Summary
التهاب سطح العين يضر بأنسجة سطح العين ويضر بالوظائف الحيوية للعين. يصف البروتوكول الحالي طريقة للحث على التهاب العين وجمع الأنسجة المعرضة للخطر في نموذج فأر لخلل في غدة ميبوميان (MGD).
Abstract
تشمل أمراض سطح العين مجموعة من الاضطرابات التي تزعج وظائف وهياكل القرنية والملتحمة وشبكة الغدد السطحية للعين المرتبطة بها. تفرز غدد ميبوميان (MG) الدهون التي تخلق طبقة تغطية تمنع تبخر الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع. تملأ العدلات ومصائد الحمض النووي خارج الخلية MG وسطح العين في نموذج فأر لمرض حساسية العين. تقوم مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) بصياغة مصفوفة تشبه الشبكة تتكون من كروماتين خارج الخلية يسد منافذ MG ويعالج خلل MG. هنا ، يتم تقديم طريقة للحث على التهاب سطح العين وضعف MG. يتم وصف إجراءات جمع الأعضاء المتعلقة بسطح العين ، مثل القرنية والملتحمة والجفون ، بالتفصيل. باستخدام التقنيات المعمول بها لمعالجة كل عضو ، يتم أيضا عرض السمات المورفولوجية والنسيجية الرئيسية لخلل MG. توفر الإفرازات العينية الفرصة لتقييم الحالة الالتهابية لسطح العين. تتيح هذه الإجراءات التحقيق في التدخلات الموضعية والجهازية المضادة للالتهابات على المستوى قبل السريري.
Introduction
كل غمضة عين تغذي الغشاء المسيل للدموع الناعم المنتشر فوق القرنية. تسهل ظهارة سطح العين التوزيع والاتجاه الصحيح للفيلم المسيل للدموع على سطح العين. يتم توفير الميوسين بواسطة الخلايا الظهارية للقرنية والملتحمة للمساعدة في وضع الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع القادم من الغدد الدمعية على سطح العينين. أخيرا ، يفرز MG الدهون التي تخلق طبقة تغطية تمنع تبخر الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع1،2،3. بهذه الطريقة ، تحمي الوظائف المنسقة لجميع أعضاء العين سطح العين من غزو مسببات الأمراض أو الإصابة وتدعم الرؤية الواضحة تماما دون أي ألم أو إزعاج.
في سطح العين الصحي ، يزيل التفريغ المتدفق للعين أو رووم العين الغبار والخلايا الظهارية الميتة والبكتيريا والمخاط والخلايا المناعية. تقوم مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) بصياغة مصفوفة تشبه الشبكة تتكون من الكروماتين خارج الخلية ودمج هذه المكونات في رويم العين. تعمل AggNETs على حل الالتهاب عن طريق التحلل البروتيني للسيتوكينات والكيموكيناتالمؤيدة للالتهابات 4. ومع ذلك ، عندما تصبح مختلة وظيفيا ، فإن هذه الشبكات الشاذة تدفع التسبب في أمراض مثل انسداد الأوعية الدموية في COVID-195 ، وحصى المرارة6 ، و sialolithiasis7. وبالمثل ، تلعب aggNETs على سطح العين دورا وقائيا وتساهم في حل التهاب السطح شديد التعرض8. يمكن أن يؤدي التكوين المبالغ فيه أو نقص aggNETs في سطح العين إلى إضعاف استقرار الغشاء المسيل للدموع و / أو التسبب في جروح القرنية والتهاب الملتحمة ومرض جفاف العين. على سبيل المثال ، انسداد MG هو السبب الرئيسي لمرض جفاف العين9. من المعروف أيضا أن AggNETs تسد تدفق إفراز الدهون من قنوات MG وتسبب خلل في غدة Meibomian (MGD). يؤدي احتقان فتحات MG بواسطة aggNETs إلى نقص السوائل الدهنية التي تغلف سطح العين والسوائل المعبأة في زجاجات إلى الوراء ، مما يؤدي إلى خلل في وظيفة الغدة وتلف العنيب. يمكن أن يؤدي هذا الخلل الوظيفي إلى تبخر الفيلم المسيل للدموع ، وتليف الهوامش على الجفون ، والتهاب العين ، والأضرار الضارة ل MG10,11.
تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية على مر السنين لتقليد العملية المرضية ل MGD في البشر. على سبيل المثال ، ساعدت الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين عام واحد في دراسة التأثيرات المرتبطة بالعمر على مرض جفاف العين (DED) و MGD ، مما يعكس أمراض العين في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 50 عاما وما فوق12،13،14. علاوة على ذلك ، الأرانب هي نماذج مناسبة للتحقيق في آثار التدخلات الدوائية. لذلك ، تم الإبلاغ عن تحفيز MGD في الأرانب إما عن طريق الإدارة الموضعية للإبينفرين أو الإدخال الجهازي لحمض الريتينويك 13-cis-retinoic (isotretinoin)15،16،17،18،19.
على الرغم من أن هذه النماذج الحيوانية كانت كافية لتحديد العوامل المختلفة التي تساهم في الفيزيولوجيا المرضية ل MGD ، إلا أنها كانت مقيدة في استخدامها. على سبيل المثال ، كان نموذج الفئران ل MGD المرتبط بالعمر مثاليا لفك رموز العناصر لدى كبار السن فقط ، وبالتالي ، يبدو أن الأرانب هي النموذج الحيواني الأنسب لدراسة أمراض سطح العين ، لأنها تمكن من التحقيق في آليات فسيولوجية مرضية متعددة. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود أدوات تحليلية شاملة للكشف عن البروتينات على سطح العين ولأن أجزاء كثيرة من جينوم الأرانب غير مشروحة ، فهي محدودة للتحقيقات20,21.
بالإضافة إلى ذلك ، لم تقدم هذه النماذج الحيوانية المستخدمة للتحقيق في التسبب في مرض جفاف العين تفاصيل كافية لتحليل الذراع المناعي للاضطراب الذي يحرض على التهاب سطح العين. وفقا لذلك ، أظهر نموذج الفئران من MGD الذي طوره Reyes et al. وجود ارتباط بين مرض حساسية العين في الفئران و MGD في البشر وسلط الضوء على المسببات المناعية المسؤولة عن MGD21 الانسدادي. يربط هذا النموذج مرض العين التحسسي باستجابة TH17 التي تجند العدلات إلى الملتحمة والجفن ، مما يسبب MGD والتهاب العين المزمن21. يعد تحريض MGD والتهاب العين في نموذج الفئران هذا أداة قيمة للتحقيق في أحداث المنبع أثناء تطور الالتهاب الموضعي المدفوع باستجابة مناعية مستمرة21. يصف البروتوكول الحالي التهاب سطح العين المصحوب ب MGD الانسدادي. في هذه الطريقة ، يتم تحصين الفئران ، وبعد 2 أسابيع ، يتم تحديها على سطح العين مع المناعة لمدة 7 أيام. علاوة على ذلك ، يتم وصف خطوات عزل إفرازات العين وأعضاء العين المرتبطة بها أثناء الالتهاب الحاد وتشريح القرنية والملتحمة والجفون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بشأن رعاية الحيوان ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوان بجامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورمبرغ (FAU) (رقم التصريح: 55.2.2-2532-2-1217). تم استخدام إناث C57Bl / 6 الفئران ، الذين تتراوح أعمارهم بين 7-9 أسابيع للدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) والاحتفاظ بها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض مع دورات 12 ساعة ليلا ونهارا.
1. تحريض التهاب سطح العين الفئران
- أداء إعداد المناعي للتحصين.
- تحضير المستمناع طازجا في يوم التحصين ، وخلط البومين البيضاوي (OVA ، 50 مجم / مل) وسم السعال الديكي (100 ميكروغرام / مل) في محلول ملحي وهيدروكسيد الألومنيوم المساعد (40 مجم / مل) (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1.
تنبيه: قم بإجراء الفتح وإعادة التكوين وإعداد المناعة لسم السعال الديكي في خزانة أمان رقائقي. ارتداء ملابس واقية وتجنب أي اتصال مع الجلد. - احتضان الخليط المناعي والمساعد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وقم بتحميل 100 ميكرولتر في حقنة سعة 1 مل.
- إجراء الحقن داخل الصفاق من محلول immunogen في الماوس غير مخدر.
- أمسك الماوس بهدوء من الذيل أثناء الإمساك بشبكة القفص. أمسك جلد الظهر ومنطقة الرقبة بإحكام بين الإبهام والسبابة وثبت الذيل والأطراف السفلية بين الخاتم والإصبع الصغير على راحة اليد.
- حافظ على الماوس الثابت ورأسه لأسفل.
- حقن 100 ميكرولتر من محلول المناعة المحضر في الربع الأيمن أو الأيسر من تجويف البطن السفلي.
- تحضير المستمناع طازجا في يوم التحصين ، وخلط البومين البيضاوي (OVA ، 50 مجم / مل) وسم السعال الديكي (100 ميكروغرام / مل) في محلول ملحي وهيدروكسيد الألومنيوم المساعد (40 مجم / مل) (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1.
- أداء تحدي سطح العين 2 أسابيع بعد التحصين.
- تخدير الماوس باستخدام إيزوفلوران (2.5٪).
- ضع 5 ميكرولتر من OVA (50 مجم / مل) أو محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) لكل عين على كلتا العينين وانتظر حتى تمتص العين القطرة. هذا يستغرق ~ 5 دقيقة.
- كرر الإجراء 1x يوميا لمدة 7 أيام.
ملاحظة: يمكن أن يتم الإعطاء الموضعي للأدوية بنفس الطريقة.
2. جمع إفرازات العين
- استرجع الإفرازات العينية التي تشكلت خلال مرحلة التحدي عن طريق وضع 50 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم على العين مباشرة بعد التحدي.
- للحصول على معلق أحادي الخلية ، عالج تفريغ العين المجمع باستخدام MNase المؤتلف (2 × 106 هلام U / مل ، انظر جدول المواد) الذي يحتوي على العامل المساعد الكالسيوم (5 مليمول) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- عزل المادة الطافية وقياس السيتوكينات والكيموكينات باستخدام ELISA المتعدد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن استخدام المادة الطافية التي تم الحصول عليها لتحليل البروتين والحبيبات للمقايسات الوظيفية مثل التنميط المناعي ، البلعمة ، التحلل ، والتعبير الجيني.
3. استئصال أنسجة سطح العين
- قم بتشريح الجفون وكرة العين باتباع الخطوات أدناه.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق اختناق CO2 وخلع عنق الرحم.
- ضع الماوس على سطح مستو.
- تطهير المنطقة المدارية حول العين بمسحة مشربة بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
- قم بعمل شق بين الأذن والجيب الحجاجي الخلفي وعلى طول السطح فوق العظم الحرشفية عموديا ، مع تمديد الشق أفقيا أسفل الجفن السفلي على طول عظم الفك العلوي وفوق الجفن العلوي على طول العظم الجبهي. هذا يشكل شقا حول العين (الشكل 1).
- أمسك الأنسجة المشرحة بعناية حول العين باستخدام ملقط منحني واسحب المنديل ومقلة العين للخارج.
- ضع الأعضاء المستأصلة في PBS معقمة.
- قم بقص أنسجة عضلات الوجه الزائدة حول الجفون العلوية المستأصلة باستخدام مشرط وتحت المجهر المجسم.
- اجمع الملتحمة باتباع الخطوات أدناه.
- ضع الجفن العلوي على طبق بتري جاف تحت المجهر المجسم.
- باستخدام ملاقط دقيقة ومشرط ، قشر الطبقة المخاطية البيضاء بلطف شديد من السطح الداخلي للجفن.
- بعد ذلك ، قم بتشريح القرنية باتباع الخطوات أدناه.
- ضع كرة العين على طبق بتري جاف جديد فوق الثلج الجاف لمدة 3 دقائق.
- خذ طبق بتري على سطح المقعد في وضع ثابت.
- قم بعمل شق صغير على حدود القرنية بجوار الحافة باستخدام مقص حاد ناعم.
- إطالة الشق بالمشرط حول كرة العين ، وفصل الصلبة عن القرنية.
- قم بإزالة بقايا القزحية والعدسة من مؤخرة القرنية عن طريق التنظيف بسخاء بمحلول ملحي.
4. توثيق انسداد غدة ميبوميان (MG)
- لتقييم MG وفتحاته ، ضع الجفون المستأصلة في وضع رأسي تحت المجهر المجسم (الشكل 2).
- التقط الصور باستخدام الإضاءة الفائقة للضوء الأبيض وفقا لوقت تعريض الكاميرا وإعدادات ISO.
ملاحظة: يوفر التحليل المورفومتري لهذه الصور قياسا كميا موثوقا لحجم السدادة عند مخرج الغدد. يمكن إجراء القياس الكمي عن طريق تحديد سدادات العين باستخدام أداة العصا وتنفيذ أمر "تحليل الجسيمات" لبرنامج Image J (انظر جدول المواد).
5. تضيء الجفون (مورفولوجيا غدة ميبوميان)
- لتقييم منطقة MG ، ضع الجفون المستأصلة في وضع أفقي وقم بتشغيل الإضاءة الخلفية للمجهر المجسم المجهز بكاميرا الأشعة تحت الحمراء (الشكل 3).
- التقط الصور عن طريق ضبط وقت التعريض الضوئي وفقا لمعيار ISO الخاص بالكاميرا (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن أن يساعد التصوير بالأشعة تحت الحمراء لهذه الجفون المضيئة تحت المجهر المجسم في قياس شكل وحجم كل أسيني. يوفر التحليل المورفومتري لهذه الصور قياسا كميا موثوقا لحجم وعدد MG. يمكن إجراء القياس الكمي عن طريق تحديد MG باستخدام أداة العصا وتنفيذ أمر "تحليل الجسيمات" لبرنامج Image J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول الحالي الخطوات المتسلسلة لإنشاء نموذج الفئران لالتهاب سطح العين. تهدف البروتوكولات إلى إظهار كيفية تطبيق العلاجات محليا ، والحصول على إفرازات العين ، واستئصال الأعضاء الملحقة المرتبطة بها مثل الجفون السليمة والملتهبة (الشكل 2) ، والقرنية ، والملتحمة. يجب الانتباه عند تشريح الجفون العلوية لعزل الملتحمة ، ويجب تخزينها في 1x PBS أثناء تشريح القرنية. هذا سيمنع تجفيف الملتحمة ، والتي يمكن استخدامها للدراسات النسيجية والحركية الدوائية والتعبير الجيني.
تم تطبيق OVA والمحلول الملحي موضعيا لمدة 7 أيام متتالية وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه. أظهرت الفئران التي تم تحديها موضعيا بالمحلول الملحي سطحا صحيا للعين بعيون مفتوحة على مصراعيها ونمط وميض منتظم. ومع ذلك ، تم التحريض على التهاب العين في الفئران C57BL / 6J المحصنة التي تم تحديها مع OVA. تسبب تقطير محلول OVA على سطح العين في الحكة ، وليس الألم ، لأول 2 ساعة بعد التقطير. لوحظت الأكزيما الافرازية والجفن فقط خلال آخر 3 أيام من مرحلة التحدي. لم يكن هناك ألم واضح ، والحكم على سلوك الحيوانات. لذلك ، تم افتراض مستوى معتدل من الإجهاد للفئران خلال فترة زمنية قصيرة. أثار تحدي OVA اليومي مظاهر سريرية مثل إفرازات العين الوفيرة ، والتسمم الكيميائي ، والفتح الضيق للعينين. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يلتصق الجفون العلوية والسفلية ببعضهما البعض ، مما يضعف الوظيفة الأساسية للوميض (الشكل 2). تم اتباع معايير الانقطاع الصارمة (الملف التكميلي) لهذا النموذج وتمت الموافقة عليها من قبل المجلس الأخلاقي المحلي للتجارب على الحيوانات. تم تنفيذ الانقطاع الفوري إذا وصل فأر واحد إلى 15 نقطة في أي وقت.
ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
بعد القتل الرحيم ، تم استئصال أعضاء العين ولوحظ عند تكبير أعلى. أظهرت الجفون المستأصلة تحت المجهر انسدادات كبيرة تسد فتحات MG والوذمة ، في تناقض صارخ مع الجفون الصحية التي تظهر سدادات صغيرة من الغدة المبطنة للجفن (الشكل 3).
يكشف الفحص الإضافي لإضاءة الغدة بالأشعة تحت الحمراء عن المظهر الراسيمي لأسيني MG. هذا يسمح بتحديد غدد ميبوميان المرئية (المشار إليها باللون الأحمر). أظهرت الجفون من الفئران التي تحدت المحلول الملحي أسيني مستديرة تشكل MG. وبالمقارنة ، أدى تطبيق OVA إلى تدمير وفقدان بعض MG في الفئران المصابة بمرض حساسية العين (AED ، الشكل 4). أظهر التحليل النسيجي للجفون MG متوسعة مقارنة بالفئران الساذجة التي تم إعطاؤها بمحلول ملحي فقط لمدة 7 أيام (الشكل 5) ، مما يسمح بتراكم العدلات التي تنتج aggNETs التي تسد أخيرا فتحات الغدة.
يمكن أن يكون فصل القرنية عن صلبة العين مرهقا بسبب السطح المخاطي الزلق لكرة العين. يسمح احتضان مقلة العين على الثلج الجاف في طبق بتري لمدة 3 دقائق بتثبيت العين ، وإجراء شق صغير في الحافة ، وتشريح القرنية (الشكل 6).
سهلت الخطوات المدرجة في قسم البروتوكول جمع القرنية والملتحمة. بالإضافة إلى ذلك ، تسببت الإدارة المحلية ل OVA في التهاب شديد في الملتحمة ، مع ظهور فرط الدم (الشكل 7).
يكشف تحليل الإفرازات العينية عن الآليات الجزيئية في تطوير MGD. أظهر قياس السيتوكين والكيموكين كما هو موصوف مستويات مرتفعة من الكيموكين الرئيسي الذي يسهل تسرب العدلات والبلعمة والتحلل (CXCL-1) في المواد الطافية من الفئران بقيمة8 دراهم إماراتية. بالإضافة إلى ذلك ، كان الوسيط الرئيسي لاستجابة المرحلة الحادة وإنتاج العدلات ، IL-6 ، مرتفعا بشكل ملحوظ في الفئران المصابة ب AED. من ناحية أخرى ، لم يظهر تركيز IL-10 ، وهو سيتوكين مضاد للالتهابات ، أي تغييرات كبيرة في كل من الفئران الساذجة و AED (الشكل 8).
الشكل 1: استئصال أنسجة الوجه المحيطة بالمنطقة المدارية. يشار إلى درب شق باللون الأحمر. وهذا يسمح باستئصال أعضاء العين والتحقيق في تأثير وآثار مختلف العلاجات التي تدار موضعيا على أعضاء العين الملحقة مثل الملتحمة والقرنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تسبب إدارة OVA المظاهر السريرية ل MGD . (أ) تظهر الفئران التي تم إعطاؤها محلول ملحي سطحا صحيا للعين مع عيون مفتوحة على مصراعيها. (ب) يؤدي تطبيق OVA إلى التهاب شديد في سطح العين ، وفتح ضيق للعينين ، وعلامات الكيمياء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: سدادات قنوية تعيق غدد ميبوميان (MG) الموجودة على طول الجفون. (أ) صورة ماكرو تمثيلية لجفن صحي دون إفرازات مفرطة للعين من محلول ملحي يتناوله الفأر لمدة 7 أيام فقط. (ب) جفن يظهر انسدادات قنوية كبيرة في MG وذمة بعد فترة التحدي. شريط المقياس = 300 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: يتيح التصوير الكلي المضيء للتصوير الماكرو تصور أسيني MG (الخطوط الحمراء). (أ) تعزيز مستويات الأشعة تحت الحمراء يصور العنيبيات الصحية للفئران الساذجة ويكشف النقاب عن العنيبيات المميزة على شكل جيب في الجفون الصحية. (ب) تظهر العنيبة سميكة في جفون الفئران المصابة مع تطبيق OVA. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: يظهر التحليل النسيجي للجفون قنوات متوسعة من MG في الفئران مع إهانة OVA المتكررة لمدة 7 أيام . (أ) تظهر جفون الفأر الساذجة عدم وجود أي قنوات متوسعة ، تصور عضوا عينيا يعمل بصحة جيدة (B) على عكس الفئران المصابة بتحدي OVA. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: شق في القرنية بجانب الحافة وانفصال القرنية عن الصلبة. صورة لمقلة العين تظهر نقطة الشق (يشار إليها بسهم أبيض). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: الإدارة المحلية ل OVA . (أ) صور فوتوغرافية ماكرو لأعضاء عين الفئران تظهر القرنية. شريط المقياس: 600 ميكرومتر. (ب) الملتحمة الملتهبة من الفئران التي تم تحديها مع OVA. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: قياس علامات الالتهاب في إفرازات العين المجمعة. التحليل الكمي للسيتوكينات والكيموكينات في طاف الإفرازات العينية بالطرد المركزي للفئران الساذجة (ن = 7) والفئران مع MGD (ن = 8). يتم التعبير عن البيانات كوسيط بنطاق 5٪ -95٪. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار Mann-Whitney U ثنائي الذيل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإفراز الدهني لغدد ميبوميان له أهمية كبيرة للعين السليمة22. ومع ذلك ، فإن انسداد هذه الغدد الدهنية بواسطة مصائد العدلات المجمعة خارج الخلية (aggNETs) التي تصطف كخيوط متوازية تقع على الصفائح الرصغية لكلا الجفنين يمكن أن يعطل الفيلم المسيل للدموع23. يؤدي هذا الاضطراب إلى خلل في غدة ميبوميان (MGD)1 وتبخر مسيلة للدموع وظروف تلف سطح العين2. يصف هذا البروتوكول إنشاء التهاب سطح العين بوساطة المناعة الذي يؤدي إلى انسداد MG.
أكدت الدراسات التي أجريت على نماذج الفئران الآليات الكامنة بوساطة المناعة التي تسبب انسداد MG المرتبط بالتهاب سطح العين. تشير استجابة TH17 القوية التي تجند العدلات في نموذج الفأر من AED وزيادة في العدلات والخلايا النخاعية الأخرى في السائل المسيل للدموع للمرضى الذين يعانون من MGD إلى دور العدلات التي تعيق MG21. تم تأكيد وجود aggNETs التي تسد فتحات MG مع الببتيديل أرجينين ديميناز 4 في الفئران مع AED. في هذا النموذج ، أظهرت العدلات قدرة متناقصة على تجميع وتشكيل aggNETs التي أعاقت قنوات وفتحات الغدد MG10. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل المسيل للدموع من المرضى الذين يعانون من MGD زيادة في السموم المفرطة C5a و chemokine IL-8 ، مما يدل على زيادة نشاط النظام المتمم وتدفق مرتفع من تسلل العدلات. أخيرا ، تؤكد الزيادة في مستوى السيتوكينات المرتبطة بالعديد من وظائف العدلات ، مثل IL-6 و IL-18 و MCP-1 / CCL-2 و MIG / CXCL9 ، على الموقع الرئيسي للعدلات في التسبب في MGD11.
حدوث MGD هو مساهم كبير في تطوير DED ، وفحص دور العناصر العديدة المشاركة في التسبب في مظاهر العين أمر معقد24. لذلك ، يتأثر اختيار الحيوانات كنماذج بشدة بالسؤال قيد التحقيق. على سبيل المثال ، تعمل الأرانب كنماذج تقليدية للاختبار الصيدلاني للتركيبات ؛ نماذج القطط والخنازير والكلاب مناسبة للتحقيق في الخصائص المرضية المشابهة للمرضى من البشر ، والفئران مناسبة في المقام الأول للتلاعب الجيني25.
النماذج الحيوانية هي أدوات قيمة للتحقيق في التسبب في المرض وفحص الفعالية العلاجية لمختلف التدخلات في الجسم الحي. على سبيل المثال ، تشمل العلاجات التقليدية إدارة تقطير قطرة العين لعلاج مظاهر العين السريرية. ومع ذلك ، بسبب تدفق المسيل للدموع ونظام التصريف الدمعي ، تتم إزالة هذه التدخلات العينية بسرعة من سطح العين. هذا يسبب فقط إجراء مؤقت ويتطلب إدارات متكررة وجرعات عالية. لحل هذه المشكلة ، كان نموذج الأرنب لمرض جفاف العين (DED) بمثابة الوسيلة المثالية لفحص الهلاميات الحرارية والهلام النانوي المتفحم (CNGs) كعلاجات موضعية بديلة. تتحول الهلاميات الحرارية التي يتم الحصول عليها عن طريق اقتران درجات مختلفة من كبريتات حمض الهيالورونيك وبولي منتهي بالأمين (N-isopropyl acrylamide) ، عند إعطائها للعين ، إلى هلام. في نموذج الأرنب من DED ، تم الاحتفاظ بهذا الجل لفترة أطول ، وقامت قطرة واحدة بإصلاح القرنية التالفة ، وتوقف موت الخلايا المبرمج ، والتهاب العين المكبوت خلال متابعة لمدة 7 أيام ، مما يشير إلى انقطاع في تسلل الكريات البيض بسبب تثبيط تفاعل الكريات البيض بوساطة selectin26.
علاوة على ذلك ، في نموذج الأرانب من DED ، أظهرت الهلاميات النانوية المتفحمة (CNGs) كقطرات للعين كسح الجذور الحرة لعلاج نقص الدموع والتبخر المفرط للدموع الناجم عن تفاقم الاستجابة الالتهابية والإجهاد التأكسدي. تم الحصول على CNGs عن طريق الانحلال الحراري لهيدروكلوريد الليسين (Lys-CNGs) وإدارتها ، وخففت جرعة واحدة من أعراض DED في غضون 4 أيام. كان من الممكن تحقيق تأثير علاجي مماثل فقط من خلال العديد من العلاجات لكمية أعلى بمقدار 10 أضعاف من تقطير قطرة العين السيكلوسبورين أ. أظهرت هذه التدخلات الصيدلانية الجديدة المتوافقة حيويا وجهات نظر متفوقة كتدخلات جرعة واحدة واحتباس أكثر امتدادا للعين في النماذج الحيوانية قبل السريرية27.
كشفت الضربة القاضية للعديد من الجينات في نماذج الفئران عن دور البروتينات المتعددة المشاركة في التسبب في MGD. على سبيل المثال ، يؤدي التعبير الجيني غير المنظم لمستقبلات غاما المنشطة لتكاثر البيروكسيسوم (PPAR γ)24 والتغيرات في مسار الإشارات إلى إحداث تغييرات في دخول / تكاثر دورة الخلية ، وتخليق الدهون ، وضمور غدة ميبوميان أثناء الشيخوخة13. بالإضافة إلى ذلك ، أشار غياب βENaC (قناة الصوديوم الظهارية β) في نموذج الفئران إلى أن النمط الظاهري لخلل MG السائد في الإناث كان مرتبطا بضمور MG وانسداد الفتحة كما هو الحال في البشر المصابين بنقص الألدوستيرونية الكاذب 1 (PHA) 28. تم توضيح الدور الأساسي ل CD147 أيضا في الفئران ، ويعتقد أنه يحافظ على المحتوى الدهني الغني للخلايا المتوسطة29. أظهرت الفئران التي تعاني من نقص في إنزيم ديسموتاز 1 ارتفاعا في الدهون المؤكسدة وتلف الحمض النووي ، والذي كان مرتبطا بزيادة التهاب MG30. أخيرا ، تؤدي طفرة واحدة في ELOVL4 تشفر الإنزيم المطلوب لتوليف بقايا الأحماض الدهنية طويلة السلسلة للغاية التي تشكل ميبوم ليبدوم إلى تغييرات وظيفية في سطح العين الأمامي31. ومن المثير للاهتمام ، تم تحفيز MGD أيضا في الفئران مع اتباع نظام غذائي خاص مع تكوين الدهون غير مكتملة لتقييم الفعالية العلاجية للأزيثروميسين كصيغة العيون32.
في حين أن معظم الدراسات التي تستخدم نماذج الفئران قد حددت العديد من الجينات المشاركة في MGD ، فإن العديد منها يفتقر إلى حالة مناعية كامنة. يوفر نموذج AED مجموعة كاملة من التدخلات الممكنة من تحريض الاستجابة المناعية ، وتوليد الأجسام المضادة IgE ، ومرحلة المستجيب ، مصحوبة بالعديد من التغيرات المرضية التي تشبه MGD التبخيري البشري.
عند التحقيق في MGD باستخدام البروتوكول المذكور ، من الأهمية بمكان إضافة مناعي (OVA وسم السعال الديكي) إلى الشب بنسبة 1: 1. يجب على المرء احتضان المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل امتصاص جيد لسم السعال الديكي البيضاوي إلى الشب. هذه التفاعلات حيوية لتحفيز استجابة مناعية كافية. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء التحصين ، يجب الانتباه أثناء الحقن ، لأن هذا قد يؤدي إلى ثقب الأعضاء الأساسية في التجويف البريتوني. قد يؤدي هذا إلى عدم كفاية التحصين والتهاب جهازي في الفأر ، مع تأثيرات عميقة على الاستجابة المناعية.
الإفرازات العينية عبارة عن هياكل كروماتين كبيرة خارج الخلية تشبه الشبكة وتتسلل إلى الخلايا المناعية. لذلك ، فإن علاج MNase للإفرازات العينية المجمعة من هذا النموذج أمر حيوي للحصول على معلقات أحادية الخلية11. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل جمع هذه الإفرازات على سطح العين وهي مصدر للعدلات القابلة للحياة التي انتقلت من الدورة الدموية. القيد الرئيسي لهذه التقنية هو كمية الإفرازات التي سيتم جمعها من أسطح العين. تسمح إضافة 50 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى كل عين باستعادة ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الإفرازات من فأر واحد. هذا بالكاد يكفي ل 1-2 تلطيخ قياس التدفق الخلوي (FACS) والطاف للدراسات الكيميائية الحيوية.
غالبا ما يتسبب التشريح باستخدام مشرط لانتزاع العين والأنسجة المحيطة بها لاحقا في إصابة الوريد الصدغي السطحي أو الوريد الجفني السفلي أو الوريد بزاوية العين. ينصح بإنشاء شق في الجلد بعمق أقل حول العين لأن النزيف يمكن أن يتداخل مع المزيد من الاستعدادات النسيجية. أثناء تشريح أحد الأنسجة ، يعد تخزين الأنسجة الأخرى في برنامج تلفزيوني أمرا ضروريا لأن التجفيف أو التشحيم غير الكافي يمكن أن يؤدي إلى فقدان السمات الهيكلية.
أثناء تشريح القرنية من كرة العين ، إذا كانت حضانة كرة العين على الثلج الجاف لا تمكن من التحكم الثابت ، يمكن للمرء تمديد الوقت إلى ما يصل إلى 5 دقائق بحيث يكون الشق في الحافة وفصل القرنية ممكنا.
التطبيقات المحتملة
التهاب سطح العين المرتبط ب MGD هو مرض متعدد العوامل. يمكن أن يحدث تطور وتطور الخلل الوظيفي في هذه الغدد المفرزة للدهون بسبب عوامل العيون والجهازية والهرمونية والوراثية والمواد الكيميائية والأدوية والعوامل الضارة الميكانيكية والاستجابات المناعية33. أبلغت العديد من الدراسات عن وجود عدلات تسبب انسداد غدد ميبوميان والتهاب11،21،34،35،36،37،38. يمكن أن يوفر تطوير التدخلات الموضعية والجهازية المضادة للالتهابات التي تتداخل مع هذه المسارات المناعية الراحة للمرضى الذين يعانون من عدم الراحة في العين بسبب MGD. يمكن استخدام نموذج الفئران لمرض العين التحسسي في بيئة ما قبل السريرية للتحقيق في الخصائص الدوائية والديناميكية الدوائية لهذه العوامل. يتيح نموذج المرض هذا تطوير استراتيجيات مناسبة لمعالجة MGD ويساعد على تحديد الإدارة السليمة للعوامل المضادة للالتهابات الموضعية أو الجهازية التي تستهدف المكونات الحيوية في المسارات المسببة للأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3 ؛ SCHA 2040 / 1-1 ؛ MU 4240 / 2-1 ؛ CRC1181 (C03) ؛ TRR241 (B04) ، H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878 ، وبواسطة Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) إلى MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
