Summary
L’inflammation de la surface oculaire endommage les tissus de la surface oculaire et compromet les fonctions vitales de l’œil. Le présent protocole décrit une méthode pour induire une inflammation oculaire et recueillir des tissus compromis dans un modèle murin de dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD).
Abstract
Les maladies de la surface oculaire comprennent une gamme de troubles qui perturbent les fonctions et les structures de la cornée, de la conjonctive et du réseau de glandes de surface oculaire associé. Les glandes de Meibomius (MG) sécrètent des lipides qui créent une couche de couverture qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal. Les neutrophiles et les pièges à ADN extracellulaire peuplent la MG et la surface oculaire dans un modèle murin de maladie oculaire allergique. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) forment une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire qui obstrue les sorties de MG et conditionne le dysfonctionnement de MG. Ici, une méthode pour induire une inflammation de la surface oculaire et un dysfonctionnement MG est présentée. Les procédures de collecte des organes liés à la surface oculaire, tels que la cornée, la conjonctive et les paupières, sont décrites en détail. En utilisant des techniques établies pour le traitement de chaque organe, les principales caractéristiques morphologiques et histopathologiques du dysfonctionnement MG sont également montrées. Les exsudats oculaires offrent la possibilité d’évaluer l’état inflammatoire de la surface oculaire. Ces procédures permettent d’étudier des interventions anti-inflammatoires topiques et systémiques au niveau préclinique.
Introduction
Chaque clignement d’œil reconstitue le film lacrymal lisse dispersé sur la cornée. L’épithélium de la surface oculaire facilite la distribution et l’orientation correcte du film lacrymal sur la surface oculaire. Les mucines sont fournies par la cornée et les cellules épithéliales conjonctives pour aider à positionner la partie aqueuse du film lacrymal provenant des glandes lacrymales à la surface des yeux. Enfin, le MG sécrète des lipides qui créent une couche de revêtement qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal 1,2,3. De cette façon, les fonctions coordonnées de tous les organes oculaires protègent la surface oculaire contre les agents pathogènes envahissants ou les blessures et soutiennent une vision cristalline sans douleur ni inconfort.
Dans une surface oculaire saine, la décharge oculaire ou le rheum oculaire balaye la poussière, les cellules épithéliales mortes, les bactéries, le mucus et les cellules immunitaires. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) formulent une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire et incorporent ces composants dans le rhume oculaire. Les TNEG résolvent l’inflammation par la dégradation protéolytique des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines4. Cependant, lorsqu’elles deviennent dysfonctionnelles, ces aggNET aberrantes entraînent la pathogenèse de maladies telles que les occlusions vasculaires dans COVID-195, les calculs biliaires6 et la sialolithiase7. De même, les aggNET sur la surface oculaire jouent un rôle protecteur et contribuent à résoudre l’inflammation de la surface fortement exposée8. Une formation exagérée ou l’absence d’aggNET dans la surface oculaire peut altérer la stabilité du film lacrymal et / ou causer des plaies cornéennes, une conjonctivite cicatrisante et une sécheresse oculaire. Par exemple, l’obstruction de la MG est l’une des principales causes de sécheresse oculaire9. Les AggNET sont également connus pour boucher le flux de sécrétion lipidique des canaux de MG et provoquer un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD). La congestion des orifices MG par les AGGNET provoque un manque de liquide gras enveloppant la surface oculaire et un liquide embouteillé rétrograde, entraînant un dysfonctionnement de la fonction glandulaire et des lésions acineuses. Ce dysfonctionnement peut entraîner l’évaporation du film lacrymal, la fibrose des marges sur les paupières, l’inflammation des yeux et des dommages néfastes au MG10,11.
Plusieurs modèles animaux ont été développés au fil des ans pour imiter le processus pathologique de MGD chez l’homme. Par exemple, des souris C57BL/6 âgées de 1 an ont aidé à étudier les effets liés à l’âge sur la sécheresse oculaire (DED) et la MGD, reflétant la pathologie de la maladie oculaire chez les patients âgés de 50 ans et plus12,13,14. En outre, les lapins sont des modèles appropriés pour étudier les effets des interventions pharmacologiques. Par conséquent, l’induction de MGD chez le lapin a été rapportée soit par l’administration topique d’épinéphrine, soit par l’introduction systémique d’acide 13-cis-rétinoïque (isotrétinoïne)15,16,17,18,19.
Bien que ces modèles animaux aient été adéquats pour déterminer les différents facteurs contribuant à la physiopathologie de la MGD, leur utilisation a été limitée. Par exemple, le modèle murin de MGD liée à l’âge était idéal pour déchiffrer des éléments chez les personnes âgées seulement, et par conséquent, les lapins semblaient être le modèle animal le plus approprié pour étudier les maladies de la surface oculaire, car ils permettent l’étude de multiples mécanismes physiopathologiques. Cependant, en raison du manque d’outils analytiques complets pour détecter les protéines à la surface oculaire et parce que de nombreuses parties du génome du lapin ne sont pas annotées, elles sont limitées pour les recherches20,21.
De plus, ces modèles animaux utilisés pour étudier la pathogenèse de la sécheresse oculaire n’ont pas fourni suffisamment de détails pour analyser le bras immunologique de la maladie qui provoque l’inflammation de la surface oculaire. En conséquence, le modèle murin de MGD développé par Reyes et al. a montré une association entre la maladie oculaire allergique chez la souris et la MGD chez l’homme et a mis en évidence l’étiologie immunitaire responsable de MGD21 obstructif. Ce modèle associe la maladie oculaire allergique à une réponse TH17 qui recrute des neutrophiles à la conjonctive et à la paupière, provoquant MGD et inflammation oculaire chronique21. L’induction de MGD et d’inflammation oculaire dans ce modèle murin est un outil précieux pour étudier les événements en amont lors du développement d’une inflammation locale entraînée par une réponse immunitaire continue21. Le protocole actuel décrit l’inflammation de la surface oculaire accompagnée d’une MGD obstructive. Dans cette méthode, les souris sont immunisées et, après 2 semaines, défiées sur la surface oculaire avec l’immunogène pendant 7 jours. En outre, les étapes pour isoler l’exsudat oculaire et les organes oculaires associés lors de l’inflammation aiguë et de la dissection de la cornée, de la conjonctive et des paupières sont décrites.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives institutionnelles sur le bien-être animal et approuvées par la commission du bien-être animal de l’Université Friedrich-Alexander d’Erlangen-Nuremberg (FAU) (numéro de permis: 55.2.2-2532-2-1217). Des souris C57Bl/6 femelles, âgées de 7 à 9 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques avec des cycles jour/nuit de 12 h.
1. Induction de l’inflammation de la surface oculaire murine
- Effectuer la préparation immunogène pour l’immunisation.
- Préparer l’immunogène fraîchement le jour de l’immunisation, en mélangeant l’ovalbumine (OVU, 50 mg/mL) et la toxine de la coqueluche (100 μg/mL) dans une solution saline et l’adjuvant hydroxyde d’aluminium (40 mg/mL) (voir le tableau des matières) dans une proportion de 1:1.
ATTENTION : Effectuer l’ouverture, la reconstitution et la préparation immunogénique de la toxine coqueluche dans une enceinte de sécurité laminaire. Portez des vêtements de protection et évitez tout contact avec la peau. - Incuber l’immunogène et le mélange adjuvant à température ambiante pendant 30 minutes et charger 100 μL dans une seringue de 1 mL.
- Effectuer une injection intrapéritonéale de la solution immunogène chez une souris non anesthésiée.
- Tenez doucement la souris par la queue tout en saisissant la grille de la cage. Tenez fermement la peau du dos et de la région du cou entre le pouce et l’index et fixez la queue et les membres inférieurs entre l’anneau et le petit doigt contre la paume de la main.
- Gardez la souris fixe avec sa tête vers le bas.
- Injecter 100 μL de la solution d’immunogène préparée dans le quadrant droit ou gauche de la cavité abdominale inférieure.
- Préparer l’immunogène fraîchement le jour de l’immunisation, en mélangeant l’ovalbumine (OVU, 50 mg/mL) et la toxine de la coqueluche (100 μg/mL) dans une solution saline et l’adjuvant hydroxyde d’aluminium (40 mg/mL) (voir le tableau des matières) dans une proportion de 1:1.
- Effectuer une provocation de la surface oculaire 2 semaines après la vaccination.
- Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (2,5%).
- Appliquer 5 μL d’OVA (50 mg/mL) ou de solution saline (0,9 % NaCl) par œil sur les deux yeux et attendre que la goutte soit absorbée par l’œil. Cela prend ~5 min.
- Répétez la procédure 1x par jour pendant 7 jours.
NOTE: L’administration topique de médicaments peut se faire de la même manière.
2. Collecte d’exsudats oculaires
- Récupérer les exsudats oculaires formés pendant la phase de provocation en appliquant 50 μL de solution saline stérile sur l’œil immédiatement après la provocation.
- Pour obtenir une suspension unicellulaire, traiter la décharge oculaire recueillie avec de la MNase recombinante (2 x 106 gel U/mL, voir tableau des matières) contenant le cofacteur calcium (5 mM) à 37 °C pendant 20 min.
- Centrifuger à 400 x g pendant 7 min à température ambiante.
- Isoler le surnageant et mesurer les cytokines et les chimiokines à l’aide d’ELISA multiplexé conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Le surnageant obtenu peut être utilisé pour l’analyse des protéines et la pastille pour des tests fonctionnels tels que l’immunophénotypage, la phagocytose, la dégranulation et l’expression génique.
3. Excision des tissus de surface oculaire
- Disséquez les paupières et le globe oculaire en suivant les étapes ci-dessous.
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 et luxation cervicale.
- Placez la souris sur une surface plane.
- Désinfectez la zone orbitaire autour de l’œil avec un écouvillon imprégné d’éthanol à 70%.
- Faites une incision entre l’oreille et le sinus rétro-orbitaire et le long de la surface au-dessus de l’os pavimenteux verticalement, en étendant l’incision horizontalement sous la paupière inférieure le long de l’os maxillaire et au-dessus de la paupière supérieure le long de l’os frontal. Cela forme une incision autour de l’œil (Figure 1).
- Tenez soigneusement le tissu disséqué autour de l’œil à l’aide d’une pince incurvée et retirez le tissu et le globe oculaire.
- Placer les organes excisés dans du PBS stérile.
- Couper l’excès de tissu musculaire facial autour des paupières supérieures excisées à l’aide d’un scalpel et sous le stéréomicroscope.
- Collectez la conjonctive en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez la paupière supérieure sur une boîte de Petri sèche sous le stéréomicroscope.
- À l’aide d’une fine pince à épiler et d’un scalpel, décollez très doucement la couche blanchâtre-muqueuse de la surface interne de la paupière.
- Ensuite, disséquez la cornée en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez le globe oculaire sur une nouvelle boîte de Petri sèche sur de la glace sèche pendant 3 min.
- Prenez la boîte de Petri sur la surface du banc dans une position stable.
- Faites une petite incision au bord de la cornée à côté du limbe à l’aide de fins ciseaux tranchants.
- Prolongez l’incision avec le scalpel autour du globe oculaire, en séparant la sclérotique de la cornée.
- Enlevez les restes de l’iris et du cristallin de l’arrière de la cornée en rinçant généreusement avec une solution saline.
4. Documentation de l’obstruction de la glande de Meibomius (MG)
- Pour évaluer le MG et ses orifices, placer les paupières excisées en position verticale sous le stéréomicroscope (Figure 2).
- Capturez des images avec un éclairage épi à lumière blanche en fonction du temps d’exposition de l’appareil photo et des paramètres ISO.
NOTE: L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille du bouchon à la sortie des glandes. La quantification peut être effectuée en décrivant avec l’outil de baguette les bouchons oculaires et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J (voir Tableau des matériaux).
5. Transillumination des paupières (morphologie de la glande de Meibomius)
- Pour évaluer la zone MG, placez les paupières excisées en position horizontale et allumez le rétroéclairage du stéréomicroscope équipé d’une caméra infrarouge (Figure 3).
- Capturez des images en ajustant le temps d’exposition en fonction de l’ISO de l’appareil photo (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: L’imagerie infrarouge de ces paupières transilluminatées au stéréomicroscope peut aider à mesurer la forme et la taille de chaque acini. L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille et du nombre de MG. La quantification peut être effectuée en décrivant le MG avec l’outil baguette et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J.
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Representative Results
Le présent protocole décrit les étapes séquentielles pour établir un modèle murin d’inflammation de la surface oculaire. Les protocoles visent à montrer comment appliquer localement des traitements, obtenir des exsudats oculaires et exciser les organes accessoires associés tels que les paupières saines et enflammées (Figure 2), la cornée et la conjonctive. Une attention particulière doit être accordée lorsque les paupières supérieures sont disséquées pour l’isolement de la conjonctive, et elle doit être stockée dans 1x PBS lors de la dissection de la cornée. Cela empêchera le dessèchement de la conjonctive, qui peut être utilisée pour des études histologiques, pharmacocinétiques et d’expression génique.
L’OVA et la solution saline ont été appliquées par voie topique pendant 7 jours consécutifs suivant le protocole susmentionné. Les souris défiées par voie topique avec une solution saline ont montré une surface oculaire saine avec les yeux grands ouverts et un clignotement régulier. Cependant, une inflammation oculaire a été provoquée chez des souris immunisées C57BL/6J confrontées à des ovules. L’instillation de la solution d’OVA sur la surface oculaire a provoqué des démangeaisons, et non de la douleur, pendant les 2 premières heures après l’instillation. L’eczéma des exsudats et des paupières n’a été observé que pendant les 3 derniers jours de la phase de provocation. Aucune douleur n’était évidente, jugeant le comportement des animaux. Par conséquent, un niveau modéré de stress pour les souris sur une courte période de temps a été supposé. Le défi quotidien de l’AVO a déclenché des manifestations cliniques telles qu’un écoulement oculaire abondant, une chimiose et une ouverture étroite des yeux. De plus, les paupières supérieures et inférieures adhéraient fréquemment l’une à l’autre, ce qui nuisait à la fonction essentielle de clignement des yeux (Figure 2). Des critères d’interruption stricts (dossier supplémentaire) ont été suivis pour ce modèle et ont été approuvés par le conseil d’éthique local pour l’expérimentation animale. L’interruption immédiate était effectuée si une souris atteignait 15 points à un moment donné.
Dossier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Après l’euthanasie, les organes oculaires ont été excisés et observés à un grossissement plus élevé. Les paupières excisées au microscope ont montré de grandes occlusions obstruant les orifices de la MG et un œdème, en contraste frappant avec les paupières saines montrant de petits bouchons de la glande tapissant la paupière (Figure 3).
Un examen plus approfondi de la transillumination infrarouge de la glande révèle l’aspect racémique des acini du MG. Cela permet de quantifier les glandes de Meibomius visibles (indiquées en rouge). Les paupières de souris défiées par une solution saline montraient les acini ronds formant le MG. En comparaison, l’application d’OVA a induit la destruction et la perte de certains MG chez des souris souffrant d’une maladie oculaire allergique (AED, Figure 4). L’analyse histologique des paupières a montré une MG dilatée par rapport à des souris naïves administrées avec une solution saline uniquement pendant 7 jours (Figure 5), permettant l’accumulation de neutrophiles produisant des aggNET qui obstruent finalement les orifices de la glande.
Séparer la cornée de la sclérotique de l’œil peut être encombrant en raison de la surface muqueuse glissante du globe oculaire. L’incubation du globe oculaire sur de la glace sèche dans une boîte de Petri pendant 3 minutes permet de fixer l’œil, de faire une petite incision au niveau du limbe et de disséquer la cornée (Figure 6).
Les étapes inscrites dans la section du protocole ont facilité la collecte de la cornée et de la conjonctive. De plus, l’administration locale d’OVA a infligé une inflammation sévère à la conjonctive, avec un aspect hyperémique (Figure 7).
L’analyse des exsudats oculaires révèle des mécanismes moléculaires dans le développement de la MGD. La quantification des cytokines et des chimiokines telle que décrite a montré des niveaux élevés de chimiokines majeures facilitant l’extravasation, la phagocytose et la dégranulation des neutrophiles (CXCL-1) chez les surnageants de souris atteintes d’AED8. En outre, le principal médiateur de la réponse en phase aiguë et de la production de neutrophiles, l’IL-6, était également significativement élevé chez les souris atteintes de DEA. D’autre part, la concentration d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, n’a montré aucun changement significatif chez les souris naïves et les MAE (Figure 8).
Figure 1 : Excision du tissu facial entourant la région orbitaire. La piste d’incision est indiquée en rouge. Cela permet d’exciser les organes oculaires et d’étudier l’influence et les effets de divers traitements administrés par voie topique sur les organes oculaires accessoires tels que la conjonctive et la cornée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’administration d’OVA provoque des manifestations cliniques de MGD. (A) Les souris administrées une solution saline présentent une surface oculaire saine avec les yeux grands ouverts. (B) L’application d’OVA induit une inflammation sévère de la surface oculaire, l’ouverture étroite des yeux et des signes de chimiose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Bouchons canalaires obstruant les glandes de Meibomius (MG) situées le long des paupières. (A) Photographie macro représentative d’une paupière saine sans écoulement oculaire excessif d’une souris administrée par une solution saline pendant 7 jours seulement. (B) Paupière montrant de grandes occlusions canalaires de la MG et un œdème après la période de provocation. Barre d’échelle = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La macrophotographie transilluminatrice permet de visualiser les acini (lignes rouges) de la MG. (A) L’amélioration des niveaux infrarouges permet de visualiser les acini sains des souris naïves et de dévoiler les acini distincts en forme de poche dans les paupières saines. (B) Les acini apparaissent épais dans les paupières affectées des souris avec l’application d’OVA. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’analyse histologique des paupières montre des canaux dilatés de MG chez des souris avec des insultes OVA répétées pendant 7 jours. (A) Les paupières de souris naïves montrent l’absence de canaux dilatés, représentant un organe oculaire fonctionnant en bonne santé (B) contrairement aux souris présentant un défi OVA. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Incision au niveau de la cornée à côté du limbe et séparation de la cornée de la sclérotique. Image du globe oculaire montrant le point d’incision (indiqué par une flèche blanche). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Administration locale d’ovules. (A) Macro-photographies d’organes oculaires murins montrant la cornée. Barre d’échelle : 600 μm. (B) Conjonctive enflammée de souris défilées par les ovules. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Mesure des marqueurs inflammatoires dans les exsudats oculaires recueillis. Analyse quantitative des cytokines et des chimiokines dans le surnageant de l’exsudat oculaire centrifugé de souris naïves (n = 7) et de souris avec MGD (n = 8). Les données sont exprimées en médiane avec une fourchette de 5 % à 95 %. La signification statistique a été calculée à l’aide du test U bilatéral de Mann-Whitney. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La sécrétion huileuse des glandes de Meibomius est d’une grande importance pour un œil sain22. Cependant, l’obstruction de ces glandes sébacées par des pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) qui s’alignent sous forme de brins parallèles situés sur les plaques tarsiennes des deux paupières peut perturber le filmlacrymal 23. Cette perturbation entraîne un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD)1 et une évaporation lacrymale accélérée et conditionne les dommages de la surface oculaire2. Ce protocole décrit l’établissement d’une inflammation de la surface oculaire à médiation immunitaire qui conduit à l’obstruction de MG.
Des études sur des modèles murins ont confirmé les mécanismes sous-jacents à médiation immunitaire causant l’obstruction de la MG associée à une inflammation de la surface oculaire. Une réponse TH17 robuste recrutant des neutrophiles dans le modèle murin de DEA et une augmentation des neutrophiles et d’autres cellules myéloïdes dans le liquide lacrymal des patients atteints de MGD indiquent le rôle des neutrophiles obstruant le MG21. La présence d’aggNETs obstruant les orifices MG a été confirmée avec la peptidyl arginine déiminase 4 chez des souris présentant un DEA. Dans ce modèle, les neutrophiles ont montré une capacité réduite à agréger et ont formé des aggNET qui obstruaient les canaux et les orifices des glandes MG10. De plus, l’analyse des larmes chez les patients atteints de MGD a montré une augmentation de l’anaphylatoxine C5a et de la chimiokine IL-8, démontrant une activité accrue du système du complément et un afflux élevé d’infiltration de neutrophiles. Enfin, une augmentation du niveau de cytokines associée à plusieurs fonctions des neutrophiles, telles que IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 et MIG / CXCL9, souligne la position principale des neutrophiles dans la pathogenèse de MGD11.
L’apparition de MGD contribue de manière significative au développement de la DED, et l’examen du rôle des nombreux éléments impliqués dans la pathogenèse des manifestations oculaires est compliqué24. Par conséquent, la sélection des animaux comme modèles est fortement influencée par la question étudiée. Par exemple, les lapins servent de modèles conventionnels pour les tests pharmaceutiques des formulations; Les modèles félins, porcins et canins conviennent à l’étude de caractéristiques pathologiques similaires à celles des patients humains, et les souris conviennent principalement à la manipulation génétique25.
Les modèles animaux sont des outils précieux pour étudier la pathogenèse des maladies et examiner l’efficacité thérapeutique de diverses interventions in vivo. Par exemple, les traitements conventionnels comprennent l’administration d’instillations de gouttes ophtalmiques pour traiter les manifestations oculaires cliniques; Cependant, en raison de l’écoulement lacrymal et du système de drainage lacrymal, de telles interventions oculaires sont rapidement retirées de la surface oculaire. Cela ne provoque qu’une action temporaire et nécessite des administrations répétées et des doses élevées. Pour résoudre ce problème, le modèle de sécheresse oculaire chez le lapin (DED) a servi de milieu idéal pour examiner les thermogels et les nanogels carbonisés (GNC) comme traitements topiques alternatifs. Les thermogels obtenus en conjuguant différents degrés de sulfatation de l’acide hyaluronique et un poly (N-isopropyl acrylamide) terminé par amine, lorsqu’ils sont administrés à l’œil, se transforment en gel. Dans le modèle lapin de DED, ce gel a été conservé plus longtemps, et une seule goutte a réparé les épithéliums cornéens endommagés, arrêté l’apoptose et réprimé l’inflammation oculaire pendant un suivi de 7 jours, suggérant une interruption de l’infiltration leucocytaire due à l’inhibition de l’interaction leucocytaire médiée par la sélectionine26.
De plus, dans le modèle lapin de DED, les nanogels carbonisés (GNC) sous forme de gouttes oculaires ont montré un piégeage des radicaux libres traitant la carence en larmes et l’évaporation excessive des larmes causées par une réponse inflammatoire exacerbée et un stress oxydatif. Les GNC ont été obtenus par pyrolyse du chlorhydrate de lysine (Lys-CNGs) et administrés, et une dose unique a atténué les symptômes de DED dans les 4 jours. Un effet thérapeutique similaire n’a été obtenu qu’avec plusieurs traitements d’une quantité 10 fois plus élevée d’instillations de collyre de cyclosporine A. Ces nouvelles interventions pharmaceutiques biocompatibles présentaient des perspectives supérieures en tant qu’interventions à dose unique et en rétention oculaire plus étendue dans des modèles animaux précliniques27.
L’élimination de plusieurs gènes dans des modèles murins a révélé le rôle de multiples protéines impliquées dans la pathogenèse de MGD. Par exemple, l’expression génique dérégulée du récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR γ)24 et les altérations de sa voie de signalisation induisent des changements dans l’entrée/prolifération du cycle cellulaire, la synthèse des lipides et l’atrophie des glandes de Meibomius au cours du vieillissement13. De plus, l’absence de βENaC (canal sodique épithélial β) dans un modèle murin indiquait que le phénotype de dysfonctionnement MG prévalent chez les femelles était associé à une atrophie MG et à une obstruction de l’orifice comme chez les humains atteints de pseudohypoaldostéronisme 1(PHA)28. Le rôle essentiel de CD147 a également été élucidé chez la souris, et on pense qu’il maintient la riche teneur en lipides des méibocytes29. Les souris déficientes pour l’enzyme superoxyde dismutase 1 ont montré des dommages oxydatifs élevés aux lipides et à l’ADN, ce qui a été lié à une augmentation de l’inflammation MG30. Enfin, une mutation unique de l’ELOVL4 codant pour l’enzyme nécessaire à la synthèse des résidus d’acides gras à chaîne extrêmement longue formant le lipidome de meibum entraîne des modifications fonctionnelles de la surface oculaire antérieure31. Fait intéressant, MGD a également été induit chez des souris avec un régime spécial avec une composition lipidique incomplète pour évaluer l’efficacité thérapeutique de l’azithromycine en tant que formulation ophtalmique32.
Alors que la plupart des études utilisant des modèles murins ont identifié plusieurs gènes impliqués dans MGD, beaucoup n’ont pas de condition immunologique sous-jacente. Le modèle DEA offre toute une gamme d’interventions possibles allant de l’induction de la réponse immunitaire à la génération d’anticorps IgE et à la phase effectrice, accompagnées de plusieurs changements pathologiques ressemblant à la MGD évaporative humaine.
Lors de l’étude de MGD en utilisant le protocole mentionné, il est crucial d’ajouter un immunogène (OVA et toxine de la coqueluche) à l’alun dans une proportion de 1: 1. Il faut incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante pour une bonne adsorption de la toxine ovalbumine-coqueluche sur l’alun. Ces interactions sont vitales pour déclencher une réponse immunitaire adéquate. De plus, lors de l’immunisation, il faut faire attention lors de l’injection, car cela peut entraîner une perforation des organes sous-jacents de la cavité péritonéale. Cela peut entraîner une immunisation inadéquate et une inflammation systémique chez la souris, avec des effets profonds sur la réponse immunitaire.
Les exsudats oculaires sont de grandes structures de chromatine extracellulaire en forme de toile qui incrustent les cellules immunitaires. Par conséquent, le traitement par MNase des exsudats oculaires collectés à partir de ce modèle est essentiel pour obtenir des suspensions unicellulaires11. De plus, ces exsudats sont faciles à recueillir à la surface oculaire et sont une source de neutrophiles viables qui ont transmigré de la circulation. La principale limite de cette technique est la quantité d’exsudat à recueillir sur les surfaces oculaires. L’ajout de 50 μL de solution saline à chaque œil permet de récupérer jusqu’à 100 μL d’exsudat d’une souris. C’est à peine suffisant pour les colorations par cytométrie en flux 1-2 (FACS) et les surnageants pour les études biochimiques.
La dissection avec un scalpel pour arracher plus tard l’œil et les tissus environnants peut souvent causer des lésions à la veine temporale superficielle, à la veine palpébrale inférieure ou à la veine d’angle oculaire. Il est conseillé de créer une incision dans la peau avec moins de profondeur autour de l’œil car le saignement peut interférer avec d’autres préparations histologiques. Lors de la dissection d’un tissu, le stockage d’autres tissus dans le PBS est essentiel car le séchage ou une lubrification insuffisante peut entraîner la perte de caractéristiques structurelles.
Lors de la dissection de la cornée du globe oculaire, si l’incubation du globe oculaire sur de la glace sèche ne permet pas un contrôle régulier, on peut prolonger le temps jusqu’à 5 minutes afin que l’incision au niveau du limbe et la séparation de la cornée soient possibles.
Applications potentielles
L’inflammation de la surface oculaire associée à la MGD est une maladie multifactorielle. Le développement et la progression du dysfonctionnement de ces glandes sécrétrices de lipides peuvent être causés par des facteurs ophtalmiques, systémiques, hormonaux et génétiques, des produits chimiques, des médicaments, des agents nocifs mécaniques et des réponses immunologiques33. Plusieurs études ont rapporté des neutrophiles provoquant l’occlusion des glandes de Meibomius et l’inflammation 11,21,34,35,36,37,38. Le développement d’interventions anti-inflammatoires topiques et systémiques qui interfèrent avec ces voies immunologiques peut offrir un soulagement aux patients souffrant d’inconfort oculaire dû à la MGD. Le modèle murin de la maladie oculaire allergique peut être utilisé dans un cadre préclinique pour étudier les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de ces agents. Ce modèle de maladie permet le développement de stratégies appropriées pour lutter contre la MGD et aide à déterminer l’administration appropriée d’agents anti-inflammatoires topiques ou systémiques qui ciblent les composants vitaux dans les voies pathogènes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, et par la Volkswagen-Stiftung (subvention 97744) à MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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