिखाता है। यदि एमएस रोगियों को उचित और सही उपचार नहीं मिलता है, तो उनमें से आधे 20 वर्षों के बाद व्हीलचेयर में रहेंगे, और उनमें से लगभग आधे अवसादग्रस्तता और चिंता के लक्षणों का अनुभव करेंगे, जिससे सामान्य आबादी 8,9 की तुलना में आत्मघाती विचारधारा का स्तर बहुत अधिक होगा।
एक लंबी शोध अवधि के बावजूद, एमएस का एटियलजि मायावी बना हुआ है, और एमएस के रोगजनन को अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है। एमएस के पशु मॉडल ने कृंतक और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच महत्वपूर्ण अंतर के बावजूद, रोग के विकास और नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए परीक्षण उपकरण के रूप में सेवा करने की अनुमति दी है, जबकि एक ही समय में कुछ बुनियादी सिद्धांतों को साझा किया है। प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) वर्तमान में एमएस का अध्ययन करने के लिए आदर्श पशु मॉडल है, जो अतिसंवेदनशील चूहों में सीएनएस घटकों को ऑटोइम्यूनिटी को प्रेरित करने के लिए माइलिन प्रोटीन से ऑटोएंटीजन प्रतिरक्षा का उपयोग करता है, जिसमें ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) और पर्टुसिस टॉक्सिन (पीटीएक्स) को जोड़ा जाता है। आनुवंशिक पृष्ठभूमि और प्रतिरक्षा एंटीजन के आधार पर, एमएस10,11,12 के विभिन्न नैदानिक रूपों की नकल करने के लिए तीव्र, रिलैप्सिंग-रेमिटिंग, या क्रोनिक सहित विभिन्न रोग प्रक्रियाएं प्राप्त की जाती हैं। ईएई मॉडल के निर्माण में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक इम्यूनोजेनस्व-सीएनएस प्रोटीन से आते हैं, जैसे माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), प्रोटिओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी), या माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी)। एमबीपी- या पीएलपी-प्रतिरक्षित एसजेएल / एल चूहों में रिलैप्सिंग-रेमिटिंग कोर्स विकसित होता है, और एमओजी सी 57बीएल / 6 चूहों 11,12,13 में क्रोनिक प्रगतिशील ईएई को ट्रिगर करता है।
रोग-संशोधित चिकित्सा (डीएमटी) का मुख्य उद्देश्य रोग के लक्षणों को कम करना और कार्य6 में सुधार करना है। एमएस को कम करने के लिए कई दवाओं का चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन इसे पूरी तरह से ठीक करने के लिए अभी तक किसी भी दवा का उपयोग नहीं किया गया है, जिससे सहक्रियात्मक उपचार की आवश्यकता का पता चलता है। C57BL/6 चूहों को वर्तमान में ट्रांसजेनिक चूहों के निर्माण के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, और इस काम में, रोग की प्रगति की निगरानी के लिए5-बिंदु पैमाने के साथ C57BL / 6J चूहों में MOG 35-55 द्वारा प्रेरित एक EAE मॉडल का उपयोग किया गया था। ईएई मॉडल भी चिंता जैसे मूड और हड्डी के नुकसान से पीड़ित हैं, और व्यापक रूप से ज्ञात डिमाइलेटिंग घाव। यहां, ओपन-फील्ड टेस्ट और माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) विश्लेषण का उपयोग करके कई दृष्टिकोणों से ईएई के लक्षणों का आकलन करने की विधि भी वर्णित है।
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Protocol
टोंगजी विश्वविद्यालय की पशु देखभाल समिति ने वर्तमान कार्य को मंजूरी दे दी, और सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन किया गया। प्रयोगों के लिए 8-12 सप्ताह की उम्र के बीच नर या मादा C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। यह सुनिश्चित किया गया था कि प्रयोगात्मक समूहों में उम्र और लिंग समान थे; अन्यथा, बीमारी के लिए संवेदनशीलता प्रभावित हुई थी। चूहों को एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त वातावरण में स्थिर परिस्थितियों (कमरे का तापमान 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 50% ± 10%) के तहत वैकल्पिक 12 घंटे प्रकाश और अंधेरे चक्रों के साथ रखा गया था, माउस भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ।
1. एमओजी35-55 इमल्शन की तैयारी
- फ्रायंड के सहायक (स्वयं 1 मिलीग्राम / एमएल गर्मी-निष्क्रिय एमटीबी, एच 37 आरए युक्त) को पूरा करने के लिए हीट-इनएक्टिवेटेड माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी, एच 37 आरए) जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एमटीबी एकाग्रता होती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: पूरे ऑपरेशन को जैव सुरक्षा कैबिनेट में पूरा किया जाना चाहिए; उड़ती हवा को न खोलें। - 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एंटीजन समाधान तैयार करने के लिए लियोफिलाइज्ड एमओजी35-55 पेप्टाइड ( सामग्री की तालिका देखें) को बाँझ प्री-कूल्ड फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के बिना, पीएच 7.4) के साथ भंग करें।
- एक साफ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लें और प्रत्येक ट्यूब में एक निष्फल 5 मिमी स्टील बॉल (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
- उपरोक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 मिलीग्राम/एमएल एमटीबी और 500 μL MOG35-55 एंटीजन समाधान युक्त पूर्ण फ्रायंड के सहायक का 500 μL जोड़ें जिसमें एक स्टील बॉल होता है।
- उपरोक्त ट्यूब को 10 मिनट के लिए टिशूलाइज़र ( सामग्री की तालिका देखें) पर घुमाएं, 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और इसे अच्छी तरह से मिलाने के लिए चार बार दोहराएं और अंत में एक सफेद चिपचिपा घोल बनाएं।
नोट: एमओजी35-55 इमल्शन तैयार करने में अच्छा पायसीकरण एक महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए पूरी तरह से मिश्रण की आवश्यकता होती है। टिश्यूलिसर को 28 हर्ट्ज की गति पर सेट किया गया है।
2. पर्टुसिस टॉक्सिन (पीटीएक्स) की तैयारी
- DDH2O के साथ PTX को 100 μg/ mL सांद्रता में तैयार करें और 4 °C पर स्टोर करें।
- उपयोग के लिए 200 एनजी / 100 μL समाधान बनाने के लिए बाँझ 1x PBS (कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के बिना, pH 7.4) के साथ PTX स्टॉक समाधान को 50 बार पतला करें।
3. ईएई पशु मॉडल की स्थापना
- 8-12 सप्ताह के पुरुष या महिला C57BL / 6J चूहों का उपयोग करके EAE मॉडल का निर्माण करें। सुनिश्चित करें कि टीकाकरण से पहले चूहों को पर्याप्त रूप से भोजन के वातावरण के अनुकूल बनाया गया है।
- तैयार एमओजी35-55 इमल्शन (चरण 1) को 2-3 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपकरण के पल्स बटन को दबाकर सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें) ताकि ट्यूब के तल पर सभी इमल्शन को अवक्षेपित किया जा सके।
नोट: एमओजी35-55 इमल्शन को कई दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। दवा की विफलता से बचने के लिए, इसे जल्द से जल्द उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। - 1 एमएल सिरिंज बैरल में 22 ग्राम सुई संलग्न करें, एमओजी35-55 इमल्शन को एस्पिरेट करें, और एमओजी35-55 इमल्शन को एक नए 1 एमएल सिरिंज बैरल में स्थानांतरित करें। सीलिंग फिल्म के साथ 1 एमएल सिरिंज बैरल और 26 जी सुई के बीच संबंध सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एमओजी35-55 इमल्शन को 1 एमएल सिरिंज बैरल में लोड करते समय हवा के बुलबुले से बचें। - 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट को पोंछें और कीटाणुरहित करें।
- एमओजी35-55 इमल्शन को चूहों की पृष्ठीय रीढ़ के प्रत्येक तरफ चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें, प्रत्येक तरफ 100 μL। इंजेक्शन ऑपरेशन पूरा होने के बाद चूहों की डोरसम की त्वचा के नीचे बल्ब द्रव्यमान के स्वचालित गठन का निरीक्षण करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि अनुभवी प्रयोगकर्ता टीकाकरण प्रक्रिया करते हैं और चूहों पर दबाव को कम करने के लिए इंजेक्शन धीरे-धीरे और धीरे-धीरे किया जाता है। - उपरोक्त चूहों को पीटीएक्स (चरण 2) के 100 μL के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें।
नोट: टीकाकरण का दिन 0 दिन है। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि चूहों को बाद के दैनिक मूल्यांकन के लिए सटीक रूप से पहचाना जा सकता है, जैसे कि चूहों की पूंछ पर रंग मार्कर का उपयोग करना। - टीकाकरण के बाद दूसरे दिन पीटीएक्स की एक ही खुराक इंजेक्ट करें।
- जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों के रूप में अप्रतिरक्षित चूहों का एक समूह तैयार करें।
4. चूहों की नैदानिक निगरानी
- ईएई और डब्ल्यूटी चूहों के शरीर के वजन को दैनिक रूप से रिकॉर्ड करें।
नोट: ईएई की गंभीरता चूहों के वजन घटाने के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है, इसलिए बॉडीवेट भी एक बहुत ही महत्वपूर्ण निगरानी सूचकांक है। - तालिका 1 में सूचीबद्ध 0-5 स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग करके टीकाकरण के बाद 0-21 दिनों से चूहों की स्थिति की निगरानी करें।
नोट: बीच में लक्षणों को प्लस या माइनस 0.5 अंक के रूप में गिना जाता है।
5. ओपन फील्ड टेस्ट
नोट: इस चरण के लिए चुने गए प्रयोगात्मक जानवर प्रारंभिक शुरुआत, चरम और छूट अवधि में ईएई चूहे हैं। इसके अलावा, डब्ल्यूटी चूहों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ईएई मॉडलिंग के लिए चिंता विकारों वाले चूहों को बाहर करने के लिए मॉडलिंग से पहले सभी चूहों को चिंता जैसे व्यवहार के लिए परीक्षण किया गया था। इसके अलावा, पूर्ण मोटर अक्षमता के साथ चरम और छूट अवधि में ईएई चूहों को परीक्षण से बाहर रखा गया था।
- एक 40 × 40 × 40 सेमी3 ओपन फील्ड रिएक्शन चैंबर और एक लोकोमोशन एक्टिविटी (ओपन फील्ड) वीडियो विश्लेषण प्रणाली तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: कैमरा एक ऐसी स्थिति में स्थापित है जो बॉक्स को पूरी तरह से कवर करता है, प्रतिक्रिया कक्ष समान रूप से जलाया जाता है, और परीक्षण कक्ष को एक शांत क्षेत्र होना आवश्यक है। - प्रयोग शुरू करने से 1 घंटे पहले परीक्षण चूहों को आदत के लिए परीक्षण कक्ष में रखें।
- पूरे क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और परीक्षण शुरू करने से पहले प्रतिक्रिया कक्ष को साफ करने के लिए एक साफ पेपर तौलिया से पोंछें।
- प्रत्येक माउस को अपने पिंजरे से व्यक्तिगत रूप से हटा दें और अन्वेषण शुरू करने से पहले इसे अखाड़े के एक ही कोने में रखें।
नोट: बॉक्स के निचले भाग को 16 ग्रिड में विभाजित किया गया है, जिनमें से मध्य चार ग्रिड क्षेत्र केंद्रीय क्षेत्र है और आसपास का क्षेत्र परिधीय क्षेत्र है। - वीडियो विश्लेषण प्रणाली के मेनू बार में स्टार्ट कैप्चर बटन पर क्लिक करें, समय रिकॉर्ड करें, और शूटिंग शुरू करें।
- परीक्षा कक्ष में चुप रहो।
- रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान माउस को 5 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करें।
- अधिग्रहण प्रणाली बंद करें और वीडियो सहेजें।
- माउस को अखाड़े से बाहर निकालें, इसे पिंजरे में वापस रखें, और अगले माउस पर आगे बढ़ें।
नोट: गंध और अन्य पदार्थों को हटाने के लिए रन के बीच 70% इथेनॉल के साथ परीक्षण क्षेत्र को साफ करें। - वीडियो विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण करें।
6. हड्डी फेनोटाइप का विश्लेषण
- 21 वें दिन गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा ईएई और डब्ल्यूटी चूहों को यूथेनाइज़ करें।
नोट: गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था ऑपरेशन करने वाले कर्मियों को जानवर की मृत्यु के दौरान सहन किए गए दर्द को कम करने के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए। - माउस को एक विच्छेदित ट्रे में सपाट रखें और छोरों को ठीक करें।
- माउस हिंद अंग की त्वचा को बल के साथ पकड़ें और कैंची के साथ माउस त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों को खोलें।
- टिबिया और कूल्हे की हड्डी से फीमर को कैंची से सावधानी से अलग करें।
- कैंची के साथ फीमर का पालन करने वाली मांसपेशियों को हटा दें और कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल में फीमर रखें।
- 70 केवी के पीक एक्स-रे ट्यूब वोल्टेज और 0.114 एमए की एक्स-रे तीव्रता के साथ, 10 μm के आइसोट्रोपिक वोक्सेल आकार के साथ माइक्रो-सीटी सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके डिस्टल फीमर को स्कैन करें।
नोट: एक 3 डी गॉसियन फ़िल्टर 2 डी थ्रेशोल्ड छवियों के डीनोइज़िंग की अनुमति देता है। - हड्डी की मात्रा, ऊतक की मात्रा, हड्डी खनिज घनत्व, ट्रेब्युलर पृथक्करण, ट्रैब्युलर संख्या, ट्रैब्युलर कनेक्शन घनत्व, और ट्रेब्युलर और कॉर्टिकल मोटाई सहित फीमर मापदंडों को मापने के लिए मध्य ऊरु शाफ्ट से स्कैन किए गए 100 स्लाइस का विश्लेषण करें।
नोट: चूहों में डिस्टल फीमर ग्रोथ प्लेट के समीपस्थ छोर से शुरू होकर, एपिफिज़ियल कैप संरचनाओं से पूरी तरह से रहित खंड पाए गए और समीपस्थ फीमर की ओर 100 स्लाइस का विस्तार करना जारी रखा, जिन्हें एपिफिशियल ट्रेबेक्यूले की पहचान करने के लिए आंतरिक कॉर्टिकल सतह से दूर कई वोक्सल्स पर मैन्युअल रूप से रेखांकित आकृति दी गई थी। - माइक्रो-सीटी सिस्टम में समोच्च क्षेत्रों से दहलीज 2 डी छवियों को ढेर करके 3 डी पुनर्निर्माण बनाएं।
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Representative Results
चूहों के टीकाकरण के बाद, चूहों के शरीर का वजन दैनिक दर्ज किया जाता है, और उनके नैदानिक लक्षणों का मूल्यांकन ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल (चरण 4) के अनुसार किया जाता है। सी 57बीएल / 6 जे चूहों में एमओजी पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित, क्योंकि घाव का स्थान मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी तक ही सीमित है, ईएई चूहों का रोगजनन पूंछ के अंत से सिर तक फैलता है। रोग की शुरुआत में, ईएई चूहों में कमजोरी और पूंछ की सिकुड़न दिखाई देती है, इसके बाद पिछले अंगों की कमजोरी, असमन्वित आंदोलन और पक्षाघात होता है। जैसे-जैसे बीमारी बिगड़ती है, यह धीरे-धीरे अग्रअंगों की कमजोरी, पक्षाघात में विकसित होता है, और गंभीर मामलों में, चूहों को स्थानांतरित करने में कठिनाई का कारण बनता है और यहां तक कि मृत्यु के करीब भी होता है। जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, ईएई पैथोलॉजी के विभिन्न डिग्री वाले चूहों के राज्य आरेख में चूहों के एक समूह की एक अनुकरणीय तस्वीर दिखाई देती है जो स्पर्शोन्मुख से उच्च स्कोरिंग ईएई लक्षणों (स्कोर 4) में बदल रही है। यह भी पहले उल्लेख किया गया है कि ईएई चूहों का शरीर का वजन नैदानिक लक्षणों के साथ सहसंबद्ध है। डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में, ईएई चूहों में वजन घटाने टीकाकरण के बाद पहले कुछ दिनों में होना शुरू हो सकता है, जबकि ईएई चूहों के नैदानिक लक्षण आमतौर पर टीकाकरण के बाद 6-9 दिन से शुरू होते हैं और 14-16 दिन पर चरम पर पहुंच जाएंगे। इसके बाद, ईएई चूहों के लक्षण आम तौर पर आंशिक रूप से ठीक हो जाते हैं, और साथ ही, चूहों के वजन घटाने को कम किया जाएगा (चित्रा 1 बी, सी)। इस प्रकार, ईएई की शुरुआत के पाठ्यक्रम को आमतौर पर शुरुआती शुरुआत, चरम और छूट अवधि में विभाजित किया जाता है, और परिणाम मापदंडों का आकलन करने में इन समय बिंदुओं की भविष्यवाणी महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, ईएई घावों की साइट पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और साइटोकिन्स के उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए, रोग के चरम पर ईएई चूहों के मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और आगे संसाधित किया जा सकता है, जिसका विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री14,15 द्वारा किया जा सकता है। चरम शुरुआत में रीढ़ की हड्डी के ऊतक भी हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला और लक्सोल फास्ट ब्लू स्टेनिंग तैयार करने के लिए सबसे उपयुक्त है ताकि रीढ़ की हड्डीकी सूजन कोशिका घुसपैठ और डिमाइलिनेशन की जांच की जा सके। ईएई के अलग-अलग शुरुआती समय में प्रतिरक्षा प्रणाली में परिवर्तन की निगरानी के लिए, शुरुआती शुरुआत मेंतिल्ली और लिम्फ नोड्स भी आवश्यक विकल्प हैं। इसके अलावा, एमओजी-प्रतिरक्षित ईएई चूहों के प्लीहा या लिम्फ नोड्स से कोशिकाओं का उपयोग आमतौर पर स्थानांतरण मॉडल बनाने के लिए किया जाता है, जो ईएई चूहों के निष्क्रिय टीकाकरण को प्रेरित करने के लिए विट्रो में एमओजी के पुन: उत्तेजना के बाद प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरितहो जाते हैं।
एमएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का एक ऑटोइम्यून भड़काऊ प्रेरित डिमाइलेटिंग घाव है जो भड़काऊ डिमाइलिनेशन और न्यूरोनल हानि 2,3 की विशेषता है। यह बीमारी आमतौर पर मनोवैज्ञानिक कोमोर्बिडिटी के साथ होती है, जैसे कि भावात्मक विकार, जिनमें से एमएस रोगियों में चिंता विकार बहुत आम है, जिसमें 30% तक एमएस रोगी चिंता से पीड़ितहैं। चिंता विकार एक मनोरोग असामान्यता है जो अत्यधिक भावनात्मक तनाव और चिंता की विशेषता है। ओपन फील्ड टेस्ट का उपयोग अक्सर कृन्तकों20,21 में चिंता के लिए व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। प्रारंभिक शुरुआत, चरम और छूट अवधि के दौरान खुले क्षेत्र के परीक्षणों में ईएई चूहों के अन्वेषण व्यवहार का विश्लेषण करने की मदद से, यह पाया गया कि ईएई चूहों में एमएस रोगियों (चित्रा 2 ए) के समान चिंता जैसे व्यवहार भी थे। खुले क्षेत्र के परीक्षण में, चिंतित कृन्तकों ने गतिविधि को कम कर दिया है और स्टीरियोटाइपिक व्यवहार में वृद्धि की है, जिसमें कोनों के करीब होने की प्राथमिकता, परिधीय डोमेन के प्रति पूर्वाग्रह और केंद्रीय क्षेत्र का पता लगाने की इच्छा की कमी शामिल है। डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में, ईएई चूहों में बीमारी की सभी तीन अवधियों में चलने की दूरी और आंदोलन का समय काफी कम था, यहां तक कि बीमारी की शुरुआत में भी जब ईएई चूहों में अभी तक मोटर हानि नहीं थी (चित्रा 2 बी, सी)। इसके अलावा, ईएई चूहे काफी कम दूरी से गुजरते हैं और सामान्य चूहों की तुलना में केंद्रीय क्षेत्र में कम रहते हैं, और यहां तक कि केवल परिधीय क्षेत्र में चलते हैं, जो स्पष्ट चिंता जैसी मनोदशा दिखाते हैं (चित्रा 2 डी, ई)। ईएई चूहे अभी भी एक मजबूत चिंता जैसी मनोदशा प्रदर्शित करते हैं जब शुरुआत हल्की होती है, अर्थात मोटर समन्वय। कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि इसे हल्के न्यूरोइन्फ्लेमेशन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो आगे न्यूरोट्रांसमीटर स्राव22,23 को प्रभावित करता है। ईएई चूहों में चिंता जैसे मूड ट्रिगर्स की निगरानी करने वाले ओपन फील्ड टेस्ट शोधकर्ताओं को एमएस मनोरोग कोमोर्बिडिटी को समझने और इलाज करने में मदद कर सकते हैं।
रोग की प्रगति के साथ, एमएस अनिवार्य रूप से अंततः डिस्केनेसिया के रूप में प्रकट होता है। अध्ययनों में पाया गया है कि एमएस रोगियों में ऑस्टियोपोरोसिस और फ्रैक्चर के लिए उच्च संवेदनशीलता होती है, मुख्य रूप से हड्डी द्रव्यमान हानि के कारण, और यह कि डिस्केनेसिया की गंभीरता रोगी के अस्थि घनत्व24,25 के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है। ईएई पशु मॉडल (चित्रा 3 ए, एच) की मदद से माइक्रो-सीटी विश्लेषण द्वारा एक समान घटना देखी जा सकती है। चूहों में फीमर के त्रिकोणीय विश्लेषण डेटा से, ईएई चूहों ने डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में अस्थि खनिज घनत्व (बीएमडी) में महत्वपूर्ण कमी की, जो हड्डियों की ताकत की प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण संकेतक है और ऑस्टियोपोरोसिस के निदान के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है (चित्रा 3 बी)। आगे के विश्लेषण से पता चला है कि स्वस्थ डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में ईएई चूहों में ट्रिब्युलर हड्डी का नुकसान काफी हुआ और ट्राइब्युलर कनेक्शन घनत्व, ट्रैब्युलर संख्या और ट्रैब्युलर मोटाई में कमी के साथ था। ये सभी कम हड्डी द्रव्यमान की विशेषता हैं, यह सुझाव देते हुए कि ईएई चूहों की फीमर में त्रिकोणीय हड्डी के नुकसान का कारण बनता है (चित्रा 3 सी-एफ)। उसी समय, हड्डी के ट्रेबेकुले की संरचनात्मक आकृति विज्ञान बदल गया, और ट्रेबेकुले की रिक्ति में काफी वृद्धि हुई; जितना अधिक अंतराल होगा, हड्डी उतनी ही अधिक ऑस्टियोपोरोटिक होगी (चित्रा 3 जी)। यह इस धारणा के अनुरूप है कि एमएस रोगियों को ऑस्टियोपोरोसिस का खतरा होता है। फीमर डायफिसिस की कॉर्टिकल हड्डियों में, ईएई मॉडल में कॉर्टिकल हड्डी की मोटाई सामान्य चूहों की तुलना में काफी कम थी (चित्रा 3 आई)। एमएस में, गतिशीलता में कमी और मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी में वृद्धि ऑस्टियोपोरोसिस, फ्रैक्चर और कम यांत्रिक बलों के कारण हड्डी के पुनरुत्थान में वृद्धि के साथ दृढ़ता से जुड़ी हुई है, धीरे-धीरे हड्डी की अखंडता कम हो जाती है, जिससे ऑस्टियोपोरोसिस और फ्रैक्चर का खतरा बढ़जाता है। ईएई चूहों में फीमर का माइक्रो-सीटी विश्लेषण हड्डी के स्वास्थ्य की अच्छी तरह से निगरानी कर सकता है, और हस्तक्षेप ईएई की स्थिति को नियंत्रित करने में फायदेमंद है।
चित्रा 1: ईएई के नैदानिक लक्षणों की निगरानी। (ए) ईएई पैथोलॉजी के विभिन्न डिग्री के साथ चूहों की अनुकरणीय तस्वीर। (बी) डब्ल्यूटी और ईएई चूहों में वजन में परिवर्तन। (सी) डब्ल्यूटी और ईएई चूहों में नैदानिक स्कोर। डेटा को एसईएम (एन = 5), *** पी < 0.001 बनाम डब्ल्यूटी चूहों, दो-तरफा एनोवा परीक्षण के ± माध्य के रूप में दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: खुले क्षेत्र परीक्षण में ईएई चूहों का चिंता जैसा व्यवहार। यात्रा की दूरी (बी), गतिविधि की अवधि (सी), केंद्र में यात्रा की दूरी (डी), और शुरुआती शुरुआत, चरम और छूट अवधि में डब्ल्यूटी चूहों और ईएई चूहों के केंद्र (ई) में बिताया गया समय। डेटा एसईएम (एन = 3), * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 बनाम डब्ल्यूटी चूहों, छात्र के टी-टेस्ट के ± औसत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: ईएई चूहों में हड्डी के स्वास्थ्य का माइक्रो-सीटी विश्लेषण। (ए) फेमोरल ट्रैब्युलर आर्किटेक्चर (स्केल बार, 100 μm) की प्रतिनिधि 3 डी छवियां। अस्थि खनिज घनत्व (बी), हड्डी की मात्रा / ऊतक मात्रा अनुपात (सी), कनेक्शन घनत्व (डी), संख्या (ई), मोटाई (एफ), और फेमोरल ट्रैब्युलर के पृथक्करण (जी) को माइक्रो-सीटी विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। (एच) कॉर्टिकल हड्डी की प्रतिनिधि 3 डी छवियां (स्केल बार, 100 μm)। (I) माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी डेटा से प्राप्त कॉर्टिकल मोटाई। डेटा का मतलब एसईएम (एन = 3), * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 बनाम डब्ल्यूटी चूहों, छात्र के टी-टेस्ट के ± है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अंक | नैदानिक संकेत | ||
| 0 | कोई नैदानिक संकेत नहीं | ||
| 0.5 | पूंछ की कमजोरी, पूंछ के सामने गिरना | ||
| 1 | पूंछ पूरी तरह से लकवाग्रस्त | ||
| 2 | पिछले अंगों का हल्का पक्षाघात (दोनों पिछले अंगों की कमजोरी या एकतरफा पक्षाघात, अनियंत्रित चलना, चुटकी की प्रतिक्रिया) | ||
| 3 | पिछले अंगों का पूर्ण पक्षाघात, पिछले अंगों को खींचना और चलना, पिछले अंगों का चुटकी का जवाब नहीं देना | ||
| 4 | पिछले अंगों का पक्षाघात और अग्रभाग की कमजोरी | ||
| 5 | मृत्यु के निकट या मरने के करीब | ||
तालिका 1: नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली।
| प्रतिजन | मोच | विशेषता | अनुप्रयोग | प्रतिबंध | ||
| PLP | SJL/J34 | रिलैप्सिंग-रेमिटिंग ईएई | नैदानिक रिलैप्स में शामिल सेलुलर और आणविक घटनाओं का अध्ययन | टी-सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं तक सीमित; एसजेएल /जे स्ट्रेन में विशिष्ट जीन और मार्गों का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है | ||
| एमबीपी | SJL/J35 | तीव्र पक्षाघात से उबरने के बाद आंशिक या कुल प्राप्तकर्ताओं में रिलैप्सिंग पैरालिसिस का पालन किया गया | न्यूरोइन्फ्लेमेशन और प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण का अध्ययन | टी-सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं तक सीमित; एसजेएल /जे स्ट्रेन में विशिष्ट जीन और मार्गों का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है | ||
| एमओजी35-55 | C57BL/631 | प्राथमिक प्रगतिशील ईएई; क्रोनिक प्रगतिशील ईएई | अक्षीय क्षति तंत्र का अध्ययन; ट्रांसजेनिक और नॉकआउट मॉडल में आणविक रोग तंत्र का अध्ययन | प्राथमिक डिमाइलिनेशन और माइलिन पुनर्जनन अध्ययन सीमित मूल्य के हैं | ||
| रीढ़ की हड्डी होमोजेनेट | Biozzi ABH36 | रिलैप्सिंग-रेमिटिंग ईएई | एमएस के लिए माइलिन पुनर्जनन और न्यूरोप्रोटेक्टिव थेरेपी का अध्ययन | समय के साथ न्यूरोलॉजिकल घाटे के संचय के साथ चिकित्सकीय रूप से प्रगतिशील नहीं; CD4 T-सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं तक सीमित | ||
| थेइलर का मुराइन एन्सेफलोमाइलाइटिस वायरस | चूहों के कई उपभेद अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं, जिनमें एसजेएल / जे, एसडब्ल्यूआर, पीएल / जे12, 31 शामिल हैं | भड़काऊ डिमाइलिनेशन के वायरल मॉडल | अक्षीय चोट और सूजन-प्रेरित डिमाइलिनेशन का अध्ययन | कोई एमएस-विशिष्ट वायरल संक्रमण की पहचान नहीं की गई है; माइलिन पुनर्जनन का आकलन करना मुश्किल है, डिमाइलेशन और माइलिन पुनर्जनन एक साथ होते हैं | ||
| Cuprizone | सी 57बीएल / 6 चूहों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जबकि अन्य उपभेद, जैसे सीडी 1 तनाव, कॉपर क्यूप्रिज़ोन-प्रेरित क्षति के लिए कम संवेदनशील हैं37,38 | डिमाइलिनेशन और रिमाइलिनेशन का विषाक्त मॉडल | टी कोशिकाओं-स्वतंत्र डिमाइलिनेशन का अध्ययन, विशेष रूप से माइलिन पुनर्जनन और बुनियादी माइलिन मरम्मत प्रक्रियाएं | विषाक्त चोट की समाप्ति के बाद महत्वपूर्ण सहज माइलिन पुनर्जनन होता है; डिमाइलिनेशन मस्तिष्क क्षेत्र-विशिष्ट है और रीढ़ की हड्डी के विघटन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं है | ||
| Lysolecithin | एसजेएल/जे12, सी57बीएल/639, आदि। | डिमाइलिनेशन और रिमाइलिनेशन का विषाक्त मॉडल | टी कोशिकाओं-स्वतंत्र डिमाइलिनेशन का अध्ययन, विशेष रूप से माइलिन पुनर्जनन और बुनियादी माइलिन मरम्मत प्रक्रियाएं | एमएस के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कमी देखी गई | ||
| एथिडियम ब्रोमाइड | C57BL/640, आदि। | डिमाइलिनेशन और रिमाइलिनेशन का विषाक्त मॉडल | फोकल डिमाइलेटिंग घावों का अध्ययन और डिमाइलिनेशन और माइलिन पुनर्जनन के कैनेटीक्स की भविष्यवाणी | एथिडियम ब्रोमाइड सभी न्यूक्लियोलस युक्त कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाता है; एमएस के साथ सीमित सहसंबंध | ||
तालिका 2: एमएस के विभिन्न माउस मॉडल।
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Discussion
एमएस सीएनएस की एक डिमाइलेटिंग भड़काऊ बीमारी है और युवा लोगों में पुरानी विकलांगता का कारण बनने वाले सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है, जो परिवारों और समाजपर भारी बोझ डालता है। एमएस को हमेशा एक अंग-विशिष्ट टी सेल-मध्यस्थता ऑटोम्यून्यून बीमारी के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जो ऑटोइम्यून सिस्टम को धीरे-धीरे सीएनएस को नष्ट करने के लिए प्रेरित करताहै, जिसमें पूरे शरीर में कई प्रणालियां शामिल होंगी। विशिष्ट नैदानिक लक्षणों में दृश्य हानि, मोटर विकार, संज्ञानात्मक और भावनात्मक गड़बड़ीआदि शामिल हैं। एमएस एक विनाशकारी बीमारी है जो ठीक से इलाज नहीं होने पर उत्तरोत्तर खराब हो जाएगी, जिससे गंभीर अंधापन और पक्षाघातहो सकता है। एमएस के रोगजनन को अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है, क्योंकि इसकी नैदानिक अभिव्यक्तियां और पैथोलॉजिकल प्रगति विषम हैं, और इसलिए एमएस के उपचार के अनुसंधान और विकास के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं।
एमएस के लिए सबसे अधिक अध्ययन किया जाने वाला पशु मॉडल ईएई है, जिसमें मुख्य रूप से दो मॉडलिंग विधियां हैं: सक्रिय टीकाकरण और निष्क्रिय टीकाकरण29। पूर्व को इसकी सादगी, माउस विकिरण की कमी और कम चक्र समय के कारण व्यापक रूप से अपनाया जाता है। ईएई सक्रिय प्रतिरक्षा मॉडल सीएनएस में स्व-माइलिन एंटीजन या उनके बाद के पेप्टाइड्स के साथ कृन्तकों को प्रतिरक्षित करके ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है, आमतौर पर पूंछ की कमजोरी और अंग पक्षाघात13 के रूप में प्रकट होता है। विशेष रूप से, सी 57बीएल / 6 जे चूहों में एमओजी35-55 द्वारा प्रेरित ईएई मॉडल को सीएनएस सूजन, डिमाइलिनेशन और अक्षीय चोट के साथ वैकल्पिक छूट-रिलैप्स चक्रों की विशेषता है, जो एमओजी35-55-प्रेरित ईएई को पसंदीदा मॉडल11,12 बनाता है। एमओजी35-55 पेप्टाइड के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा संवेदनशील चूहों में ईएई को अच्छी तरह से प्रेरित किया जा सकता है, एमटीबी से समृद्ध इम्यूनोपोटेंटिएटर सीएफए के साथ इमल्सीफाइड किया जा सकता है, और 0-230 दिनों में रक्त-मस्तिष्क बाधा बाधित प्रभाव के साथ पीटीएक्स का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दिया जा सकता है। ईएई मॉडल के लिए सबसे बड़ी चुनौती कमजोर लक्षणों की कम घटना है, और प्रयोग के दौरान कई प्रभावित कारक महत्वपूर्ण हैं। (1) चूहों की उम्र और पर्यावरण ईएई के लिए संवेदनशीलता को प्रभावित करेगा। इसलिए, प्रयोग से पहले एक ही उम्र के चूहों का चयन करने की आवश्यकता है। पिंजरे के आवंटन से पहले चूहों को भारित और यादृच्छिक रूप से समूहीकृत किया जाना चाहिए, और प्रत्येक समूह के वजन को करीब रखने की आवश्यकता है। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि स्वतंत्र प्रयोगों के बीच पर्यावरणीय परिस्थितियां तुलनीय हैं। (2) पीटीएक्स की एकाग्रता: पीटीएक्स की मुख्य भूमिका रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता को बढ़ाना है, जो रोगजनक टी कोशिकाओं को प्रासंगिक साइटोकिन्स को स्रावित करने और भड़काऊ प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए सीएनएस में प्रवेश करने की अनुमति देता है, अंततः तंत्रिका अक्षतंतु की बाहरी परत में लिपटे माइलिन प्रोटीन के हाइड्रोलिसिस की ओर जाता है। ईएई चूहों में बीमारी की शुरुआत में पीटीएक्स प्रशासन एकाग्रता में कमी के साथ देरी हुई थी, और यदि पीटीएक्स में 60% से अधिक की कमी आई तो बीमारी की गंभीरता कमजोर हो जाएगी। (3) एमओजी35-55 एंटीजन का विघटन: ठंड और पिघलने से बचने के लिए, फ्रीजिंग और पिघलने से बचने के लिए अलग-अलग पैकेज, 4 मिलीग्राम / ट्यूब में लियोफिलाइज्ड एमओजी35-55 एंटीजन खरीदने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, पीटीएक्स का उपयोग बाँझ पानी के बजाय विघटन के लिए किया जाता है क्योंकि पीटीएक्स का उपयोग करके सीएफए के साथ अनुकरण करना बेहतर होता है। (4) एमओजी35-55 एंटीजन और सीएफए को पानी में तेल संरचना बनाने के लिए दोलन करके पर्याप्त रूप से इमल् सीफाइड किया जाना चाहिए, और इमल्शन की बूंदें लंबे समय तक पानी की सतह पर नहीं फैलती हैं, जो अच्छे पायसीकरण का संकेत देती हैं। (5) माउस ईएई मॉडलिंग के लिए दो-बिंदु इंजेक्शन का उपयोग किया गया था। इंजेक्शन साइट अधिमानतः कमर के ऊपर और गर्दन के नीचे, रीढ़ के करीब स्थित है, ताकि चूहों को त्वचा को चाटने और काटने से बचा जा सके, जिसके परिणामस्वरूप एमओजी35-55 इमल्शन का फैलाव होता है।
हालांकि, एमओजी35-55 एंटीजन द्वारा प्रेरित ईएई मॉडल में अभी भी कुछ सीमाएं हैं। सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता वाली प्राथमिक अक्षीय चोट के एक भड़काऊ एन्सेफैलोपैथी मॉडल के रूप में, मुख्य घाव माध्यमिक डिमाइलेशन और कम प्राथमिक डिमाइलिनेशन के साथ बड़े पैमाने पर अक्षीय अध: पतन है, जो एमएस पैथोलॉजी 31,32,33 से अलग है। एमओजी35-55 द्वारा प्रेरित ईएई मॉडल मुख्य रूप से सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा संचालित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दर्शाता है, जबकि सीडी 8 टी और बी कोशिकाओं जैसी अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में इस मॉडल31 में भागीदारी की मजबूत भावना नहीं है। एक और सीमित कारक यह है कि एमओजी35-55 द्वारा प्रेरित ईएई में एमएस पैथोफिज़ियोलॉजी के प्रतिरक्षाविज्ञानी घटक के प्रति एक निश्चित पूर्वाग्रह है, और अन्य पशु मॉडल ों पर विचार किया जा सकता है जब सीएनएस विकृति पर केंद्रित अध्ययनों पर विचार किया जाता है, जैसे कि डिमाइलिनेशन और माइलिन पुनर्जनन प्रक्रियाओं का अध्ययन 34,35,36,37,38,39,40, जैसा कि तालिका 2 में वर्णित है .
ईएई एमएस के ऑटोइम्यून गुणों की नकल करने में एक प्रभावी भविष्यवक्ता है, साथ ही साथ इसकी सूजन और डिमाइलेशन तंत्र12, जो कई विद्वानों को एमएस के अन्य नैदानिक लक्षणों को अनदेखा करते हुए इसके इम्यूनोमॉड्यूलेटरी तंत्र का अध्ययन करने के लिए उत्सुक बनाता है। 23,41. मानसिक स्वास्थ्य के मुद्दे, जैसे चिंता, एमएस वाले लोगों में विशेष रूप से आम हैं, और चिंता विकार बुनियादी दैनिक कार्यों के प्रदर्शन को बाधित कर सकता हैऔर जीवन की गुणवत्ता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है। ईएई चूहों की लोकोमोटर क्षमता में परिवर्तन तंत्रिका प्रक्रियाओं में परिवर्तन की भविष्यवाणी कर सकता है। ओपन-फील्ड प्रयोगों में, ईएई चूहों में चिंता जैसे व्यवहार हुए, जिसमें रोग की शुरुआती शुरुआत शुरू करने वाले खोजपूर्ण व्यवहारों में कमी शामिल थी (अनिवार्य रूप से, नैदानिक स्कोर <0.5 और लोकोमोटर क्षमता लगभग सामान्य चूहों के समान अच्छी) वाले परीक्षण विषय, यह सुझाव देते हुए कि चिंता जैसे व्यवहार की शुरुआत मोटर हानि से पहले होती है। इसके अलावा, छूट अवधि में ईएई चूहों ने मोटर क्षमता में वृद्धि के साथ चिंता जैसे व्यवहार में सुधार नहीं किया। भड़काऊ प्रतिक्रिया का उद्भव न्यूरोनल गतिविधि के माध्यम से ईएई चूहों में मानसिक हानि के लिए जिम्मेदार हो सकता है, जिससे मूड में परिवर्तन होता है, और भड़काऊ साइटोकिन स्तर का अपरेग्यूलेशन मोटर हानि23,41 की शुरुआत से पहले स्ट्रिएटल सिनैप्टिक फ़ंक्शन में हस्तक्षेप करता है। हालांकि, ओपन फील्ड टेस्ट को इस तथ्य पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है कि परीक्षण कक्ष एक शांत क्षेत्र होना चाहिए, और परीक्षण चूहों को नए वातावरण के कारण अत्यधिक दबाव से बचने के लिए 1 घंटे पहले कमरे में अनुकूलन करने की आवश्यकता होती है। अंतिम परीक्षण विषय द्वारा पीछे छोड़ी गई गंध और अन्य पदार्थों को हटाने के लिए परीक्षणों के बीच इथेनॉल के साथ अतिरिक्त सफाई की आवश्यकता होती है। ओपन फील्ड टेस्ट की मुख्य सीमा ईएई चूहों में मोटर डिसफंक्शन के कारण होने वाला हस्तक्षेप है, और कृंतक चिंता जैसे व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण प्रतिक्रिया कक्ष में कृंतक गतिविधि की दूरी, समय और सीमा पर आधारित है, और चिंता जैसे व्यवहार पर मोटर डिसफंक्शन के प्रभाव को खारिज नहीं कर सकता है। इसलिए, भविष्य के अध्ययनों को लोकोमोटर हानि को ध्यान में रखने की आवश्यकता है।
हड्डी के ऊतकों से संबंधित अध्ययनों का विश्लेषण करने के पारंपरिक तरीके अक्सर दो-आयामी हड्डी अनुभाग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, जो दो-आयामी विमानों के प्रभाव और जैविक नमूनों की असमानता के कारण संरचनात्मक आकृति विज्ञान, घनत्व वितरण, अभिविन्यास वितरण और अन्य विशेषताओं का विश्लेषण करने में अधिक कठिनाइयां हो सकती हैं। कई अध्ययनों ने हड्डी आकृति विज्ञान का वर्णन करने के लिए माइक्रो-सीटी सिस्टम की सटीकता और प्रभावशीलता की पुष्टि की है, और कईअध्ययनों 44,45,46 ने माइक्रोस्ट्रक्चर डिटेक्शन परिणामों की पुष्टि की है। माइक्रो-सीटी द्वारा हड्डी के ऊतकों की त्रि-आयामी इमेजिंग अधिक सहज और सटीक हड्डी हिस्टोमॉर्फोमेट्री परिणामों की अनुमति देती है। जानवर को निष्पादित किए बिना या ऊतक नमूने को नुकसान पहुंचाए बिना छोटे जानवरों और नमूनों को स्कैन करना हासिल किया गया है, जिससे ऊतकके अंदर विस्तृत त्रि-आयामी स्थानिक संरचना की जानकारी मिल सके। अध्ययनों से पता चला है कि एमएस रोगियों को हड्डी द्रव्यमान हानि और ऑस्टियोपोरोसिस24,25 का खतरा होता है; माइक्रो-सीटी सिस्टम के साथ ईएई चूहों की फीमर को स्कैन और इमेजिंग करके, ऑस्टियोपोरोसिस विकसित करने वाले डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में ईएई चूहों के फीमर में हड्डी माइक्रोआर्किटेक्चर की स्पष्ट गिरावट और हड्डी की ताकत में कमी देखी जा सकती है। माइक्रो-सीटी विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है और अपेक्षाकृत सस्ती है, और ईएई चूहों को उपचार देते समय भविष्य में हड्डी के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए माइक्रो-सीटी लाइव इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, दोष ईएई चूहों में हड्डी चयापचय होमियोस्टैसिस में मौलिक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए रक्त के नमूनों या हड्डी हिस्टोमॉर्फोमेट्री के माध्यम से मूल्यांकन किए गए हड्डी टर्नओवरमार्करों की अनुपस्थिति है। भविष्य में अध्ययन के भीतर ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट के विनियमन पर विचार किया जा सकता है।
एमएस एक बहु-लक्षण रोग है, और रोग प्रबंधन का एकमात्र उद्देश्य रोग के लक्षणों को कम करना है। ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल में, एमएस के नैदानिक लक्षणों को एमओजी35-55 प्रेरित ईएई मॉडल का निर्माण करके अनुकरण किया जा सकता है। ईएई चूहों ने मोटर डिसफंक्शन और चिंता जैसे व्यवहार और ऑस्टियोपोरोसिस के नैदानिक लक्षण दिखाए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित 5-पॉइंट स्कोरिंग सिस्टम, ओपन फील्ड टेस्ट और माइक्रो-सीटी विश्लेषण कई दृष्टिकोणों से ईएई चूहों के पैथोलॉजिकल लक्षणों की निगरानी कर सकते हैं और ईएई के उपचार के लिए एक संदर्भ योजना प्रदान कर सकते हैं। प्रभावी रोग-संशोधित दवाओं की अनुपस्थिति में, सहक्रियात्मक चिकित्सा का एक संभावित संयोजन लक्षणों को दूर करने और कार्य में सुधार करने का सबसे अच्छा अवसर प्रदान कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) और ड्रग रिसर्च की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से समर्थन स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
