Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

Summary

I nematodi entomopatogeni vivono in simbiosi con i batteri e insieme infettano con successo gli insetti minando il loro sistema immunitario innato. Per promuovere la ricerca sulle basi genetiche dell’infezione da nematodi, vengono descritti metodi per il mantenimento e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni.

Abstract

I nematodi entomopatogeni nei generi Heterorhabditis e Steinernema sono parassiti obbligati di insetti che vivono nel terreno. La caratteristica principale del loro ciclo vitale è l’associazione mutualistica con i batteri Photorhabdus e Xenorhabdus, rispettivamente. I parassiti nematodi sono in grado di localizzare ed entrare in ospiti di insetti adatti, sovvertire la risposta immunitaria degli insetti e moltiplicarsi in modo efficiente per produrre la prossima generazione che caccia attivamente nuove prede di insetti da infettare. A causa delle proprietà del loro ciclo vitale, i nematodi entomopatogeni sono popolari agenti di controllo biologico, che vengono utilizzati in combinazione con insetticidi per controllare i parassiti distruttivi degli insetti agricoli. Allo stesso tempo, questi nematodi parassiti rappresentano uno strumento di ricerca per analizzare la patogenicità dei nematodi e le risposte anti-nematodi dell’ospite. Questa ricerca è aiutata dal recente sviluppo di tecniche genetiche e approcci trascrittomici per comprendere il ruolo delle molecole secrete dai nematodi durante l’infezione. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato sul mantenimento dei nematodi entomopatogeni e sull’utilizzo di una procedura di abbattimento genico. Queste metodologie promuovono ulteriormente la caratterizzazione funzionale dei fattori di infezione da nematodi entomopatogeni.

Introduction

La ricerca sui nematodi entomopatogeni (EPN) si è intensificata negli ultimi anni principalmente a causa dell’utilità di questi parassiti nelle strategie di gestione integrata dei parassiti e del loro coinvolgimento nella ricerca biomedica di base ^1,2. Recenti studi hanno stabilito l’EPN come organismi modello in cui esaminare le componenti genetiche dei nematodi che vengono attivate durante le diverse fasi del processo di infezione. Queste informazioni forniscono indizi critici sulla natura e il numero di molecole secrete dai parassiti per alterare la fisiologia dell’ospite e destabilizzare la risposta immunitaria innata dell’insetto ^3,4. Allo stesso tempo, questa conoscenza è comunemente integrata da nuovi dettagli sul tipo di vie di segnalazione immunitaria dell’ospite insetto e sulle funzioni che regolano per limitare l’ingresso e la diffusione dei patogeni ^5,6. Comprendere questi processi è fondamentale per immaginare entrambi i lati dell’interazione dinamica tra EPN e i loro ospiti di insetti. Un migliore apprezzamento della relazione EPN-insetto ospite faciliterà senza dubbio studi simili con i nematodi parassiti dei mammiferi, che possono portare all’identificazione e alla caratterizzazione dei fattori di infezione che interferiscono con il sistema immunitario umano.

I nematodi EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. possono infettare una vasta gamma di insetti e la loro biologia è stata intensamente studiata in precedenza. I due parassiti nematodi differiscono nella loro modalità di riproduzione con Heterorhabditis autofecondata e Steinernema sottoposto a riproduzione anfimitica, anche se recentemente S. hermaphroditum ha dimostrato di riprodursi per autofecondazione di ermafroditi o attraverso la partenogenesi ^7,8,9. Un’altra differenza tra Heterorhabditis e Steinernema nematodes è il loro mutualismo simbiotico con due generi distinti di batteri Gram-negativi, rispettivamente Photorhabdus e Xenorhabdus, che sono entrambi potenti patogeni degli insetti. Questi batteri si trovano nello stadio giovanile infettivo (IJ) a vita libera e non alimentare dell’EPN, che rileva gli ospiti sensibili, ottiene l’accesso all’emocoel degli insetti dove rilasciano i loro batteri associati che si replicano rapidamente e colonizzano i tessuti degli insetti. Sia l’EPN che i loro batteri producono fattori di virulenza che disarmano le difese degli insetti e compromettono l’omeostasi. Dopo la morte degli insetti, gli IJ nematodi si sviluppano per diventare EPN adulti e completare il loro ciclo di vita. Una nuova coorte di IJ formata in risposta alla privazione di cibo e al sovraffollamento all’interno del cadavere degli insetti emerge finalmente nel terreno per cacciare ospiti adatti 9,10,11,12.

Qui viene descritto un protocollo efficiente per mantenere, amplificare e manipolare geneticamente i nematodi EPN. In particolare, il protocollo delinea la replicazione di H. bacteriophora simbiotici e S. carpocapsae IJ, la generazione di IJ di nematodi axenici, la produzione di Ermafroditi H. bacteriophora per la microiniezione, la preparazione del dsRNA e la tecnica di microiniezione. Questi metodi sono essenziali per comprendere le basi molecolari della patogenicità dei nematodi e dell’immunità anti-nematodi dell’ospite.

Protocol

1. Produzione di giovani infettivi di nematodi simbiotici Coprire una capsula di Petri (10 cm) con un pezzo di carta da filtro e aggiungere circa 10-15 larve di Galleria mellonella (Figura 1A). Utilizzando una pipetta, erogare 2 mL di acqua contenente circa 25-50 IJ per sospensione da 10 μL sui vermi della cera. Conservare la capsula di Petri in un armadietto a temperatura ambiente. A seconda dell’umidità della carta da filtro, aggiun…

Representative Results

Per valutare lo stato dei nematodi H. bacteriophora che hanno attraversato l’axenizzazione, è stata determinata la presenza o l’assenza di colonie batteriche di P. luminescens negli IJ. Per fare questo, è stato raccolto un pellet di circa 500 IJ che erano stati precedentemente sterilizzati in superficie e omogeneizzati in PBS. Il trattamento di controllo positivo consisteva in un pellet di circa 500 IJ provenienti dalla coltura di nematodi contenenti batteri simbiotici P. luminescens . I pell…

Discussion

Comprendere le basi molecolari dell’infezione da nematodi entomopatogeni e dell’immunità anti-nematodi degli insetti richiede la separazione dei parassiti dai batteri mutualisticamente associati 13,15,16. I nematodi entomopatogeni H. bacteriophora e S. carpocapsae convivono con i batteri Gram-negativi P. luminescens e X. nematophila, rispettivamente¹⁷. Entrambe le spec…

Materials

Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	–
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	–
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	–
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625