Summary
안구 표면 염증은 안구 표면 조직에 해를 끼치고 눈의 중요한 기능을 손상시킵니다. 본 프로토콜은 마이보미안 샘 기능장애(MGD)의 마우스 모델에서 안구 염증을 유도하고 손상된 조직을 수집하는 방법을 기술한다.
Abstract
안구 표면 질환에는 각막, 결막 및 관련 안구 표면 샘 네트워크의 기능과 구조를 방해하는 다양한 장애가 포함됩니다. Meibomian 땀샘 (MG)은 눈물 막의 수성 부분의 증발을 방지하는 덮개 층을 만드는 지질을 분비합니다. 호중구와 세포외 DNA 트랩은 알레르기성 안구 질환의 마우스 모델에서 MG와 안구 표면을 채웁니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 MG 출구를 차단하고 MG 기능 장애를 조절하는 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화합니다. 여기서, 안구 표면 염증 및 MG 기능 장애를 유도하는 방법이 제시된다. 각막, 결막 및 눈꺼풀과 같은 안구 표면과 관련된 장기를 수집하는 절차가 자세히 설명되어 있습니다. 각 장기를 처리하기 위해 확립 된 기술을 사용하여 MG 기능 장애의 주요 형태 학적 및 조직 병리학 적 특징도 보여줍니다. 안구 삼출물은 안구 표면의 염증 상태를 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 절차를 통해 전임상 수준에서 국소 및 전신 항염증 중재를 조사할 수 있습니다.
Introduction
눈 깜짝 할 사이에 각막 위에 흩어져있는 부드러운 눈물 막이 보충됩니다. 안구 표면 상피는 안구 표면에서 눈물 막의 분포와 올바른 방향을 촉진합니다. 뮤신은 각막과 결막 상피 세포에 의해 제공되어 눈물샘에서 나오는 눈물막의 수성 부분을 눈 표면에 위치시키는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, MG는 눈물막 1,2,3의 수성 부분의 증발을 방지하는 피복층을 생성하는 지질을 분비합니다. 이러한 방식으로 모든 안구 기관의 조정 된 기능은 침입 병원균이나 부상으로부터 안구 표면을 보호하고 통증이나 불편 함없이 맑은 시력을 지원합니다.
건강한 안구 표면에서 안구 흐르는 분비물 또는 눈 류움은 먼지, 죽은 상피 세포, 박테리아, 점액 및 면역 세포를 쓸어냅니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화하고 이러한 구성 요소를 눈 류움에 통합합니다. AggNET은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 단백질 분해 분해에 의해 염증을 해결합니다4. 그러나 기능 장애가 발생하면 이러한 비정상적인 aggNET은 COVID-195, 담석6 및 규석결석 7의 혈관 폐색과 같은 질병의 발병 기전을 유발합니다. 유사하게, 안구 표면의 aggNET은 보호 역할을하며 고도로 노출 된 표면의 염증을 해결하는 데 기여합니다8. 안구 표면에 과장된 형성 또는 aggNET이 부족하면 눈물막 안정성이 손상되거나 각막 상처, 결막염 및 안구 건조증을 유발할 수 있습니다. 예를 들어, MG의 폐색은 안구 건조증의 주요 원인입니다9. AggNET은 또한 MG의 덕트에서 지질 분비의 흐름을 막고 마이봄샘 기능 장애(MGD)를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. aggNET에 의한 MG 오리피스의 혼잡은 안구 표면을 감싸는 지방액의 부족과 역행 병액 체액을 유발하여 샘 기능의 기능 장애 및 acinar 손상을 초래합니다. 이 기능 장애는 눈물막 증발, 눈꺼풀 가장자리의 섬유증, 눈 염증 및 MG10,11에 대한 해로운 손상을 초래할 수 있습니다.
인간에서 MGD의 병리학 적 과정을 모방하기 위해 수년에 걸쳐 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 예를 들어, 1 세의 C57BL / 6 마우스는 50 세 이상 환자의 안구 질환 병리를 반영하여 안구 건조증 (DED) 및 MGD에 대한 연령 관련 효과를 연구하는 데 도움이되었습니다12,13,14. 또한, 토끼는 약리학 적 개입의 효과를 조사하기위한 적절한 모델이다. 따라서 토끼에서 MGD를 유도하는 것은 에피네프린의 국소 투여 또는 13-시스-레티노산(isotretinoin)15,16,17,18,19의 전신 도입에 의해 보고되었습니다.
이러한 동물 모델은 MGD의 병태생리학에 기여하는 다양한 요인을 결정하는 데 적합했지만 활용이 제한적이었습니다. 예를 들어, 연령 관련 MGD의 쥐 모델은 노인의 요소를 해독하는 데 이상적이었고, 따라서 토끼는 여러 병리 생리 학적 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 안구 표면 질환을 연구하는 데 가장 적합한 동물 모델 인 것으로 나타났습니다. 그러나 안구 표면에서 단백질을 검출하기위한 포괄적 인 분석 도구가 부족하고 토끼 게놈의 많은 부분에 주석이 없기 때문에 조사20,21로 제한됩니다.
또한, 안구건조증의 발병기전을 조사하기 위해 사용된 이들 동물 모델은 안구 표면의 염증을 유발하는 장애의 면역학적 팔을 분석하기 위한 적절한 세부사항을 제공하지 않았다. 따라서, Reyes 등에 의해 개발된 MGD의 뮤린 모델은 마우스의 알레르기성 안구 질환과 인간의 MGD 사이의 연관성을 보여주었고, 폐쇄성 MGD21의 원인이 되는 면역 병인을 강조하였다. 이 모델은 알레르기 성 안 질환을 결막과 눈꺼풀에 호중구를 모집하여 MGD 및 만성 안구 염증21을 유발하는 TH17 반응과 연관시킵니다. 이 뮤린 모델에서 MGD 및 안구 염증의 유도는 진행중인 면역 반응21에 의해 구동되는 국소 염증의 발달 동안 상류 사건을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 현재 프로토콜은 폐쇄성 MGD를 동반하는 안구 표면 염증을 설명합니다. 이 방법에서, 마우스는 면역화되고, 2 주 후, 7 일 동안 면역원으로 안구 표면에 도전된다. 또한 급성 염증 및 각막, 결막 및 눈꺼풀 박리 동안 안구 삼출물 및 관련 안구 기관을 분리하는 단계가 설명됩니다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 동물 복지에 관한 제도적 지침에 따라 수행되었으며 프리드리히-알렉산더-대학교 에를랑겐-뉘른베르크(FAU)의 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다(허가 번호: 55.2.2-2532-2-1217). 암컷 C57Bl/6 마우스, 7-9주령을 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처 ( 재료 표 참조)에서 얻었으며 12 시간 주야간 주기로 특정 병원체가없는 상태로 유지되었습니다.
1. 쥐 안구 표면 염증의 유도
- 예방 접종을위한 면역 원 준비를 수행하십시오.
- 오브알부민(OVA, 50mg/mL)과 백일해 독소(100μg/mL)를 식염수와 보조제인 수산화알루미늄(40mg/mL)( 재료 표 참조)을 1:1 비율로 혼합하여 면역원을 접종 당일에 신선하게 준비합니다.
주의 : 층류 안전 캐비닛에서 백일해 독소의 개방, 재구성 및 면역 원 준비를 수행하십시오. 보호 복을 착용하고 피부와의 접촉을 피하십시오. - 면역원 및 보조제 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하고 1mL 주사기에 100μL를 넣습니다.
- 마취되지 않은 마우스에서 면역 원액을 복강 내 주사하십시오.
- 케이지 그리드를 잡는 동안 꼬리를 잡고 마우스를 부드럽게 잡습니다. 엄지와 검지 사이의 등 피부와 목 부위를 단단히 잡고 약지와 새끼 손가락 사이의 꼬리와하지를 손바닥에 고정하십시오.
- 고정 된 마우스의 머리를 아래로 향하게하십시오.
- 준비된 면역원 용액 100μL를 하복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 주입한다.
- 오브알부민(OVA, 50mg/mL)과 백일해 독소(100μg/mL)를 식염수와 보조제인 수산화알루미늄(40mg/mL)( 재료 표 참조)을 1:1 비율로 혼합하여 면역원을 접종 당일에 신선하게 준비합니다.
- 예방 접종 2 주 후에 안구 표면 챌린지를 수행하십시오.
- 마우스를 이소 플루 란 (2.5 %)으로 마취하십시오.
- 양쪽 눈에 눈당 5μL의 OVA(50mg/mL) 또는 식염수(0.9% NaCl)를 바르고 방울이 눈에 흡수될 때까지 기다립니다. ~ 5 분이 걸립니다.
- 7 일 동안 매일 1 번 절차를 반복하십시오.
알림: 약물의 국소 투여도 같은 방식으로 수행 할 수 있습니다.
2. 안구 삼출물 수집
- 챌린지 직후 50μL의 멸균 식염수를 눈에 적용하여 챌린지 단계에서 형성된 안구 삼출물을 회수합니다.
- 단일 세포 현탁액을 얻으려면 수집된 안구 방전을 보조 인자 칼슘(5mM)을 포함하는 재조합 MNase(2 x 106 겔 U/mL, 재료 표 참조)로 37°C에서 20분 동안 처리합니다.
- 실온에서 400 x g 에서 7 분 동안 원심 분리합니다.
- 상청액을 분리하고 제조업체의 지침에 따라 멀티플렉스 ELISA를 사용하여 사이토카인과 케모카인을 측정합니다( 재료 표 참조).
참고: 수득된 상청액은 단백질 분석에 사용될 수 있고 펠릿은 면역표현형, 식균작용, 탈과립 및 유전자 발현과 같은 기능적 분석에 사용될 수 있다.
3. 안구 표면 조직의 절제
- 아래 단계에 따라 눈꺼풀과 눈 지구를 해부하십시오.
- CO2 질식 및 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다.
- 마우스를 평평한 표면에 놓습니다.
- 70 % 에탄올이 함침 된 면봉으로 눈 주위의 안와 부위를 소독하십시오.
- 귀와 후 안와 부비동 사이와 편평 뼈 위의 표면을 따라 수직으로 절개하여 상악골을 따라 아래 눈꺼풀 아래로, 정면 뼈를 따라 위 눈꺼풀 위로 절개를 확장합니다. 이것은 눈 주위에 절개를 형성합니다 (그림 1).
- 구부러진 집게를 사용하여 눈 주위의 해부 된 조직을 조심스럽게 잡고 조직과 안구를 빼냅니다.
- 절제된 장기를 멸균 PBS에 넣습니다.
- 메스를 사용하여 실체 현미경으로 절제된 위 눈꺼풀 주변의 과도한 안면 근육 조직을 다듬습니다.
- 아래 단계에 따라 결막을 수집하십시오.
- 실체 현미경 아래의 마른 페트리 접시에 위 눈꺼풀을 놓습니다.
- 미세한 핀셋과 메스를 사용하여 눈꺼풀의 안쪽 표면에서 희끄무레 한 점액층을 매우 부드럽게 벗겨냅니다.
- 다음으로 아래 단계에 따라 각막을 해부하십시오.
- 드라이 아이스 위에 새로운 마른 페트리 접시에 아이 글로브를 3 분 동안 놓습니다.
- 페트리 접시를 안정된 위치에서 벤치 표면에 가져갑니다.
- 미세한 날카로운 가위를 사용하여 윤부 옆의 각막 경계에 작은 절개를하십시오.
- 눈 지구 주위의 메스로 절개를 연장하여 각막에서 공막을 분리하십시오.
- 식염수로 넉넉하게 씻어내어 각막 뒷면에서 홍채와 렌즈의 잔해를 제거합니다.
4. 마이보미안샘(MG) 폐쇄에 대한 문서화
- MG와 그 구멍을 평가하려면 절제된 눈꺼풀을 실체 현미경 아래 똑바로 세운 위치에 놓습니다(그림 2).
- 카메라의 노출 시간과 ISO 설정에 따라 백색광 에피 조명으로 이미지를 캡처합니다.
알림: 이러한 이미지의 형태 측정 분석은 땀샘 출구의 플러그 크기에 대한 신뢰할 수 있는 정량화를 제공합니다. 정량화는 지팡이 도구로 아이 플러그의 윤곽을 그리고 Image J 소프트웨어의 "입자 분석" 명령을 실행하여 수행할 수 있습니다( 재료 표 참조).
5. 눈꺼풀의 투과 조명 (마이 보 미안 샘 형태)
- MG 영역을 평가하려면 절제된 눈꺼풀을 수평 위치에 놓고 적외선 카메라가 장착된 실체 현미경의 백라이트를 켭니다(그림 3).
- 카메라( 재료 표 참조)의 ISO에 따라 노출 시간을 조정하여 이미지를 캡처합니다.
알림: 실체 현미경으로 이러한 투과광 눈꺼풀의 적외선 이미징은 각 acini의 모양과 크기를 측정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 이미지의 형태 분석은 MG의 크기와 수에 대한 신뢰할 수있는 정량화를 제공합니다. 정량화는 지팡이 도구로 MG의 윤곽을 설명하고 Image J 소프트웨어의 "입자 분석" 명령을 실행하여 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
본 프로토콜은 안구 표면 염증의 뮤린 모델을 확립하기 위한 순차적 단계를 기술한다. 이 프로토콜은 치료제를 국부적으로 적용하고, 안구 삼출물을 얻고, 건강하고 염증이 있는 눈꺼풀(그림 2), 각막 및 결막과 같은 관련 부속 기관을 절제하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결막의 분리를 위해 위 눈꺼풀을 해부 할 때주의를 기울여야하며 각막 해부 중에 1x PBS에 보관해야합니다. 이것은 조직학, 약동학 및 유전자 발현 연구에 사용될 수있는 결막의 건조를 방지합니다.
OVA 및 식염수는 상기 언급된 프로토콜에 따라 연속 7일 동안 국소적으로 적용되었다. 식염수로 국소 적으로 도전 한 마우스는 눈을 크게 뜨고 규칙적으로 깜박이는 패턴이있는 건강한 안구 표면을 보여주었습니다. 그러나, 안구 염증은 OVA에 도전한 면역화된 C57BL/6J 마우스에서 유발되었다. 안구 표면에 OVA 용액을 주입하면 점안 후 처음 2 시간 동안 통증이 아닌 가려움증이 발생했습니다. 삼출물 및 눈꺼풀 습진은 챌린지 단계의 마지막 3일 동안에만 관찰되었습니다. 동물의 행동을 판단 할 때 고통은 분명하지 않았습니다. 따라서, 단기간에 걸쳐 마우스에 대한 적당한 수준의 스트레스가 가정되었다. 매일의 OVA 챌린지는 풍부한 안구 분비물, 화학 요법 및 좁은 눈 열림과 같은 임상 증상을 유발했습니다. 또한 위 눈꺼풀과 아래 눈꺼풀이 자주 서로 달라붙어 깜박임의 필수 기능이 손상되었습니다(그림 2). 이 모델에 대해 엄격한 중단 기준 (보충 파일) 을 따랐으며 동물 실험을위한 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 한 마우스가 주어진 시간에 15 포인트에 도달하면 즉각적인 중단이 수행되었습니다.
보충 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
안락사 후, 안구 장기를 절제하고 더 높은 배율로 관찰했습니다. 현미경으로 절제된 눈꺼풀은 MG의 구멍을 막는 큰 폐색과 부종을 보여주었으며, 이는 눈꺼풀을 감싸는 샘의 작은 플러그를 보여주는 건강한 눈꺼풀과 극명한 대조를 이룹니다(그림 3).
글 랜드의 적외선 투과 조명에 대한 추가 검사는 MG의 acini의 라세미 모양을 보여줍니다. 이것은 보이는 Meibomian 땀샘 (빨간색으로 표시)을 정량화 할 수있게합니다. 식염수에 도전한 마우스의 눈꺼풀은 MG를 형성하는 둥근 아시니를 보여주었습니다. 이에 비해 OVA의 적용은 알레르기성 안 질환이 있는 마우스에서 일부 MG의 파괴 및 손실을 유도했습니다(AED, 그림 4). 눈꺼풀의 조직학적 분석은 7일 동안 식염수만 투여한 순진한 마우스에 비해 확장된 MG를 나타냈으며(그림 5), 호중구가 축적되어 최종적으로 샘의 구멍을 막는 aggNET을 생성할 수 있습니다.
눈의 공막에서 각막을 분리하는 것은 눈 지구의 미끄러운 점액 표면으로 인해 번거로울 수 있습니다. 페트리 접시에 드라이 아이스에 안구를 3 분 동안 배양하면 눈을 고정하고 윤미를 약간 절개하고 각막을 해부 할 수 있습니다 (그림 6).
프로토콜 섹션에 나열된 단계는 각막과 결막의 수집을 촉진했습니다. 또한, OVA의 국소 투여는 결막에 심한 염증을 일으켰으며, 충혈 성 (그림 7).
안구 삼출물의 분석은 MGD의 발달에서 분자 메커니즘을 보여줍니다. 기재된 바와 같은 사이토카인 및 케모카인 정량화는 AED8을 갖는 마우스로부터의 상청액에서 호중구 혈관외 유출, 식작용 및 탈과립을 촉진하는 주요 케모카인 (CXCL-1)의 상승된 수준을 보여주었다. 또한, 급성기 반응 및 호중구 생산의 주요 매개체인 IL-6도 AED를 가진 마우스에서 유의하게 상승하였다. 반면에, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 농도는 나이브 마우스와 AED 마우스 모두에서 유의한 변화를 보이지 않았다(도 8).
그림 1 : 안와 영역을 둘러싼 안면 조직의 절제. 절개 흔적은 빨간색으로 표시됩니다. 이를 통해 안구 장기를 절제하고 결막 및 각막과 같은 부속 안구 기관에 대한 다양한 국소 투여 치료제의 영향과 효과를 조사할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: OVA 투여는 MGD의 임상 증상을 유발합니다 . (A) 식염수를 투여한 마우스는 눈을 크게 뜨고 건강한 안구 표면을 보여줍니다. (B) OVA 적용은 심한 안구 표면 염증, 눈의 좁은 열림 및 화학 요법의 징후를 유도합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 눈꺼풀을 따라 위치한 마이보미안 땀샘(MG)을 막는 덕트 플러그. (A) 7일 동안만 식염수를 투여한 마우스에서 과도한 안구 분비물이 없는 건강한 눈꺼풀의 대표적인 매크로 사진. (B) 챌린지 기간 후 MG의 큰 덕트 폐색과 부종을 보이는 눈꺼풀. 스케일 바 = 300 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 투과광 매크로 사진은 MG의 acini(빨간색 선)를 시각화할 수 있습니다. (A) 적외선 수준을 높이면 순진한 생쥐의 건강한 acini를 시각화하고 건강한 눈꺼풀에서 뚜렷한 주머니 모양의 acini를 공개합니다. (B) acini는 OVA 적용으로 마우스의 영향을받는 눈꺼풀에서 두껍게 나타납니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 눈꺼풀의 조직 학적 분석은 7 일 동안 반복적 인 OVA 모욕이있는 마우스에서 MG의 확장 된 덕트를 보여줍니다. (A) 순진한 마우스 눈꺼풀은 확장 된 덕트가 없음을 보여 주며 OVA 챌린지가있는 마우스와 달리 건강한 기능의 안구 기관을 나타냅니다. (B). 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 윤부 옆의 각막 절개 및 공막에서 각막 분리. 절개 지점을 보여주는 안구 이미지 (흰색 화살표로 표시). 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: OVA의 국소 투여 . (A) 각막을 보여주는 쥐 안구 장기의 매크로 사진. 스케일 바: 600 μm. (B) OVA에 도전한 마우스의 결막 염증. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 수집된 안구 삼출물에서 염증 마커의 측정. 나이브 마우스 (n = 7)와 MGD (n = 8)의 원심 분리 된 안구 삼출물의 상청액에서 사이토 카인 및 케모카인의 정량 분석. 데이터는 5%-95% 범위의 중앙값으로 표현됩니다. 통계적 유의성은 양측 Mann-Whitney U-검정을 사용하여 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Meibomian 땀샘의 기름진 분비는 건강한 눈22에 매우 중요합니다. 그러나, 양쪽 눈꺼풀의 족근판에 위치한 평행 가닥으로서 정렬된 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)에 의한 이들 피지선의 막힘은 눈물막(23)을 파괴할 수 있다. 이러한 파괴는 마이보미안 샘 기능 장애(MGD)1 를 초래하고 눈물 증발을 가속화하고 안구 표면의 손상을 조절합니다2. 이 프로토콜은 MG 폐쇄로 이어지는 면역 매개 안구 표면 염증을 확립하는 것을 설명합니다.
마우스 모델의 연구는 안구 표면 염증과 관련된 MG 폐쇄를 유발하는 근본적인 면역 매개 메커니즘을 확인했습니다. AED의 마우스 모델에서 호중구를 모집하는 강력한 TH17 반응 및 MGD 환자의 누액에서 호중구 및 기타 골수성 세포의 증가는 MG21을 방해하는 호중구의 역할을 나타냅니다. MG 오리피스를 폐색하는 aggNETs의 존재는 AED를 가진 마우스에서 펩티딜 아르기닌 데이미나제 4로 확인되었다. 이 모델에서 호중구는 MG 땀샘10의 덕트와 구멍을 막는 응집 및 형성 능력이 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, MGD 환자의 눈물 분석은 아나필라톡신 C5a 및 케모카인 IL-8의 증가를 보여 보체 시스템의 활성 증가 및 호중구 침윤의 높은 유입을 입증했다. 마지막으로, IL-6, IL-18, MCP-1/CCL-2 및 MIG/CXCL9와 같은 여러 호중구 기능과 관련된 사이토카인 수준의 증가는 MGD11의 발병기전에서 호중구의 주요 위치를 강조합니다.
MGD의 발생은 DED의 발달에 중요한 기여를하며, 안구 발현의 발병 기전에 관여하는 수많은 요소의 역할을 조사하는 것은 복잡합니다24. 따라서 동물을 모델로 선택하는 것은 조사중인 질문에 크게 영향을받습니다. 예를 들어, 토끼는 제형의 제약 테스트를 위한 통상적인 모델로서 작용한다; 고양이, 돼지 및 개 모델은 인간 환자와 유사한 병리학적 특성을 조사하기에 적합하고, 마우스는 주로 유전자 조작에 적합하다25.
동물 모델은 질병 발병기전을 조사하고 생체내에서 다양한 개입의 치료 효능을 조사하기 위한 유용한 도구이다. 예를 들어, 종래의 치료법은 임상 안구 증상을 치료하기 위한 점안액의 투여를 포함한다; 그러나 눈물 흐름과 눈물샘 배액 시스템으로 인해 이러한 안구 개입은 안구 표면에서 신속하게 제거됩니다. 이것은 일시적인 행동 만 유발하며 반복적 인 투여와 고용량이 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 안구 건조증(DED)의 토끼 모델은 대체 국소 치료제로 써모젤과 탄화 나노젤(CNG)을 검사하는 이상적인 매개체로 사용되었습니다. 히알루 론산과 아민 말단 폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드)의 서로 다른 정도의 황산화를 접합하여 얻은 써모 겔은 눈에 투여 될 때 겔로 변형됩니다. DED의 토끼 모델에서,이 겔은 더 오랜 시간 동안 유지되었고, 한 방울은 7 일의 추적 기간 동안 손상된 각막 상피를 복구하고, 세포 사멸을 멈추고, 안구 염증을 억제하여 selectin-매개 백혈구 상호 작용의 억제로 인한 백혈구 침윤의 중단을 시사한다26.
또한, DED의 토끼 모델에서 점안액으로서의 탄화 나노 젤 (CNGs)은 악화 된 염증 반응 및 산화 스트레스로 인한 눈물 결핍 및 과도한 눈물 증발을 치료하는 자유 라디칼 소거를 보였다. CNGs는 라이신 하이드로 클로라이드 (Lys-CNGs)의 열분해를 통해 얻어졌으며 단일 용량은 4 일 이내에 DED 증상을 완화했습니다. 유사한 치료 효과는 10 배 더 많은 양의 사이클로스포린 A 점안액을 여러 번 처리해야만 달성 할 수있었습니다. 이러한 새로운 생체 적합성 제약 중재는 전임상 동물 모델에서 단일 용량 중재 및 더 확장된 안구 보유로서 우수한 관점을 나타냈습니다27.
마우스 모델에서 여러 유전자의 녹아웃은 MGD의 발병 기전에 관여하는 여러 단백질의 역할을 밝혀 냈습니다. 예를 들어, 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체-감마(PPAR γ)24 의 조절불량 유전자 발현과 신호 전달 경로의 변화는 노화 동안 세포 주기 진입/증식, 지질 합성 및 마이보미안 샘 위축의 변화를 유도합니다13. 또한, 마우스 모델에서 βENaC (β - 상피 나트륨 채널)의 부재는 여성에서 널리 퍼진 MG 기능 장애 표현형이 의사 저 알도스테론증 1 (PHA) 28을 가진 인간에서와 같이 MG 위축 및 구멍 폐쇄와 관련이 있음을 나타냅니다. CD147의 필수적인 역할은 또한 마우스에서 밝혀졌으며, 마이 브 세포29의 풍부한 지질 함량을 유지하는 것으로 여겨진다. 효소 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1에 대해 결핍된 마우스는 상승된 산화적 지질 및 DNA 손상을 나타냈으며, 이는 MG 염증30의 증가와 관련이 있었다. 마지막으로, 마이붐 리피돔을 형성하는 극장쇄 지방산 잔기를 합성하는 데 필요한 효소를 암호화하는 ELOVL4의 단일 돌연변이는 전방 안구 표면(31)의 기능적 변화를 유도한다. 흥미롭게도, MGD는 또한 안과 제제32로서 아지트로 마이신의 치료 효능을 평가하기 위해 불완전한 지질 조성을 갖는 특수식이 요법을 갖는 마우스에서 유도되었다.
마우스 모델을 사용하는 대부분의 연구에서 MGD와 관련된 여러 유전자가 확인되었지만 많은 연구가 근본적인 면역 상태가 부족합니다. AED 모델은 인간 증발 MGD와 유사한 몇 가지 병리학 적 변화를 동반 한 면역 반응의 유도, IgE 항체 생성 및 이펙터 단계에서 가능한 모든 범위의 개입을 제공합니다.
언급된 프로토콜을 사용하여 MGD를 조사할 때 면역원(OVA 및 백일해 독소)을 1:1 비율로 명반에 추가하는 것이 중요합니다. 하나는 오발 부민-백일해 독소가 명반에 잘 흡착되도록 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양해야합니다. 이러한 상호 작용은 적절한 면역 반응을 유발하는 데 필수적입니다. 또한 예방 접종을하는 동안 복강의 기저 장기에 천공이 발생할 수 있으므로 주사하는 동안주의를 기울여야합니다. 이것은 마우스에서 부적절한 예방 접종 및 전신 염증을 유발할 수 있으며 면역 반응에 중대한 영향을 미칩니다.
안구 삼출물은 침투하는 면역 세포를 가두는 큰 거미줄 모양의 세포외 염색질 구조입니다. 따라서, 이 모델로부터 수집된 안구 삼출물의 MNase 처리는 단세포 현탁액11을 수득하는데 필수적이다. 또한, 이러한 삼출물은 안구 표면에서 수집하기 쉽고 순환에서 옮겨진 생존 가능한 호중구의 원천입니다. 이 기술의 주요 한계는 안구 표면에서 수집되는 삼출물의 양입니다. 각 눈에 50μL의 식염수를 추가하면 한 마리의 마우스에서 최대 100μL의 삼출물을 회수할 수 있습니다. 이것은 생화학 적 연구를위한 1-2 유세포 분석 (FACS) 염색 및 상청액에 거의 충분하지 않습니다.
나중에 눈과 주변 조직을 뽑기 위해 메스로 해부하면 종종 표재성 측두엽, 하부 눈꺼풀 정맥 또는 안각 정맥에 손상을 줄 수 있습니다. 출혈이 추가 조직 학적 준비를 방해 할 수 있으므로 눈 주위의 깊이가 적은 피부 절개를 만드는 것이 좋습니다. 한 조직을 해부하는 동안 건조하거나 윤활이 충분하지 않으면 구조적 특징이 손실될 수 있으므로 다른 조직을 PBS에 저장하는 것이 필수적입니다.
아이 글로브에서 각막을 해부하는 동안 드라이 아이스에서 아이 글로브를 배양해도 안정적인 제어가 가능하지 않으면 최대 5 분까지 시간을 연장하여 윤부 절개와 각막 분리가 가능합니다.
잠재적 응용 분야
MGD와 관련된 안구 표면 염증은 다 인성 질환입니다. 이러한 지질 분비선에서 기능 장애의 발달 및 진행은 안과, 전신, 호르몬 및 유전적 요인, 화학 물질, 약물, 기계적 유해 물질 및 면역학적 반응에 의해 유발될 수 있습니다33. 여러 연구에서 마이보미안 땀샘의 폐색과 염증 11,21,34,35,36,37,38을 유발하는 호중구가 보고되었습니다. 이러한 면역 경로를 방해하는 국소 및 전신 항염증 중재의 개발은 MGD로 인한 안구 불편으로 고통받는 환자에게 완화를 제공할 수 있습니다. 알레르기성 안과 질환의 쥐 모델은 전임상 환경에서 이러한 약제의 약동학 및 약력학적 특성을 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 이 질병 모델은 MGD를 다루기위한 적절한 전략의 개발을 가능하게하고 질병 유발 경로의 중요한 구성 요소를 표적으로하는 국소 또는 전신 항염증제의 적절한 투여를 결정하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) 2886 PANDORA 프로젝트 No.B3의 일부 지원을 받았습니다. 샤 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181 (C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 프로젝트 861878 및 폭스바겐-재단(보조금 97744)에서 MH로.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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