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Immunology and Infection

ओकुलर सतह सूजन का प्रेरण और शामिल ऊतकों का संग्रह

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/63890
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Internal Medicine 3-Rheumatology and Immunology, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen, 2Deutsches Zentrum für Immuntherapie, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg and Universitätsklinikum Erlangen

Summary

ओकुलर सतह की सूजन ओकुलर सतह के ऊतकों को नुकसान पहुंचाती है और आंख के महत्वपूर्ण कार्यों से समझौता करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल ओकुलर सूजन को प्रेरित करने और मेबोमियन ग्रंथि शिथिलता (एमजीडी) के माउस मॉडल में समझौता किए गए ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

नेत्र संबंधी सतह रोगों में विकारों की एक श्रृंखला शामिल है जो कॉर्निया, नेत्रश्लेष्मला और संबंधित ओकुलर सतह ग्रंथि नेटवर्क के कार्यों और संरचनाओं को परेशान करती है। मेबोमियन ग्रंथियां (एमजी) लिपिड का स्राव करती हैं जो एक आवरण परत बनाती हैं जो आंसू फिल्म के जलीय हिस्से के वाष्पीकरण को रोकती है। न्यूट्रोफिल और बाह्य डीएनए जाल एलर्जी आंखों की बीमारी के माउस मॉडल में एमजी और ओकुलर सतह को आबाद करते हैं। समेकित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एजीएनईटी) बाह्य क्रोमैटिन से बना एक जाल जैसा मैट्रिक्स तैयार करता है जो एमजी आउटलेट और एमजी डिसफंक्शन की स्थिति को रोकता है। यहां, ओकुलर सतह सूजन और एमजी डिसफंक्शन को प्रेरित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। ओकुलर सतह से संबंधित अंगों को इकट्ठा करने की प्रक्रियाएं, जैसे कॉर्निया, नेत्रश्लेष्मला और पलकें, विस्तार से वर्णित हैं। प्रत्येक अंग को संसाधित करने के लिए स्थापित तकनीकों का उपयोग करते हुए, एमजी डिसफंक्शन की प्रमुख रूपात्मक और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं को भी दिखाया गया है। ओकुलर एक्स्यूडेट्स ओकुलर सतह की भड़काऊ स्थिति का आकलन करने का अवसर प्रदान करते हैं। ये प्रक्रियाएं प्रीक्लिनिकल स्तर पर सामयिक और प्रणालीगत विरोधी भड़काऊ हस्तक्षेप की जांच को सक्षम करती हैं।

Introduction

पलक झपकना कॉर्निया पर बिखरे हुए चिकनी आंसू फिल्म को फिर से भर देता है। ओकुलर सतह एपिथेलिया ओकुलर सतह पर आंसू फिल्म के वितरण और सही अभिविन्यास की सुविधा प्रदान करता है। म्यूसिन को कॉर्निया और नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रदान किया जाता है ताकि आंखों की सतह पर लैक्रिमल ग्रंथियों से आने वाली आंसू फिल्म के जलीय भाग को स्थिति में मदद मिल सके। अंत में, एमजी लिपिड का स्राव करता है जो एक कवर परत बनाता है जो आंसू फिल्म 1,2,3 के जलीय भाग के वाष्पीकरण को रोकता है। इस तरह, सभी ओकुलर अंगों के समन्वित कार्य ओकुलर सतह को हमलावर रोगजनकों या चोट से बचाते हैं और किसी भी दर्द या असुविधा के बिना क्रिस्टल स्पष्ट दृष्टि का समर्थन करते हैं।

एक स्वस्थ ओकुलर सतह में, ओकुलर फ्लोइंग डिस्चार्ज या आंखों की गठिया धूल, मृत उपकला कोशिकाओं, बैक्टीरिया, बलगम और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दूर करती है। समेकित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एजीएनईटी) बाह्य क्रोमैटिन से बना एक जाल जैसा मैट्रिक्स तैयार करते हैं और इन घटकों को आंखों के गठिया में शामिल करते हैं। एजीजीएनईटी प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकाइन्स के प्रोटियोलिटिक क्षरण द्वारासूजन को हल करते हैं। हालांकि, जब वे निष्क्रिय हो जाते हैं, तो ये असामान्य एग्जेएनईटी कोविड-195, पित्त पथरी6 और सियालोलिथियासिस7 में संवहनी अवरोधन जैसी बीमारियों के रोगजनन को चलाते हैं। इसी तरह, ओकुलर सतह पर एजीएनईटी एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाते हैं और अत्यधिक उजागर सतह 8 की सूजन को हल करने में योगदान करतेहैं। या तो एक अतिरंजित गठन या ओकुलर सतह में एजीएनईटी की कमी आंसू फिल्म स्थिरता को खराब कर सकती है और / या कॉर्नियल घावों, नेत्रश्लेष्मलाशोथ और सूखी आंख की बीमारी का कारण बन सकती है। उदाहरण के लिए, एमजी की रुकावट सूखी आंख की बीमारी का एक प्रमुख कारण है। एजीजीएनईटी को एमजी की नलिकाओं से लिपिड स्राव के प्रवाह को प्लग करने और मेबोमियन ग्रंथि शिथिलता (एमजीडी) का कारण बनने के लिए भी जाना जाता है। एजीजीएनईटी द्वारा एमजी छिद्रों की भीड़ ओकुलर सतह और प्रतिगामी बोतलबंद तरल पदार्थ को ढंकने वाले फैटी द्रव की कमी का कारण बनती है, जिसके परिणामस्वरूप ग्रंथि समारोह की शिथिलता और एसिनार क्षति होती है। इस शिथिलता के परिणामस्वरूप आंसू फिल्म वाष्पीकरण, पलकों पर मार्जिन का फाइब्रोसिस, आंखों की सूजन और एमजी10,11 को हानिकारक नुकसान हो सकता है।

मनुष्यों में एमजीडी की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया की नकल करने के लिए वर्षों से कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, 1 वर्ष की आयु के सी 57बीएल / 6 चूहों ने सूखी आंख रोग (डीईडी) और एमजीडी पर उम्र से संबंधित प्रभावों का अध्ययन करने में मदद की है, जो 50 वर्ष औरउससे अधिक उम्र के रोगियों में ओकुलर रोग विकृति को दर्शाता है। इसके अलावा, खरगोश औषधीय हस्तक्षेप के प्रभावों की जांच के लिए उपयुक्त मॉडल हैं। इसलिए, खरगोशों में एमजीडी को प्रेरित करने की सूचना या तो एपिनेफ्रीन के सामयिक प्रशासन या 13-सीआईएस-रेटिनोइक एसिड (आइसोट्रेटिनॉइन) 15,16,17,18,19 के प्रणालीगत परिचय द्वारा दी गई है।

यद्यपि ये पशु मॉडल एमजीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान देने वाले विभिन्न कारकों को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त थे, वे उनके उपयोग में प्रतिबंधित थे। उदाहरण के लिए, उम्र से संबंधित एमजीडी का मुराइन मॉडल केवल पुराने वयस्कों में तत्वों को समझने के लिए आदर्श था, और इसलिए, खरगोश ओकुलर सतह रोगों का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त पशु मॉडल प्रतीत होते हैं, क्योंकि वे कई पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र की जांच को सक्षम करते हैं। हालांकि, ओकुलर सतह पर प्रोटीन का पता लगाने के लिए व्यापक विश्लेषणात्मक उपकरणों की कमी के कारण और क्योंकि खरगोश जीनोम के कई हिस्से अननोटेटेड हैं, वे जांच के लिए सीमित हैं20,21।

इसके अलावा, सूखी आंख की बीमारी के रोगजनन की जांच करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इन पशु मॉडलों ने विकार के प्रतिरक्षात्मक हाथ का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त विवरण प्रदान नहीं किया जो ओकुलर सतह की सूजन को उकसाता है। तदनुसार, रेयेस एट अल द्वारा विकसित एमजीडी के मुराइन मॉडल ने चूहों में एलर्जी आंखों की बीमारी और मनुष्यों में एमजीडी के बीच एक संबंध दिखाया और प्रतिरोधी एमजीडी21 के लिए जिम्मेदार प्रतिरक्षा एटियलजि पर प्रकाश डाला। यह मॉडल एलर्जी आंखों की बीमारी को टीएच 17 प्रतिक्रिया के साथ जोड़ता है जो न्यूट्रोफिल को नेत्रश्लेष्मला और पलक में भर्ती करता है, जिससे एमजीडी और पुरानी ओकुलर सूजन21 होती है। इस मुराइन मॉडल में एमजीडी और ओकुलर सूजन का प्रेरण चल रही प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया21 द्वारा संचालित स्थानीय सूजन के विकास के दौरान अपस्ट्रीम घटनाओं की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। वर्तमान प्रोटोकॉल ऑब्सट्रक्टिव एमजीडी के साथ ओकुलर सतह सूजन का वर्णन करता है। इस विधि में, चूहों को प्रतिरक्षित किया जाता है और, 2 सप्ताह के बाद, 7 दिनों के लिए इम्यूनोजेन के साथ ओकुलर सतह पर चुनौती दी जाती है। इसके अलावा, तीव्र सूजन और कॉर्निया, नेत्रश्लेष्मला और पलकों के विच्छेदन के दौरान ओकुलर एक्स्यूडेट और संबंधित ओकुलर अंगों को अलग करने के चरणों का वर्णन किया गया है।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को पशु कल्याण पर संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और फ्रेडरिक-अलेक्जेंडर-यूनिवर्सिटी एर्लांगेन-नूर्नबर्ग (एफएयू) (परमिट संख्या: 55.2.2-2532-2-1217) के पशु कल्याण आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 7-9 सप्ताह की आयु के मादा सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें) और 12 घंटे दिन / रात चक्र के साथ विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था।

1. मुराइन ओकुलर सतह सूजन का प्रेरण

  1. टीकाकरण के लिए इम्यूनोजेन तैयारी करें।
    1. टीकाकरण के दिन इम्यूनोजेन को ताजा तैयार करें, अंडाकारबुमिन (ओवीए, 50 मिलीग्राम / एमएल) और पर्टुसिस टॉक्सिन (100 μg / mL) को खारा में मिलाएं और सहायक एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड (40 मिलीग्राम / एमएल) ( सामग्री की तालिका देखें) को 1: 1 अनुपात में मिलाएं।
      चेतावनी: एक लामिनार सुरक्षा कैबिनेट में पर्टुसिस टॉक्सिन के उद्घाटन, पुनर्गठन और इम्यूनोजेन तैयारी करें। सुरक्षात्मक कपड़े पहनें और त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें।
    2. इम्यूनोजेन और सहायक मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 100 μL को 1 एमएल सिरिंज में लोड करें।
    3. एक गैर-एनेस्थेटाइज्ड माउस में इम्यूनोजेन समाधान का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन करें।
      1. पिंजरे ग्रिड को पकड़ते समय माउस को पूंछ से धीरे से पकड़ें। अंगूठे और तर्जनी के बीच पीठ और गर्दन के क्षेत्र की त्वचा को मजबूती से पकड़ें और हाथ की हथेली के खिलाफ अंगूठी और छोटी उंगली के बीच पूंछ और निचले अंगों को ठीक करें।
      2. स्थिर माउस को उसके सिर के साथ नीचे की ओर रखें।
      3. निचले पेट की गुहा के दाएं या बाएं चतुर्थांश में तैयार इम्युनोजेन समाधान के 100 μL इंजेक्ट करें।
  2. टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद ओकुलर सतह चुनौती करें।
    1. आइसोफ्लुरेन (2.5%) के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    2. दोनों आंखों पर प्रति आंख ओवीए (50 मिलीग्राम / एमएल) या खारा (0.9% एनएसीएल) का 5 μL लागू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि बूंद आंख द्वारा अवशोषित न हो जाए। इसमें ~ 5 मिनट लगते हैं।
    3. प्रक्रिया को 7 दिनों के लिए दैनिक 1x दोहराएं।
      नोट: दवाओं का सामयिक प्रशासन उसी तरह से किया जा सकता है।

2. ओकुलर एक्स्यूडेट्स का संग्रह

  1. चुनौती के तुरंत बाद आंखों में बाँझ खारा के 50 μL लागू करके चुनौती चरण के दौरान गठित ओकुलर एक्स्यूडेट्स को पुनर्प्राप्त करें।
  2. एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए, एकत्र किए गए ओकुलर डिस्चार्ज को पुनः संयोजक MNase (2 x 106 जेल U / mL, सामग्री की तालिका देखें) के साथ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोफ़ैक्टर कैल्शियम (5 mM) युक्त इलाज करें।
  3. कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. सुपरनैटेंट को अलग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार मल्टीप्लेक्स एलिसा का उपयोग करके साइटोकिन्स और केमोकाइन्स को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: प्राप्त सुपरनैटेंट का उपयोग प्रोटीन विश्लेषण के लिए किया जा सकता है और पेलेट का उपयोग इम्यूनोफेनोटाइपिंग, फागोसाइटोसिस, डीग्रानुलेशन और जीन अभिव्यक्ति जैसे कार्यात्मक परख के लिए किया जा सकता है।

3. ओकुलर सतह के ऊतकों का छांटना

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पलकों और आंखों के ग्लोब को विच्छेदित करें।
    1. सीओ2 श्वासावरोध और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
    2. माउस को एक समान सतह पर रखें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ गर्भवती स्वैब के साथ आंख के चारों ओर कक्षीय क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
    4. कान और रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस के बीच और स्क्वैमस हड्डी के ऊपर की सतह के साथ लंबवत रूप से एक चीरा लगाएं, जो कि मैक्सिलरी हड्डी के साथ निचली पलक के नीचे और ललाट की हड्डी के साथ ऊपरी पलक के ऊपर क्षैतिज रूप से चीरा का विस्तार करें। यह आंख के चारों ओर एक चीरा बनाता है (चित्रा 1)।
    5. घुमावदार बल का उपयोग करके आंख के चारों ओर विच्छेदित ऊतक को सावधानीपूर्वक पकड़ें और ऊतक और नेत्रगोलक को बाहर खींचें।
    6. उत्पादित अंगों को बाँझ पीबीएस में रखें।
    7. स्केलपेल का उपयोग करके और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे उत्पादित ऊपरी पलकों के आसपास अतिरिक्त चेहरे की मांसपेशियों के ऊतकों को ट्रिम करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए नेत्रश्लेष्मला एकत्र करें।
    1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे सूखी पेट्री डिश पर ऊपरी पलक रखें।
    2. बारीक चिमटी और एक स्केलपेल का उपयोग करके, पलक की आंतरिक सतह से सफेद-श्लेष्म परत को बहुत धीरे से छीलें।
  3. इसके बाद, नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कॉर्निया का विच्छेदन करें।
    1. 3 मिनट के लिए सूखी बर्फ के शीर्ष पर एक नए सूखे पेट्री डिश पर आंख ग्लोब रखें।
    2. पेट्री डिश को एक स्थिर स्थिति में बेंच की सतह पर ले जाएं।
    3. ठीक तेज कैंची का उपयोग करके लिम्बस के बगल में कॉर्निया की सीमा पर एक छोटा सा चीरा लगाएं।
    4. आंखों के ग्लोब के चारों ओर स्केलपेल के साथ चीरा को लंबा करें, स्क्लेरा को कॉर्निया से अलग करें।
    5. नमकीन घोल के साथ उदारतापूर्वक फ्लश करके कॉर्निया के पीछे से आईरिस और लेंस के अवशेषों को हटा दें।

4. मेबोमियन ग्रंथि (एमजी) रुकावट का प्रलेखन

  1. एमजी और इसके छिद्रों का आकलन करने के लिए, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के नीचे एक सीधी स्थिति में एक्साइज्ड पलकें रखें।
  2. कैमरे के एक्सपोज़र टाइम और आईएसओ सेटिंग्स के अनुसार व्हाइट लाइट एपि-इलुमिनेशन के साथ छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: इन छवियों का मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण ग्रंथियों के आउटलेट पर प्लग आकार का विश्वसनीय परिमाणीकरण प्रदान करता है। वंड टूल के साथ आंख प्लग को रेखांकित करके और इमेज जे सॉफ्टवेयर के "विश्लेषण कणों" कमांड को निष्पादित करके परिमाणीकरण किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।

5. पलकों का ट्रांसिल्युमिनेशन (मेबोमियन ग्रंथि आकृति विज्ञान)

  1. एमजी क्षेत्र का आकलन करने के लिए, उत्पादित पलकों को क्षैतिज स्थिति में रखें और इन्फ्रारेड कैमरे से लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की बैकलाइट चालू करें (चित्रा 3)।
  2. कैमरे के अनुसार एक्सपोज़र समय को समायोजित करके छवियों को कैप्चर करें ( सामग्री की तालिका देखें) आईएसओ।
    नोट: स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इन ट्रांसल्यूमिनेटेड पलकों की इन्फ्रारेड इमेजिंग प्रत्येक एसिनी के आकार और आकार को मापने में मदद कर सकती है। इन छवियों का मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण एमजी के आकार और संख्या का विश्वसनीय परिमाणीकरण प्रदान करता है। वांड टूल के साथ एमजी को रेखांकित करके और इमेज जे सॉफ्टवेयर के "विश्लेषण कणों" कमांड को निष्पादित करके परिमाणीकरण किया जा सकता है।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल ओकुलर सतह सूजन के एक मुराइन मॉडल की स्थापना के लिए अनुक्रमिक चरणों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह दिखाना है कि स्थानीय स्तर पर चिकित्सीय लागू कैसे करें, ओकुलर एक्स्यूडेट्स प्राप्त करें, और उत्पाद से जुड़े सहायक अंग जैसे स्वस्थ और सूजन वाली पलकें (चित्रा 2), कॉर्निया और नेत्रश्लेष्मला। ध्यान दिया जाना चाहिए जब ऊपरी पलकों को नेत्रश्लेष्मला के अलगाव के लिए विच्छेदित किया जाता है, और इसे कॉर्निया के विच्छेदन के दौरान 1x PBS में संग्रहीत किया जाना चाहिए। यह नेत्रश्लेष्मला के सूखने को रोक देगा, जिसका उपयोग हिस्टोलॉजिकल, फार्माकोकाइनेटिक और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

ओवीए और खारा को उपर्युक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए लगातार 7 दिनों के लिए शीर्ष पर लागू किया गया था। खारा के साथ शीर्ष पर चुनौती देने वाले चूहों ने चौड़ी खुली आंखों और नियमित रूप से पलक झपकने वाले पैटर्न के साथ एक स्वस्थ ओकुलर सतह दिखाई। हालांकि, ओवीए के साथ चुनौती देने वाले सी 57बीएल / 6 जे चूहों में ओकुलर सूजन को उकसाया गया था। ओकुलर सतह पर ओवीए समाधान के इंजेक्शन ने खुजली का कारण बना, न कि दर्द, इंजेक्शन के बाद पहले 2 घंटों के लिए। एक्स्यूडेट और पलक एक्जिमा केवल चुनौती चरण के अंतिम 3 दिनों के दौरान देखा गया था। जानवरों के व्यवहार को देखते हुए कोई दर्द स्पष्ट नहीं था। इसलिए, थोड़े समय में चूहों के लिए तनाव का एक मध्यम स्तर माना गया था। दैनिक ओवीए चुनौती ने प्रचुर मात्रा में ओकुलर डिस्चार्ज, केमोसिस और आंखों के संकीर्ण उद्घाटन जैसी नैदानिक अभिव्यक्तियों को ट्रिगर किया। इसके अलावा, ऊपरी और निचली पलकें अक्सर एक-दूसरे का पालन करती थीं, जिससे पलक झपकने का आवश्यक कार्य बिगड़ जाता था (चित्रा 2)। इस मॉडल के लिए सख्त रुकावट मानदंड (पूरक फ़ाइल) का पालन किया गया था और पशु प्रयोग के लिए स्थानीय नैतिक बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। तत्काल रुकावट तब की गई जब एक माउस किसी भी समय 15 बिंदुओं तक पहुंच गया।

अनुपूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इच्छामृत्यु के बाद, ओकुलर अंगों को एक्साइज किया गया और उच्च आवर्धन पर देखा गया। माइक्रोस्कोप के तहत उत्पादित पलकें एमजी और एडिमा के छिद्रों को प्लग करने वाले बड़े अवरोधों को दिखाती हैं, स्वस्थ पलकों के विपरीत जो पलक को अस्तर करने वाली ग्रंथि के छोटे प्लग दिखाती हैं (चित्रा 3)।

ग्रंथि के इन्फ्रारेड ट्रांसिल्युमिनेशन की आगे की जांच से एमजी के एसिनी की रेसमिक उपस्थिति का पता चलता है। यह दृश्यमान मेबोमियन ग्रंथियों (लाल रंग में इंगित) को निर्धारित करने की अनुमति देता है। खारा-चुनौती वाले चूहों की पलकों ने एमजी बनाने वाले गोल एसिनी को दिखाया। इसकी तुलना में, ओवीए के आवेदन ने एलर्जी आंखों की बीमारी (एईडी, चित्रा 4) के साथ चूहों में कुछ एमजी के विनाश और हानि को प्रेरित किया। पलकों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने 7 दिनों के लिए केवल खारा के साथ प्रशासित भोले चूहों की तुलना में पतला एमजी प्रदर्शित किया (चित्रा 5), जिससे एजीएनईटी का उत्पादन करने वाले न्यूट्रोफिल के संचय की अनुमति मिलती है जो अंततः ग्रंथि के छिद्रों को बाधित करती है।

आंखों के ग्लोब की फिसलन भरी श्लेष्म सतह के कारण आंख के श्वेतपटल से कॉर्निया को अलग करना बोझिल हो सकता है। 3 मिनट के लिए पेट्री डिश में सूखी बर्फ पर नेत्रगोलक को इनक्यूबेट करने से आंख को ठीक करने, लिंबस पर एक छोटा चीरा बनाने और कॉर्निया को विच्छेदित करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 6)।

प्रोटोकॉल अनुभाग में सूचीबद्ध चरणों ने कॉर्निया और नेत्रश्लेष्मला के संग्रह की सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, ओवीए के स्थानीय प्रशासन ने नेत्रश्लेष्मला को गंभीर सूजन दी, जिसमें हाइपरएमिक उपस्थिति थी (चित्रा 7)।

ओकुलर एक्स्यूडेट्स के विश्लेषण से एमजीडी के विकास में आणविक तंत्र का पता चलता है। जैसा कि वर्णित साइटोकिन और केमोकाइन परिमाणीकरण ने एईडी8 के साथ चूहों से सुपरनैटेंट में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रावेसन, फागोसाइटोसिस और डीग्रेनुलेशन (1) की सुविधा प्रदान करने वाले प्रमुख केमोकाइन के ऊंचे स्तर को दिखाया। इसके अलावा, तीव्र चरण प्रतिक्रिया और न्यूट्रोफिल उत्पादन, आईएल -6 का प्रमुख मध्यस्थ, एईडी के साथ चूहों में भी काफी ऊंचा था। दूसरी ओर, आईएल -10 की एकाग्रता, एक विरोधी भड़काऊ साइटोकिन, ने भोले और एईडी चूहों दोनों में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखाया (चित्रा 8)।

Figure 1
चित्र 1: कक्षीय क्षेत्र के आसपास चेहरे के ऊतकों का छांटना। चीरा निशान लाल रंग में इंगित किया गया है। यह ओकुलर अंगों को बाहर निकालने और नेत्रश्लेष्मला और कॉर्निया जैसे सहायक ओकुलर अंगों पर विभिन्न शीर्ष रूप से प्रशासित चिकित्सीय के प्रभाव और प्रभावों की जांच करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ओवीए प्रशासन एमजीडी के नैदानिक अभिव्यक्तियों का कारण बनता है( ए) खारा प्रशासित चूहे एक स्वस्थ ओकुलर सतह दिखाते हैं जिसमें आंखें खुली होती हैं। (बी) ओवीए आवेदन गंभीर ओकुलर सतह सूजन, आंखों के संकीर्ण उद्घाटन और केमोसिस के संकेतों को प्रेरित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: पलकों के साथ स्थित मेइबोमियन ग्रंथियों (एमजी) को बाधित करने वाले डक्टल प्लग। (ए) माउस से अत्यधिक ओकुलर डिस्चार्ज के बिना एक स्वस्थ पलक की प्रतिनिधि मैक्रो तस्वीर केवल 7 दिनों के लिए खारा प्रशासित। (बी) चुनौती अवधि के बाद एमजी और एडिमा के बड़े डक्टल अवरोधों को दिखाने वाली पलकें। स्केल पट्टी = 300 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसइल्युमिनेटिंग मैक्रोफोटोग्राफी एमजी की एसिनी (लाल रेखाओं) के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। (ए) इन्फ्रारेड स्तर को बढ़ाना भोले चूहों के स्वस्थ एसिनी की कल्पना करता है और स्वस्थ पलकों में अलग जेब के आकार की एसिनी का अनावरण करता है। (बी) ओवीए आवेदन के साथ चूहों की प्रभावित पलकों में एसिनी मोटी दिखाई देती है। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पलकों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण चूहों में एमजी की फैली हुई नलिकाओं को 7 दिनों के लिए बार-बार ओवीए अपमान के साथ दिखाता है। (ए) भोले माउस पलकें किसी भी पतला नलिकाओं की अनुपस्थिति दिखाती हैं, जो ओवीए चुनौती वाले चूहों के विपरीत एक स्वस्थ कार्यशील ओकुलर अंग (बी) को दर्शाती हैं। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: अंग के बगल में कॉर्निया पर चीरा और श्वेतपटल से कॉर्निया का पृथक्करण। चीरा के बिंदु को दिखाने वाली नेत्रगोलक की छवि (सफेद तीर द्वारा इंगित)। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: ओवीए का स्थानीय प्रशासन(ए) कॉर्निया को दिखाने वाले मुराइन ओकुलर अंगों की मैक्रो तस्वीरें। स्केल बार: 600 μm. (B) ओवीए के साथ चुनौती दिए गए चूहों से सूजन नेत्रश्लेष्मला। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एकत्र किए गए ओकुलर एक्स्यूडेट्स में भड़काऊ मार्करों का माप। भोले चूहों (एन = 7) और एमजीडी (एन = 8) वाले चूहों के सेंट्रीफ्यूज्ड ओकुलर एक्स्यूडेट के सुपरनैटेंट में साइटोकिन्स और केमोकाइन्स का मात्रात्मक विश्लेषण। डेटा को 5% -95% सीमा के साथ औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व की गणना दो पूंछ वाले मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मेइबोमियन ग्रंथियों का तैलीय स्राव एकस्वस्थ आंख के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, एकत्रित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एजीएनईटी) द्वारा इन वसामय ग्रंथियों की रुकावट जो दोनों पलकों की टार्सल प्लेटों पर स्थित समानांतर स्ट्रैंड के रूप में पंक्तिबद्ध होती है, आंसू फिल्म23 को बाधित कर सकती है। इस व्यवधान के परिणामस्वरूप मेइबोमियन ग्रंथि शिथिलता (एमजीडी) 1 और त्वरित आंसू वाष्पीकरण होता है और ओकुलर सतह2 की क्षति होती है। यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा-मध्यस्थता ओकुलर सतह सूजन स्थापित करने का वर्णन करता है जो एमजी रुकावट की ओर जाता है।

माउस मॉडल के अध्ययन ने ओकुलर सतह की सूजन से जुड़े एमजी रुकावट के कारण अंतर्निहित प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र की पुष्टि की है। एईडी के माउस मॉडल में न्यूट्रोफिल की भर्ती करने वाली एक मजबूत टीएच 17 प्रतिक्रिया और एमजीडी के साथ रोगियों के आंसू द्रव में न्यूट्रोफिल और अन्य माइलॉयड कोशिकाओं में वृद्धि एमजी21 को बाधित करने वाले न्यूट्रोफिल की भूमिका को इंगित करती है। एईडी के साथ चूहों में पेप्टिडिल आर्जिनिन डीमिनेज 4 के साथ एमजी छिद्रों को अवरुद्ध करने वाले एजीएनईटी की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी। इस मॉडल में, न्यूट्रोफिल ने एजीएनईटी को एकत्र करने और बनाने की कम क्षमता दिखाई जो एमजी ग्रंथियों10 के नलिकाओं और छिद्रों को बाधित करती है। इसके अलावा, एमजीडी के रोगियों के आंसू विश्लेषण ने एनाफिलाटॉक्सिन सी 5 ए और केमोकाइन आईएल -8 में वृद्धि दिखाई, जो पूरक प्रणाली की बढ़ी हुई गतिविधि और न्यूट्रोफिल घुसपैठ की उच्च आमद का प्रदर्शन करती है। अंत में, आईएल -6, आईएल -18, एमसीपी -1 / सीसीएल -2, और एमआईजी / आईएल 9 जैसे कई न्यूट्रोफिल कार्यों से जुड़े साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि, एमजीडी11 के रोगजनन में न्यूट्रोफिल की प्रमुख स्थिति को रेखांकित करती है।

एमजीडी की घटना डीईडी के विकास में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है, और ओकुलर अभिव्यक्तियों के रोगजनन में शामिल कई तत्वों की भूमिका कीजांच करना जटिल है। इसलिए, मॉडल के रूप में जानवरों का चयन जांच के तहत प्रश्न से काफी प्रभावित होता है। उदाहरण के लिए, खरगोश फॉर्मूलेशन के दवा परीक्षण के लिए पारंपरिक मॉडल के रूप में काम करते हैं; फेलिन, पोर्सिन और कैनाइन मॉडल मानव रोगियों के समान रोग संबंधी विशेषताओं की जांच के लिए उपयुक्त हैं, और चूहे मुख्य रूप से आनुवंशिक हेरफेरके लिए उपयुक्त हैं।

पशु मॉडल रोग रोगजनन की जांच और विवो में विभिन्न हस्तक्षेपों की चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। उदाहरण के लिए, पारंपरिक उपचार में नैदानिक ओकुलर अभिव्यक्तियों के इलाज के लिए आई ड्रॉप इंस्टिलेशन का प्रशासन शामिल है; हालांकि, आंसू प्रवाह और लैक्रिमल जल निकासी प्रणाली के कारण, इस तरह के ओकुलर हस्तक्षेप तेजी से ओकुलर सतह से हटा दिए जाते हैं। यह केवल अस्थायी कार्रवाई का कारण बनता है और बार-बार प्रशासन और उच्च खुराक की आवश्यकता होती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, शुष्क आंख रोग (डीईडी) के खरगोश मॉडल ने वैकल्पिक सामयिक उपचार के रूप में थर्मोगेल और कार्बोनाइज्ड नैनोगेल (सीएनजी) की जांच करने के लिए आदर्श माध्यम के रूप में कार्य किया। हायलूरोनिक एसिड और एक अमाइन-टर्मिनेटेड पॉली (एन-आइसोप्रोपिल एक्रिलामाइड) के सल्फेशन के विभिन्न डिग्री को जोड़कर प्राप्त थर्मोगेल, जब आंख को प्रशासित किया जाता है, तो एक जेल में बदल जाता है। डीईडी के खरगोश मॉडल में, इस जेल को लंबे समय तक बनाए रखा गया था, और एक बूंद ने क्षतिग्रस्त कॉर्नियल एपिथेलिया की मरम्मत की, एपोप्टोसिस को रोक दिया, और 7 दिनों के फॉलो-अप के दौरान ओकुलर सूजन को दबा दिया, जिससे सेलेक्टिन-मध्यस्थता ल्यूकोसाइट इंटरैक्शन 26 के निषेध के कारण ल्यूकोसाइट घुसपैठ में रुकावट का सुझावमिलता है।

इसके अलावा, डीईडी के खरगोश मॉडल में, आंखों की बूंदों के रूप में कार्बोनाइज्ड नैनोगेल्स (सीएनजी) ने आंसू की कमी और अत्यधिक आंसू वाष्पीकरण का इलाज करने वाले मुक्त कणों को दिखाया, जो एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण होता है। सीजी को लाइसिन हाइड्रोक्लोराइड (लिस-सीएनजी) के पायरोलिसिस के माध्यम से प्राप्त किया गया था और प्रशासित किया गया था, और एक खुराक ने 4 दिनों के भीतर डीईडी लक्षणों को कम कर दिया था। इसी तरह का चिकित्सीय प्रभाव केवल साइक्लोस्पोरिन ए आई ड्रॉप इंस्टिलेशन की 10 गुना अधिक मात्रा के कई उपचारों के साथ प्राप्त किया जा सकता था। इन नए बायोकम्पैटिबल फार्मास्युटिकल हस्तक्षेपों ने प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल27 में एकल-खुराक हस्तक्षेप और अधिक विस्तारित ओकुलर प्रतिधारण के रूप में बेहतर दृष्टिकोण प्रदर्शित किए।

माउस मॉडल में कई जीनों के नॉकआउट ने एमजीडी के रोगजनन में शामिल कई प्रोटीनों की भूमिका का खुलासा किया है। उदाहरण के लिए, पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़ेरेटर-सक्रिय रिसेप्टर-गामा (पीपीएआर γ)24 की अनियमित जीन अभिव्यक्ति और इसके सिग्नलिंग मार्ग में परिवर्तन13 साल की उम्र के दौरान सेल चक्र प्रवेश / प्रसार, लिपिड संश्लेषण और मेइबोमियन ग्रंथि शोष में परिवर्तन को प्रेरित करते हैं। इसके अलावा, एक माउस मॉडल में एईएनएसी (β - उपकला सोडियम चैनल) की अनुपस्थिति ने संकेत दिया कि महिलाओं में प्रचलित एमजी डिसफंक्शन फेनोटाइप एमजी शोष और छिद्र रुकावट से जुड़ा था जैसा कि स्यूडोहाइपोएलडोस्टेरोनिज्म 1 (पीएचए) 28 के साथ मनुष्यों में होता है। सीडी 147 की आवश्यक भूमिका चूहों में भी स्पष्ट की गई थी, और यह माना जाता है कि यह मेबोसाइट्स29 की समृद्ध लिपिड सामग्री को बनाए रखता है। एंजाइम सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज 1 की कमी वाले चूहों ने ऊंचा ऑक्सीडेटिव लिपिड और डीएनए क्षति दिखाई, जो एमजी सूजन30 में वृद्धि से जुड़ा हुआ था। अंत में, ईएलओवीएल 4 एन्कोडिंग एंजाइम में एक एकल उत्परिवर्तन मेइबम लिपिडोम बनाने वाले बेहद लंबी श्रृंखला फैटी एसिड अवशेषों को संश्लेषित करने के लिए आवश्यक है, जिससे पूर्ववर्ती ओकुलर सतह31 में कार्यात्मक परिवर्तन होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि एमजीडी को अपूर्ण लिपिड संरचना के साथ एक विशेष आहार के साथ चूहों में भी प्रेरित किया गया था ताकि नेत्र सूत्रीकरण 32 के रूप में एज़िथ्रोमाइसिन की चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकनकिया जा सके।

जबकि माउस मॉडल को नियोजित करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने एमजीडी में शामिल कई जीनों की पहचान की है, कई में अंतर्निहित प्रतिरक्षात्मक स्थिति की कमी है। एईडी मॉडल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रेरण, आईजीई एंटीबॉडी की पीढ़ी और प्रभावक चरण से संभावित हस्तक्षेपों की एक पूरी श्रृंखला प्रदान करता है, साथ ही मानव बाष्पीकरणीय एमजीडी जैसे कई रोग संबंधी परिवर्तन भी होते हैं।

उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एमजीडी की जांच करते समय, 1: 1 अनुपात में फिटकरी में इम्यूनोजेन (ओवीए और पर्टुसिस टॉक्सिन) जोड़ना महत्वपूर्ण है। फिटकरी में अंडाकार-पर्टुसिस विष के अच्छे सोखने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करना चाहिए। ये इंटरैक्शन पर्याप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, टीकाकरण के दौरान, इंजेक्शन लगाते समय ध्यान दिया जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप पेरिटोनियल गुहा के अंतर्निहित अंगों का छिद्र हो सकता है। इसके परिणामस्वरूप माउस में अपर्याप्त टीकाकरण और प्रणालीगत सूजन हो सकती है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर गहरा प्रभाव पड़ सकता है।

ओकुलर एक्स्यूडेट्स बड़े वेब जैसी बाह्य क्रोमैटिन संरचनाएं हैं जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ करती हैं। इसलिए, इस मॉडल से एकत्र किए गए ओकुलर एक्स्यूडेट्स का एमनेस उपचार एकल-सेल निलंबन11 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ये एक्स्यूडेट ओकुलर सतह पर इकट्ठा करना आसान है और व्यवहार्य न्यूट्रोफिल का एक स्रोत है जो परिसंचरण से स्थानांतरित हो गए हैं। इस तकनीक की मुख्य सीमा ओकुलर सतहों से एकत्र किए जाने वाले एक्स्यूडेट की मात्रा है। प्रत्येक आंख में 50 μL खारा जोड़ने से एक माउस से 100 μL तक एक्स्यूडेट की वसूली की अनुमति मिलती है। यह जैव रासायनिक अध्ययन के लिए 1-2 फ्लो साइटोमेट्री (एफएसीएस) धुंधला और सतह पर तैरने वाले के लिए मुश्किल से पर्याप्त है।

बाद में आंख और आसपास के ऊतकों को तोड़ने के लिए स्केलपेल के साथ विच्छेदन अक्सर सतही अस्थायी नस, अवर पैल्पेब्रल नस, या ओकुलर कोण नस को चोट पहुंचा सकता है। आंख के चारों ओर कम गहराई के साथ त्वचा में एक चीरा बनाने की सलाह दी जाती है क्योंकि रक्तस्राव आगे हिस्टोलॉजिकल तैयारी में हस्तक्षेप कर सकता है। एक ऊतक के विच्छेदन के दौरान, पीबीएस में अन्य ऊतकों को संग्रहीत करना आवश्यक है क्योंकि सुखाने या अपर्याप्त स्नेहन के परिणामस्वरूप संरचनात्मक विशेषताओं का नुकसान हो सकता है।

आंखों के ग्लोब से कॉर्निया के विच्छेदन के दौरान, यदि सूखी बर्फ पर आंखों के ग्लोब का इनक्यूबेशन एक स्थिर नियंत्रण को सक्षम नहीं करता है, तो कोई भी समय को 5 मिनट तक बढ़ा सकता है ताकि लिम्बस पर चीरा और कॉर्निया का पृथक्करण संभव हो सके।

संभावित अनुप्रयोग
एमजीडी से जुड़ी ओकुलर सतह की सूजन एक बहुक्रियाशील बीमारी है। इन लिपिड स्रावित ग्रंथियों में शिथिलता का विकास और प्रगति नेत्र, प्रणालीगत, हार्मोनल और आनुवंशिक कारकों, रसायनों, दवाओं, यांत्रिक हानिकारक एजेंटों और प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं के कारण हो सकतीहै। कई अध्ययनों ने न्यूट्रोफिल के कारण मेइबोमियन ग्रंथियों के रोड़ा और सूजन 11,21,34,35,36,37,38 की सूचना दी है। सामयिक और प्रणालीगत विरोधी भड़काऊ हस्तक्षेप का विकास जो इन प्रतिरक्षात्मक मार्गों में हस्तक्षेप करता है, एमजीडी के कारण ओकुलर असुविधा से पीड़ित रोगियों को राहत प्रदान कर सकता है। एलर्जी आंख रोग के मुराइन मॉडल का उपयोग इन एजेंटों के फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक गुणों की जांच करने के लिए प्रीक्लिनिकल सेटिंग में किया जा सकता है। यह रोग मॉडल एमजीडी से निपटने के लिए उपयुक्त रणनीतियों के विकास को सक्षम बनाता है और सामयिक या प्रणालीगत विरोधी भड़काऊ एजेंटों के उचित प्रशासन को निर्धारित करने में मदद करता है जो रोग पैदा करने वाले मार्गों में महत्वपूर्ण घटकों को लक्षित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) 2886 पेंडोरा प्रोजेक्ट-नंबर बी 3 द्वारा समर्थित था; एससीएचए 2040/1-1; एमयू 4240/2-1; सीआरसी 1181 (सी 03); टीआरआर 241 (बी 04), एच 2020-एफटोपेन-2018-2020 परियोजना 861878, और वोक्सवैगन-स्टिफटंग (अनुदान 97744) द्वारा एमएच को।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Gibco
Aluminium Hydroxide Imject alum Adjuvant 77161 40 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks Charles River Laboratories 
Calcium Carl roth CN93.1 1 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forceps FST by Dumont SWITZERLAND 5/45 11251-35
Fine sharp scissor FST Stainless steel, Germany 15001-08
Laminar safety cabinet Herasafe
Macrophotography Camera Canon EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter) Nikon D5300
Mnase New England biolabs M0247S 2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) Biolegend CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline) B.Braun
Ovalbumin (OVA) Endofit, Invivogen 9006-59-1 10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin  ThermoFisher Scientific  PHZ1174 50 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish Greiner bio-one 628160
Scalpel Feather disposable scalpel No. 21  Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope Zeiss Stemi508
Syringe (corneal/iris washing) BD Microlane 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization) BD Microlane 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm

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References

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ओकुलर सतह सूजन का प्रेरण और शामिल ऊतकों का संग्रह
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Singh, J., Shan, X., Mahajan, A., Herrmann, M., Schauer, C., Knopf, J., Muñoz, L. E. Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues. J. Vis. Exp. (186), e63890, doi:10.3791/63890 (2022).

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