Summary
Oculaire oppervlakteontsteking schaadt de oculaire oppervlakteweefsels en compromitteert vitale functies van het oog. Het huidige protocol beschrijft een methode om oogontsteking te induceren en gecompromitteerde weefsels te verzamelen in een muismodel van Meibomian gland dysfunction (MGD).
Abstract
Oculaire oppervlakteziekten omvatten een reeks aandoeningen die de functies en structuren van het hoornvlies, het bindvlies en het bijbehorende oculaire oppervlaktekliernetwerk verstoren. Meibomklieren (MG) scheiden lipiden af die een bedekkende laag creëren die de verdamping van het waterige deel van de traanfilm voorkomt. Neutrofielen en extracellulaire DNA-vallen bevolken MG en het oculaire oppervlak in een muismodel van allergische oogziekte. Geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) formuleren een mesh-achtige matrix bestaande uit extracellulair chromatine dat MG-uitgangen afsluit en MG-disfunctie conditioneert. Hier wordt een methode voor het induceren van oculaire oppervlakteontsteking en MG-disfunctie gepresenteerd. De procedures voor het verzamelen van organen die verband houden met het oculaire oppervlak, zoals het hoornvlies, bindvlies en oogleden, worden in detail beschreven. Met behulp van gevestigde technieken voor het verwerken van elk orgaan, worden ook de belangrijkste morfologische en histopathologische kenmerken van MG-disfunctie getoond. Oculaire exsudaten bieden de mogelijkheid om de ontstekingstoestand van het oculaire oppervlak te beoordelen. Deze procedures maken het onderzoek mogelijk naar actuele en systemische ontstekingsremmende interventies op preklinisch niveau.
Introduction
Elke oogwenk vult de gladde traanfilm aan die over het hoornvlies is verspreid. De oculaire oppervlakte epithelia vergemakkelijkt de verdeling en juiste oriëntatie van de traanfilm op het oculaire oppervlak. Mucines worden geleverd door het hoornvlies en conjunctiva-epitheelcellen om het waterige deel van de traanfilm afkomstig van de traanklieren op het oogoppervlak te helpen positioneren. Ten slotte scheidt MG lipiden af die een bedekkende laag creëren die de verdamping van het waterige deel van de traanfilmvoorkomt 1,2,3. Op deze manier beschermen de gecoördineerde functies van alle oogorganen het oculaire oppervlak tegen binnendringende pathogenen of letsel en ondersteunen ze kristalhelder zicht zonder pijn of ongemak.
In een gezond oculair oppervlak veegt de oculaire vloeiende afscheiding of oogreum stof, dode epitheelcellen, bacteriën, slijm en immuuncellen weg. Geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) formuleren een mesh-achtige matrix bestaande uit extracellulair chromatine en nemen deze componenten op in het oogreum. AggNETs lossen ontstekingen op door de proteolytische afbraak van pro-inflammatoire cytokines en chemokines4. Wanneer ze echter disfunctioneel worden, drijven deze afwijkende aggNETs de pathogenese van ziekten zoals vasculaire occlusies in COVID-195, galstenen6 en sialolithiasis7. Evenzo spelen aggNETs op het oculaire oppervlak een beschermende rol en dragen ze bij aan het oplossen van ontstekingen van het sterk blootgestelde oppervlak8. Ofwel een overdreven vorming of gebrek aan aggNETs in het oogoppervlak kan de stabiliteit van de traanfilm aantasten en / of hoornvlieswonden, cicatriserende conjunctivitis en droge ogen veroorzaken. De obstructie van MG is bijvoorbeeld een belangrijke oorzaak van droge ogen9. Van AggNETs is ook bekend dat ze de stroom van lipidesecretie uit de kanalen van MG dichten en Meibomian gland dysfunction (MGD) veroorzaken. De congestie van MG-openingen door aggNETs veroorzaakt een gebrek aan vetvocht dat het oculaire oppervlak omhult en retrograde opgekropte vloeistof, wat resulteert in disfunctie van de klierfunctie en acinaire schade. Deze disfunctie kan leiden tot traanfilmverdamping, fibrose van de marges op de oogleden, oogontsteking en schadelijke schade aan de MG10,11.
In de loop der jaren zijn er verschillende diermodellen ontwikkeld om het pathologische proces van MGD bij mensen te imiteren. C57BL/6-muizen van 1 jaar hebben bijvoorbeeld geholpen bij het bestuderen van leeftijdsgerelateerde effecten op droge ogen (DED) en MGD, wat de oculaire ziektepathologie weerspiegelt bij patiënten van 50 jaar en oudervan 12,13,14 jaar. Bovendien zijn konijnen geschikte modellen voor het onderzoeken van de effecten van farmacologische interventies. Daarom is het induceren van MGD bij konijnen gemeld door de topische toediening van epinefrine of de systemische introductie van 13-cis-retinoïnezuur (isotretinoïne)15,16,17,18,19.
Hoewel deze diermodellen geschikt waren voor het bepalen van de verschillende factoren die bijdragen aan de pathofysiologie van MGD, waren ze beperkt in hun gebruik. Het muizenmodel van leeftijdsgebonden MGD was bijvoorbeeld ideaal voor het ontcijferen van elementen bij alleen oudere volwassenen, en daarom leken konijnen het meest geschikte diermodel om oculaire oppervlakteziekten te bestuderen, omdat ze het onderzoek van meerdere pathofysiologische mechanismen mogelijk maken. Vanwege het ontbreken van uitgebreide analytische hulpmiddelen om eiwitten aan het oculaire oppervlak te detecteren en omdat veel delen van het konijnengenoom niet zijn geannoteerd, zijn ze echter beperkt voor onderzoeken 20,21.
Bovendien leverden deze diermodellen die werden gebruikt om de pathogenese van droge ogen te onderzoeken, geen adequate details om de immunologische arm van de aandoening te analyseren die de ontsteking van het oculaire oppervlak veroorzaakt. Dienovereenkomstig toonde het muizenmodel van MGD ontwikkeld door Reyes et al. een verband tussen allergische oogziekte bij muizen en MGD bij mensen en benadrukte de immuunetiologie die verantwoordelijk is voor obstructieve MGD21. Dit model associeert allergische oogziekte met een TH17-respons die neutrofielen rekruteert naar het bindvlies en het ooglid, waardoor MGD en chronische oogontsteking ontstaat21. De inductie van MGD en oogontsteking in dit muizenmodel is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van stroomopwaartse gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling van lokale ontstekingen aangedreven door een voortdurende immuunrespons21. Het huidige protocol beschrijft de oculaire oppervlakteontsteking vergezeld van obstructieve MGD. Bij deze methode worden muizen geïmmuniseerd en na 2 weken gedurende 7 dagen uitgedaagd op het oculaire oppervlak met het immunogeen. Verder worden de stappen beschreven om oculair exsudaat en de bijbehorende oogorganen te isoleren tijdens acute ontsteking en de dissectie van het hoornvlies, bindvlies en oogleden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met dieren werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn en goedgekeurd door de dierenwelzijnscommissie van de Friedrich-Alexander-Universiteit Erlangen-Neurenberg (FAU) (vergunningsnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Vrouwelijke C57Bl/6 muizen in de leeftijd van 7-9 weken werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel) en gehouden in specifieke pathogeenvrije omstandigheden met cycli van 12 uur dag/nacht.
1. Inductie van murine oculaire oppervlakteontsteking
- Voer immunogeenvoorbereiding uit voor immunisatie.
- Bereid het immunogeen vers op de dag van immunisatie, meng ovalbumine (OVA, 50 mg / ml) en kinkhoesttoxine (100 μg / ml) in zoutoplossing en het adjuvante aluminiumhydroxide (40 mg / ml) (zie materiaaltabel) in een verhouding van 1: 1.
LET OP: Voer de opening, reconstitutie en immunogeenpreparaat van kinkhoesttoxine uit in een laminaire veiligheidskast. Draag beschermende kleding en vermijd elk contact met de huid. - Incubeer het immunogeen en het adjuvante mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en laad 100 μL in een spuit van 1 ml.
- Voer intraperitoneale injectie van de immunogeenoplossing uit in een niet-verdoofde muis.
- Houd de muis zachtjes bij de staart terwijl hij het kooirooster vastpakt. Houd de huid van de rug en het nekgebied tussen de duim en wijsvinger stevig vast en bevestig de staart en onderste ledematen tussen de ring en de pink tegen de palm van de hand.
- Houd de vaste muis met zijn kop naar beneden.
- Injecteer 100 μL van de bereide immunogeenoplossing in het rechter- of linkerkwadrant van de onderbuikholte.
- Bereid het immunogeen vers op de dag van immunisatie, meng ovalbumine (OVA, 50 mg / ml) en kinkhoesttoxine (100 μg / ml) in zoutoplossing en het adjuvante aluminiumhydroxide (40 mg / ml) (zie materiaaltabel) in een verhouding van 1: 1.
- Voer oculaire oppervlakte-uitdaging uit 2 weken na immunisatie.
- Verdoof de muis met isofluraan (2,5%).
- Breng 5 μL OVA (50 mg/ml) of zoutoplossing (0,9 % NaCl) per oog aan op beide ogen en wacht tot de druppel door het oog wordt geabsorbeerd. Dit duurt ~5 min.
- Herhaal de procedure 1x daags gedurende 7 dagen.
OPMERKING: De actuele toediening van medicijnen kan op dezelfde manier worden gedaan.
2. Verzameling van oculaire exsudaten
- Herstel de oculaire exsudaten gevormd tijdens de challenge fase door direct na de challenge 50 μL steriele zoutoplossing op het oog aan te brengen.
- Om een eencellige suspensie te verkrijgen, behandelt u de verzamelde oculaire afscheiding met recombinant MNase (2 x 106 gel U/ml, zie materiaaltabel) dat de cofactor calcium (5 mM) bij 37 °C bevat gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer bij 400 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Isoleer het supernatant en meet de cytokines en chemokines met behulp van multiplexed ELISA volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Het verkregen supernatant kan worden gebruikt voor eiwitanalyse en de pellet voor functionele testen zoals immunofenotypering, fagocytose, degranulatie en genexpressie.
3. Excisie van oculaire oppervlakteweefsels
- Ontleed de oogleden en oogbol volgens de onderstaande stappen.
- Euthanaseer de muis door CO 2-verstikking en cervicale dislocatie.
- Plaats de muis op een egaal oppervlak.
- Desinfecteer het baangebied rond het oog met een wattenstaafje geïmpregneerd met 70% ethanol.
- Maak een incisie tussen het oor en de retro-orbitale sinus en langs het oppervlak boven het plaveiselbot verticaal, waarbij de incisie horizontaal onder het onderste ooglid langs het maxillaire bot en boven het bovenste ooglid langs het voorhoofdsbeen wordt verlengd. Dit vormt een incisie rond het oog (figuur 1).
- Houd het ontleedde weefsel voorzichtig rond het oog met behulp van een gebogen tang en trek het weefsel en de oogbol eruit.
- Plaats de weggesneden organen in steriel PBS.
- Trim overtollig gezichtsspierweefsel rond de weggesneden bovenste oogleden met behulp van een scalpel en onder de stereomicroscoop.
- Verzamel het bindvlies volgens de onderstaande stappen.
- Plaats het bovenste ooglid op een droge petrischaal onder de stereomicroscoop.
- Gebruik een fijn pincet en een scalpel om de witachtige slijmlaag heel voorzichtig uit het binnenoppervlak van het ooglid te pellen.
- Ontleed vervolgens het hoornvlies volgens de onderstaande stappen.
- Leg de oogbol op een nieuwe droge petrischaal op droogijs gedurende 3 minuten.
- Neem de petrischaal in een stabiele positie op het bankoppervlak.
- Maak een kleine incisie aan de rand van het hoornvlies naast de limbus met een fijne scherpe schaar.
- Verleng de incisie met het scalpel rond de oogbol en scheid de sclera van het hoornvlies.
- Verwijder resten van de iris en de lens van de achterkant van het hoornvlies door royaal te spoelen met zoutoplossing.
4. Documentatie van meibomklier (MG) obstructie
- Om de MG en zijn openingen te beoordelen, plaatst u de weggesneden oogleden rechtop onder de stereomicroscoop (figuur 2).
- Leg beelden vast met epiverlichting met wit licht volgens de belichtingstijd en ISO-instellingen van de camera.
OPMERKING: Morfometrische analyse van deze beelden biedt betrouwbare kwantificering van de pluggrootte aan de uitlaat van de klieren. De kwantificering kan worden uitgevoerd door met het toverstokgereedschap de oogpluggen te schetsen en het commando "Deeltjes analyseren" van de Image J-software uit te voeren (zie Materiaaltabel).
5. Transilluminatie van oogleden (Meibomian gland morphology)
- Om het MG-gebied te beoordelen, plaatst u de weggesneden oogleden in een horizontale positie en schakelt u de achtergrondverlichting van de stereomicroscoop in die is uitgerust met een infraroodcamera (figuur 3).
- Maak foto's door de belichtingstijd aan te passen aan de ISO van de camera (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Infraroodbeeldvorming van deze getransillumineerde oogleden onder de stereomicroscoop kan helpen bij het meten van de vorm en grootte van elke acini. Morfometrische analyse van deze beelden biedt een betrouwbare kwantificering van de grootte en het aantal MG. De kwantificering kan worden uitgevoerd door de MG te schetsen met de toverstoktool en het commando "Deeltjes analyseren" van de Image J-software uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het huidige protocol beschrijft de opeenvolgende stappen voor het vaststellen van een muizenmodel van oogoppervlakontsteking. De protocollen zijn bedoeld om te laten zien hoe therapeutica lokaal kunnen worden toegepast, oculaire exsudaten kunnen worden verkregen en bijbehorende accessoire organen zoals gezonde en ontstoken oogleden (figuur 2), het hoornvlies en het bindvlies kunnen worden weggesneden. Aandacht moet worden besteed aan het ontleeden van de bovenste oogleden voor de isolatie van het bindvlies en het moet worden opgeslagen in 1x PBS tijdens de dissectie van het hoornvlies. Dit voorkomt het uitdrogen van het bindvlies, dat kan worden gebruikt voor histologische, farmacokinetische en genexpressiestudies.
OVA en zoutoplossing werden topisch aangebracht gedurende 7 opeenvolgende dagen na het bovengenoemde protocol. Muizen die topisch werden uitgedaagd met zoutoplossing vertoonden een gezond oculair oppervlak met wijd open ogen en een regelmatig knipperpatroon. Oculaire ontsteking werd echter geïnstigeerd bij geïmmuniseerde C57BL / 6J-muizen die werden uitgedaagd met OVA. De instillatie van OVA-oplossing op het oculaire oppervlak veroorzaakte jeuk en geen pijn gedurende de eerste 2 uur na instillatie. Exsudaat en ooglideczeem werden alleen waargenomen tijdens de laatste 3 dagen van de challengefase. Er was geen pijn zichtbaar, het beoordelen van het gedrag van de dieren. Daarom werd uitgegaan van een matig niveau van stress voor de muizen gedurende een korte periode. De dagelijkse OVA-uitdaging veroorzaakte klinische manifestaties zoals overvloedige oculaire afscheiding, chemose en smalle opening van de ogen. Bovendien hechtten de bovenste en onderste oogleden vaak aan elkaar, waardoor de essentiële functie van knipperen werd aangetast (figuur 2). Voor dit model werden strikte onderbrekingscriteria (Aanvullend Dossier) gevolgd en goedgekeurd door de lokale ethische raad voor dierproeven. De onmiddellijke onderbreking werd uitgevoerd als één muis op een bepaald moment 15 punten bereikte.
Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Na euthanasie werden de oogorganen weggesneden en bij hogere vergroting waargenomen. De weggesneden oogleden onder een microscoop vertoonden grote occlusies die de openingen van de MG en oedeem verstopten, in schril contrast met de gezonde oogleden met kleine pluggen van de klier die het ooglid bekleden (figuur 3).
Verder onderzoek van de infraroodtransilluminatie van de klier onthult het racemische uiterlijk van de acini van de MG. Dit maakt het mogelijk om de zichtbare Meibom-klieren (rood aangegeven) te kwantificeren. De oogleden van muizen met zoutoplossinguitdaging toonden de ronde acini die de MG vormde. Ter vergelijking: de toepassing van OVA veroorzaakte de vernietiging en het verlies van sommige MG bij muizen met allergische oogziekte (AED, figuur 4). De histologische analyse van de oogleden vertoonde verwijde MG in vergelijking met naïeve muizen toegediend met slechts zoutoplossing gedurende 7 dagen (figuur 5), waardoor de accumulatie van neutrofielen die aggNETs produceren die uiteindelijk de openingen van de klier belemmeren.
Het scheiden van het hoornvlies van de sclera van het oog kan omslachtig zijn vanwege het gladde slijmoppervlak van de oogbol. Door de oogbol gedurende 3 minuten op droogijs in een petrischaaltje te incuberen, kan het oog worden gefixeerd, een kleine incisie bij de limbus worden gemaakt en het hoornvlies worden ontleed (figuur 6).
De stappen die in de protocolsectie werden opgenomen, vergemakkelijkten het verzamelen van het hoornvlies en bindvlies. Bovendien bracht de lokale toediening van OVA ernstige ontstekingen toe aan het bindvlies, met een hyperemisch uiterlijk (figuur 7).
De analyse van oculaire exsudaten onthult moleculaire mechanismen in de ontwikkeling van MGD. Cytokine- en chemokinekwantificering zoals beschreven toonde verhoogde niveaus van de belangrijkste chemokine die neutrofiele extravasatie, fagocytose en degranulatie (CXCL-1) in de supernatanten van muizen met AED8 vergemakkelijkten. Bovendien was de belangrijkste mediator van de acute faserespons en neutrofielenproductie, IL-6, ook significant verhoogd bij muizen met AED. Aan de andere kant vertoonde de concentratie van IL-10, een ontstekingsremmend cytokine, geen significante veranderingen bij zowel naïeve als AED-muizen (figuur 8).
Figuur 1: Excisie van het gezichtsweefsel rond het orbitale gebied. Het incisiespoor is rood aangegeven. Dit maakt het mogelijk om de oogorganen te exciëren en de invloed en effecten van verschillende topisch toegediende therapieën op accessoire oogorganen zoals het bindvlies en het hoornvlies te onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Toediening van OVA veroorzaakt klinische manifestaties van MGD. (A) Muizen toegediende zoutoplossing vertonen een gezond oculair oppervlak met de ogen wijd open. (B) OVA-toepassing induceert ernstige oogoppervlakontsteking, de smalle opening van de ogen en tekenen van chemose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ductale pluggen die de Meibom-klieren (MG) langs de oogleden belemmeren. (A) Representatieve macrofoto van een gezond ooglid zonder overmatige oculaire afscheiding van een muis toegediende zoutoplossing gedurende slechts 7 dagen. (B) Ooglid met grote ductale occlusies van de MG en oedeem na de challenge periode. Schaalbalk = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Transilluminerende macrofotografie maakt de visualisatie van de MG's acini (rode lijnen) mogelijk. (A) Het verbeteren van infraroodniveaus visualiseert de gezonde acini van naïeve muizen en onthult de duidelijke zakvormige acini in de gezonde oogleden. (B) De acini lijken dik in de aangedane oogleden van de muizen met OVA-toepassing. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Histologische analyse van de oogleden toont verwijde kanalen van MG bij muizen met herhaalde OVA-belediging gedurende 7 dagen. (A) Naïeve muisoogleden tonen de afwezigheid van verwijde kanalen, die een gezond functionerend oculair orgaan (B) weergeven in tegenstelling tot muizen met OVA-uitdaging. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Incisie bij het hoornvlies naast de limbus en scheiding van het hoornvlies van de sclera. Afbeelding van de oogbol met het punt van incisie (aangegeven door witte pijl). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Lokale toediening van OVA. (A) Macrofoto's van muizenoculaire organen die het hoornvlies laten zien. Schaalbalk: 600 μm. (B) Ontstoken bindvlies van muizen die worden uitgedaagd met OVA. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Meting van ontstekingsmarkers in de verzamelde oculaire exsudaten. Kwantitatieve analyse van cytokines en chemokines in het supernatant van gecentrifugeerd oculair exsudaat van naïeve muizen (n = 7) en muizen met MGD (n = 8). Gegevens worden uitgedrukt als mediaan met een bereik van 5% -95%. Statistische significantie werd berekend met behulp van de tweezijdige Mann-Whitney U-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De olieachtige afscheiding van de Meibomklieren is van groot belang voor een gezond oog22. De obstructie van deze talgklieren door geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) die zich op een rij opstellen als parallelle strengen op de tarsale platen van beide oogleden, kan echter de traanfilm verstoren23. Deze verstoring resulteert in Meibomian gland dysfunction (MGD)1 en versnelde traanverdamping en conditioneert de schade aan het oculaire oppervlak2. Dit protocol beschrijft het vaststellen van immuungemedieerde oculaire oppervlakteontsteking die leidt tot MG-obstructie.
Studies van muismodellen hebben de onderliggende immuungemedieerde mechanismen bevestigd die MG-obstructie veroorzaken geassocieerd met oculaire oppervlakteontsteking. Een robuuste TH17-respons die neutrofielen rekruteert in het muismodel van AED en een toename van neutrofielen en andere myeloïde cellen in het traanvocht van patiënten met MGD wijst op de rol van neutrofielen die de MG21 belemmeren. De aanwezigheid van aggNETs die de MG-openingen afsluiten, werd bevestigd met peptidyl arginine deiminase 4 bij muizen met AED. In dit model vertoonden neutrofielen een verminderd vermogen om te aggregeren en vormden aggNETs die de kanalen en openingen van de MG-klieren belemmerden10. Bovendien toonde traananalyse van patiënten met MGD een toename van anafylafline C5a en chemokine IL-8, wat een verhoogde activiteit van het complementsysteem en een hoge instroom van neutrofiele infiltratie aantoont. Ten slotte onderstreept een toename van het niveau van cytokines geassocieerd met verschillende neutrofiele functies, zoals IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 en MIG / CXCL9, de primaire positie van neutrofielen in de pathogenese van MGD11.
Het optreden van MGD levert een belangrijke bijdrage aan de ontwikkeling van DED en het onderzoeken van de rol van de talrijke elementen die betrokken zijn bij de pathogenese van oculaire manifestaties is gecompliceerd24. Daarom wordt de selectie van dieren als model sterk beïnvloed door de vraag die wordt onderzocht. Konijnen dienen bijvoorbeeld als conventionele modellen voor het farmaceutisch testen van formuleringen; katten-, varkens- en hondenmodellen zijn geschikt voor het onderzoeken van pathologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met menselijke patiënten, en muizen zijn voornamelijk geschikt voor genetische manipulatie25.
Diermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het onderzoeken van ziektepathogenese en het onderzoeken van de therapeutische werkzaamheid van verschillende interventies in vivo. Conventionele behandelingen omvatten bijvoorbeeld het toedienen van oogdruppelinstillaties om klinische oculaire manifestaties te behandelen; vanwege de traanstroom en het traandrainagesysteem worden dergelijke oculaire ingrepen echter snel van het oculaire oppervlak verwijderd. Dit veroorzaakt slechts tijdelijke actie en vereist herhaalde toedieningen en hoge doses. Om dit probleem op te lossen, diende het konijnenmodel van droge ogenziekte (DED) als het ideale medium om thermogels en verkoolde nanogels (CNG's) te onderzoeken als alternatieve actuele behandelingen. Thermogels verkregen door verschillende graden van sulfatie van hyaluronzuur en een amine-geëindigde poly (N-isopropylacrylamlamamide) te conjugeren, wanneer toegediend aan het oog, transformeren in een gel. In het konijnenmodel van DED werd deze gel langer bewaard en een enkele druppel herstelde de beschadigde cornea-epithelia, stopte apoptose en onderdrukte oculaire ontsteking tijdens een follow-up van 7 dagen, wat een onderbreking in de leukocyteninfiltratie suggereert als gevolg van de remming van selectine-gemedieerde leukocyteninteractie26.
Bovendien vertoonden in het konijnenmodel van DED verkoolde nanogels (CNG's) als oogdruppels vrije radicalen die scheurtekort en overmatige traanverdamping behandelden, veroorzaakt door een verergerde ontstekingsreactie en oxidatieve stress. CNG's werden verkregen via de pyrolyse van lysinehydrochloride (Lys-CNG's) en toegediend, en een enkele dosis verminderde de DED-symptomen binnen 4 dagen. Een vergelijkbaar therapeutisch effect was alleen haalbaar met verschillende behandelingen van een 10-voudig hogere hoeveelheid cyclosporine A oogdruppelinstillaties. Deze nieuwe biocompatibele farmaceutische interventies vertoonden superieure perspectieven als interventies met één dosis en meer uitgebreide oculaire retentie in preklinische diermodellen27.
De knock-out van verschillende genen in muismodellen heeft de rol onthuld van meerdere eiwitten die betrokken zijn bij de pathogenese van MGD. Bijvoorbeeld, de ontregelde genexpressie van het peroxisoom proliferator-geactiveerd receptor-gamma (PPAR γ)24 en veranderingen in de signaalroute induceren veranderingen in de toegang tot de celcyclus / proliferatie, lipidesynthese en Meibomiaanse klieratrofie tijdens veroudering13. Bovendien gaf de afwezigheid van de βENaC (β - epitheliaal natriumkanaal) in een muismodel aan dat het MG-disfunctiefenotype dat voorkomt bij vrouwen geassocieerd was met MG-atrofie en openingobstructie zoals bij mensen met pseudohypoaldosteronisme 1 (PHA) 28. De essentiële rol van CD147 werd ook opgehelderd bij muizen en er wordt aangenomen dat het het rijke lipidegehalte van meibocyten29 handhaaft. Muizen met een tekort aan het enzym superoxide dismutase 1 vertoonden verhoogde oxidatieve lipide- en DNA-schade, wat verband hield met een toename van MG-ontsteking30. Ten slotte leidt een enkele mutatie in de ELOVL4 die codeert voor het enzym dat nodig is om extreem lange-keten vetzuurresiduen te synthetiseren die het meibum lipidoom vormen, tot functionele veranderingen in het voorste oculaire oppervlak31. Interessant is dat MGD ook werd geïnduceerd bij muizen met een speciaal dieet met onvolledige lipidesamenstelling om de therapeutische werkzaamheid van azitromycine als een oftalmische formulering te evalueren32.
Hoewel de meeste studies met muismodellen verschillende genen hebben geïdentificeerd die betrokken zijn bij MGD, missen velen een onderliggende immunologische aandoening. Het AED-model biedt een hele reeks mogelijke interventies van de inductie van de immuunrespons, de generatie van IgE-antilichamen en de effectorfase, vergezeld van verschillende pathologische veranderingen die lijken op menselijke verdampings-MGD.
Bij het onderzoeken van MGD met behulp van het genoemde protocol, is het cruciaal om immunogeen (OVA en kinkhoesttoxine) toe te voegen aan aluin in een verhouding van 1: 1. Men moet het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen voor een goede adsorptie van het ovalbumine-kinkhoesttoxine aan de aluin. Deze interacties zijn van vitaal belang voor het activeren van een adequate immuunrespons. Bovendien moet tijdens immunisatie aandacht worden besteed tijdens het injecteren, omdat dit kan leiden tot perforatie van de onderliggende organen van de peritoneale holte. Dit kan resulteren in onvoldoende immunisatie en systemische ontsteking bij de muis, met diepgaande effecten op de immuunrespons.
Oculaire exsudaten zijn grote webachtige extracellulaire chromatinestructuren die infiltrerende immuuncellen kooien. Daarom is MNase-behandeling van verzamelde oculaire exsudaten uit dit model van vitaal belang voor het verkrijgen van eencellige suspensies11. Bovendien zijn deze exsudaten gemakkelijk te verzamelen aan het oculaire oppervlak en zijn ze een bron van levensvatbare neutrofielen die uit de bloedsomloop zijn getransmigreerd. De belangrijkste beperking van deze techniek is de hoeveelheid exsudaat die moet worden verzameld van de oculaire oppervlakken. Door 50 μL zoutoplossing aan elk oog toe te voegen, kan tot 100 μL exsudaat van één muis worden hersteld. Dit is nauwelijks genoeg voor 1-2 flowcytometrie (FACS) kleuringen en supernatanten voor biochemische studies.
Ontleden met een scalpel om later het oog en de omliggende weefsels te plukken, kan vaak letsel veroorzaken aan de oppervlakkige temporale ader, inferieure palpebrale ader of oculaire hoekader. Het wordt geadviseerd om een incisie in de huid te maken met minder diepte rond het oog, omdat de bloeding verdere histologische preparaten kan verstoren. Tijdens de dissectie van één weefsel is het opslaan van andere weefsels in PBS essentieel, omdat drogen of onvoldoende smering kan leiden tot verlies van structurele kenmerken.
Tijdens de dissectie van het hoornvlies van de oogbol, als de incubatie van de oogbol op droogijs geen gestage controle mogelijk maakt, kan men de tijd verlengen tot maximaal 5 minuten, zodat de incisie bij de limbus en scheiding van het hoornvlies mogelijk is.
Potentiële toepassingen
Oogoppervlakontsteking geassocieerd met MGD is een multifactoriële ziekte. De ontwikkeling en progressie van disfunctie in deze lipide afscheidende klieren kan worden veroorzaakt door oogheelkundige, systemische, hormonale en genetische factoren, chemicaliën, geneesmiddelen, mechanische schadelijke agentia en immunologische reacties33. Verschillende studies hebben neutrofielen gemeld die occlusie van Meibom-klieren en ontsteking veroorzaken 11,21,34,35,36,37,38. De ontwikkeling van actuele en systemische ontstekingsremmende interventies die deze immunologische routes verstoren, kan verlichting bieden aan patiënten die lijden aan oculair ongemak als gevolg van MGD. Het muizenmodel van allergische oogziekte kan in een preklinische setting worden gebruikt om de farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen van deze middelen te onderzoeken. Dit ziektemodel maakt de ontwikkeling van geschikte strategieën mogelijk om MGD aan te pakken en helpt bij het bepalen van de juiste toediening van actuele of systemische ontstekingsremmende middelen die zich richten op vitale componenten in ziekteverwekkende routes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, en door de Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) aan MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
