Summary
דלקת במשטח העין פוגעת ברקמות פני השטח של העין ופוגעת בתפקודים חיוניים של העין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת דלקת עיניים ולאיסוף רקמות פגועות במודל עכברי של תפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD).
Abstract
מחלות פני השטח של העין כוללות מגוון של הפרעות המפריעות לתפקודים ולמבנים של הקרנית, הלחמית ורשת בלוטת פני השטח של העין הקשורה. בלוטות Meibomian (MG) מפרישות שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק המימי של סרט הדמעות. נויטרופילים ומלכודות דנ"א חוץ-תאיות מאכלסים את MG ואת משטח העין במודל עכברי של מחלת עיניים אלרגית. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי החופה את שקעי MG וממתנת תפקוד לקוי של MG. כאן, שיטה לגרימת דלקת פני השטח של העין ותפקוד לקוי של MG מוצגת. ההליכים לאיסוף איברים הקשורים למשטח העין, כגון הקרנית, הלחמית והעפעפיים, מתוארים בפירוט. באמצעות טכניקות מבוססות לעיבוד כל איבר, מוצגות גם התכונות המורפולוגיות וההיסטופתולוגיות העיקריות של תפקוד לקוי של MG. הפרשות עיניים מציעות את ההזדמנות להעריך את המצב הדלקתי של משטח העין. נהלים אלה מאפשרים לחקור התערבויות אנטי דלקתיות אקטואליות ומערכתיות ברמה הפרה-קלינית.
Introduction
כל הרף עין מחדש את שכבת הדמעות החלקה המפוזרת על הקרנית. אפיתליה של פני השטח של העין מקלה על ההתפלגות והכיוון הנכון של סרט הדמעות על משטח העין. מוצינים מסופקים על ידי תאי אפיתל הקרנית והלחמית כדי לסייע במיקום החלק המימי של סרט הדמעות המגיע מבלוטות הדמעות על פני העיניים. לבסוף, MG מפרישה שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק מימי של סרט הדמעות 1,2,3. באופן זה, הפונקציות המתואמות של כל איברי העין מגינות על משטח העין מפני פלישה לפתוגנים או פציעה ותומכות בראייה צלולה ללא כל כאב או אי נוחות.
במשטח עיניים בריא, הפרשות העיניים הזורמות או ריאה העין מסלקות אבק, תאי אפיתל מתים, חיידקים, ריר ותאי מערכת החיסון. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי ומשלבות רכיבים אלה בראום העין. AggNETs פותרים דלקת על ידי פירוק פרוטאוליטי של ציטוקינים מעודדי דלקת וכימוקינים4. עם זאת, כאשר הם הופכים לא מתפקדים, aggNETs אלה aggNETs מניעים את הפתוגנזה של מחלות כגון חסימות כלי דם ב- COVID-195, אבני מרה6, ו sialolithiasis7. באופן דומה, aggNETs על משטח העין ממלאים תפקיד מגן ותורמים לפתרון דלקת של משטח8 החשוף מאוד. היווצרות מוגזמת או היעדר aggNETs במשטח העין עלולים לפגוע ביציבות סרט הדמעות ו/או לגרום לפצעים בקרנית, דלקת הלחמית ומחלת העין היבשה. לדוגמה, חסימת MG היא גורם מוביל למחלת העין היבשה9. AggNETs ידועים גם לחבר את זרימת הפרשת השומנים מן הצינורות של MG ולגרום לתפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD). הגודש של MG orifices על ידי aggNETs גורם למחסור בנוזל שומני העוטף את משטח העין ונוזל מבוקבק מדרדר, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של בלוטת הבלוטה ונזק אקסינארי. תפקוד לקוי זה עלול לגרום לאידוי סרט מדמיע, פיברוזיס של שולי העפעפיים, דלקת עיניים ונזק מזיק ל- MG10,11.
מספר מודלים של בעלי חיים פותחו במהלך השנים כדי לחקות את התהליך הפתולוגי של MGD בבני אדם. לדוגמה, C57BL/6 עכברים בני שנה סייעו לחקור השפעות הקשורות לגיל על מחלות עיניים יבשות (DED) ו- MGD, המשקפות את הפתולוגיה של מחלות עיניים בחולים בני 50 ומעלה12,13,14. יתר על כן, ארנבות הן מודלים מתאימים לחקר ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות. לכן, גרימת MGD בארנבות דווחה על ידי מתן מקומי של אפינפרין או הכנסה מערכתית של 13-cis-retinoic חומצה (isotretinoin)15,16,17,18,19.
אף על פי שמודלים אלה של בעלי חיים היו מספיקים לקביעת הגורמים השונים שתרמו לפתופיזיולוגיה של MGD, הם היו מוגבלים בשימוש בהם. לדוגמה, מודל מורין של MGD תלוי גיל היה אידיאלי לפענוח אלמנטים במבוגרים בלבד, ולכן, ארנבות נראו כמודל החי המתאים ביותר לחקר מחלות פני השטח של העין, מכיוון שהן מאפשרות לחקור מנגנונים פתופיזיולוגיים מרובים. עם זאת, בשל היעדר כלים אנליטיים מקיפים לאיתור חלבונים על פני העין ומכיוון שחלקים רבים בגנום הארנב אינם מוזכרים, הם מוגבלים לחקירות20,21.
בנוסף, מודלים אלה של בעלי חיים המשמשים לחקור את הפתוגנזה של מחלת העין היבשה לא סיפקו פרטים נאותים כדי לנתח את הזרוע החיסונית של ההפרעה הגורמת דלקת של פני העין. בהתאם לכך, מודל המורין של MGD שפותח על ידי Reyes et al. הראה קשר בין מחלת עיניים אלרגית בעכברים לבין MGD בבני אדם והדגיש את האטיולוגיה החיסונית האחראית ל-MGD21 חסימתי. מודל זה מקשר בין מחלת עיניים אלרגית לתגובת TH17 המגייסת נויטרופילים ללחמית ולעפעף, וגורמת ל-MGD ולדלקת עיניים כרונית21. האינדוקציה של MGD ודלקת עיניים במודל מורין זה היא כלי רב ערך לחקר אירועים במעלה הזרם במהלך התפתחות של דלקת מקומית המונעת על ידי תגובה חיסונית מתמשכת21. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את דלקת פני השטח של העין המלווה ב- MGD חסימתי. בשיטה זו, עכברים מחוסנים, ולאחר שבועיים, מאותגרים על פני השטח של העין עם האימונוגן במשך 7 ימים. יתר על כן, מתוארים הצעדים לבידוד הפרשת העיניים ואיברי העין הקשורים אליהם במהלך דלקת חריפה וכריתת הקרנית, הלחמית והעפעפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המערבים בעלי חיים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות לרווחת בעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר-ארלנגן-נירנברג (FAU) (מספר היתר: 55.2.2-2532-2-1217). נקבות C57Bl/6 עכברים, בגילאי 7-9 שבועות שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) והוחזקו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים עם מחזורים של 12 שעות ביום/לילה.
1. אינדוקציה של דלקת משטח העין murine
- בצע הכנה אימונוגן לחיסון.
- הכינו את האימונוגן טרי ביום החיסון, ערבבו אובאלבומין (OVA, 50 מ"ג/מ"ל) ורעלן שעלת (100 מיקרוגרם/מ"ל) במי מלח ואת האלומיניום האדג'ובנטי הידרוקסיד (40 מ"ג/מ"ל) (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1.
אזהרה: בצע את הפתיחה, שחזור והכנת האימונוגן של רעלן שעלת בארון בטיחות למינרי. יש ללבוש ביגוד מגן ולהימנע מכל מגע עם העור. - לדגום את תערובת האימונוגן והאדג'ובנט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולהעמיס 100 μL לתוך מזרק 1 מ"ל.
- בצע הזרקה תוך צפקית של פתרון האימונוגן בעכבר לא מורדם.
- החזיקו את העכבר ברכות ליד הזנב תוך כדי אחיזה ברשת הכלובים. החזיקו בחוזקה את עור הגב ואת אזור הצוואר בין האגודל לאצבע המורה וקיבעו את הזנב והגפיים התחתונות בין הטבעת לאצבע הקטנה כנגד כף היד.
- השאר את העכבר הקבוע עם ראשו כלפי מטה.
- הזרקת 100 μL של תמיסת האימונוגן המוכנה ברביע הימני או השמאלי של חלל הבטן התחתונה.
- הכינו את האימונוגן טרי ביום החיסון, ערבבו אובאלבומין (OVA, 50 מ"ג/מ"ל) ורעלן שעלת (100 מיקרוגרם/מ"ל) במי מלח ואת האלומיניום האדג'ובנטי הידרוקסיד (40 מ"ג/מ"ל) (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1.
- יש לבצע את אתגר פני השטח של העיניים שבועיים לאחר החיסון.
- הרדמת העכבר עם איזופלורן (2.5%).
- יש למרוח 5 μL של OVA (50 מ"ג/מ"ל) או מי מלח (0.9% NaCl) על שתי העיניים ולהמתין עד שהטיפה תיספג בעין. זה לוקח ~ 5 דקות.
- חזור על ההליך 1 פעמים ביום במשך 7 ימים.
הערה: ניהול מקומי של תרופות יכול להיעשות באותו אופן.
2. אוסף של הפרשת עיניים
- שחזר את ההפרשות העיניות שנוצרו במהלך שלב האתגר על ידי מריחת 50 μL של מלח סטרילי על העין מיד לאחר האתגר.
- כדי לקבל תרחיף חד-תאי, טפל בהפרשות העיניים שנאספו באמצעות MNase רקומביננטי (2 x 106 ג'ל U/mL, ראה טבלת חומרים) המכיל את סידן קופקטור (5 mM) ב 37 °C למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
- לבודד את הסופר-נטנט ולמדוד את הציטוקינים והכימוקינים באמצעות ELISA מרובב על פי הוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
הערה: הסופרנטנט המתקבל יכול לשמש לניתוח חלבונים ולגלולה לבדיקות פונקציונליות כגון אימונופנוטיפינג, פאגוציטוזה, דה-גרנולציה וביטוי גנים.
3. כריתה של רקמות פני השטח של העין
- נתחו את העפעפיים ואת כדור העין בהתאם לשלבים הבאים.
- המתת העכבר על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם.
- הנח את העכבר על משטח אחיד.
- לחטא את האזור האורביטלי סביב העין עם ספוגית ספוגה עם 70% אתנול.
- בצע חתך בין האוזן לסינוס הרטרו-אורביטלי ולאורך המשטח מעל עצם הקשקש אנכית, תוך הרחבת החתך אופקית מתחת לעפעף התחתון לאורך העצם המקסילרית ומעל העפעף העליון לאורך העצם הקדמית. זה יוצר חתך סביב העין (איור 1).
- החזיקו בזהירות את הרקמה המנותקת סביב העין באמצעות מלקחיים מעוקלים ומשכו את הרקמה ואת גלגל העין החוצה.
- מניחים את האיברים שנכרתו ב- PBS סטרילי.
- יש לחתוך את רקמת שריר הפנים העודפת סביב העפעפיים העליונים שנכרתו באמצעות אזמל ומתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- אסוף את הלחמית לפי השלבים הבאים.
- הניחו את העפעף העליון על צלחת פטרי יבשה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- בעזרת פינצטה עדינה ואזמל, מקלפים בעדינות רבה את השכבה הרירית-לבנה מתוך המשטח הפנימי של העפעף.
- לאחר מכן, לנתח את הקרנית בעקבות השלבים הבאים.
- הניחו את גלובוס העיניים על צלחת פטרי יבשה חדשה על גבי קרח יבש למשך 3 דקות.
- קח את צלחת פטרי על משטח הספסל במצב יציב.
- בצע חתך קטן בגבול הקרנית ליד הלימבוס באמצעות מספריים חדים עדינים.
- מאריכים את החתך עם האזמל סביב כדור הארץ, ומפרידים בין הסקלרה לקרנית.
- הסירו את שאריות הקשתית והעדשה מהחלק האחורי של הקרנית על ידי שטיפה נדיבה בתמיסת מלח.
4. תיעוד של חסימת בלוטת Meibomian (MG)
- כדי להעריך את ה-MG ואת הפתחים שלו, הניחו את העפעפיים הכרותים במצב זקוף מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 2).
- צלם תמונות עם תאורה אפי-תאורה של אור לבן בהתאם לזמן החשיפה של המצלמה ולהגדרות ה-ISO.
הערה: ניתוח מורפומטרי של תמונות אלה מספק כימות אמין של גודל התקע בשקע הבלוטות. ניתן לבצע את הכימות על ידי התוויית כלי השרביט של תקעי העין וביצוע הפקודה "נתח חלקיקים" של תוכנת Image J (ראו טבלת חומרים).
5. טרנסילומינציה של עפעפיים (מורפולוגיה של בלוטת Meibomian)
- כדי להעריך את אזור ה-MG, מקמו את העפעפיים הכרותים במצב אופקי והפעילו את התאורה האחורית של הסטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת אינפרה-אדום (איור 3).
- צלם תמונות על-ידי התאמת זמן החשיפה בהתאם ל-ISO של המצלמה (ראו טבלת חומרים).
הערה: הדמיית אינפרא-אדום של עפעפיים טרנס-מוארים אלה מתחת לסטריאומיקרוסקופ יכולה לסייע במדידת הצורה והגודל של כל אצ'יני. ניתוח מורפומטרי של תמונות אלה מספק כימות אמין של גודל ומספר MG. ניתן לבצע את הכימות על ידי התוויית ה- MG עם כלי השרביט וביצוע הפקודה "נתח חלקיקים" של תוכנת Image J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הרציפים לביסוס מודל מורין של דלקת פני השטח של העין. מטרת הפרוטוקולים היא להראות כיצד ליישם טיפולים באופן מקומי, להשיג הפרשת עיניים ולהוציא איברים נלווים כגון עפעפיים בריאים ודלקתיים (איור 2), הקרנית והלחמית. יש לשים לב כאשר העפעפיים העליונים מנותקים לבידוד של הלחמית, וזה חייב להיות מאוחסן 1x PBS במהלך דיסקציה של הקרנית. זה ימנע את ייבוש הלחמית, אשר יכול לשמש למחקרים היסטולוגיים, פרמקוקינטיים וביטוי גנים.
OVA ותמיסת מלח יושמו באופן מקומי במשך 7 ימים רצופים לאחר הפרוטוקול הנ"ל. עכברים שאותגרו באופן מקומי עם מי מלח הראו משטח עיניים בריא עם עיניים פקוחות לרווחה ותבנית מצמוץ קבועה. עם זאת, דלקת עיניים נגרמה בעכברי C57BL/6J מחוסנים שאותגרו עם OVA. החדרת תמיסת OVA על משטח העין גרמה לגירוד, ולא לכאב, במשך השעתיים הראשונות לאחר ההחדרה. אקזמה של הפרשה ועפעפיים נצפתה רק במהלך 3 הימים האחרונים של שלב האתגר. שום כאב לא ניכר, אם לשפוט את התנהגותם של בעלי החיים. לכן, ההנחה הייתה רמה מתונה של לחץ על העכברים במשך פרק זמן קצר. אתגר ה-OVA היומי עורר ביטויים קליניים כמו הפרשות עיניים בשפע, כימוזה ופתיחה צרה של העיניים. בנוסף, העפעפיים העליונים והתחתונים נדבקו זה לזה לעתים קרובות, מה שפגע בתפקוד החיוני של מצמוץ (איור 2). קריטריונים מחמירים להפרעה (קובץ משלים) נקבעו עבור מודל זה ואושרו על ידי המועצה האתית המקומית לניסויים בבעלי חיים. ההפרעה המיידית בוצעה אם עכבר אחד הגיע ל -15 נקודות בכל זמן נתון.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
לאחר המתת חסד, איברי העיניים נכרתו ונצפו בהגדלה גבוהה יותר. העפעפיים שנכרתו תחת מיקרוסקופ הראו חסימות גדולות שחיברו את הפתחים של ה-MG והבצקת, בניגוד מוחלט לעפעפיים הבריאים שהראו תקעים קטנים של הבלוטה המרפדת את העפעף (איור 3).
בדיקה נוספת של הטרנסילומינציה האינפרא אדומה של הבלוטה מגלה את המראה הגזעי של האצ'יני של ה- MG. זה מאפשר לכמת את בלוטות Meibomian גלוי (מסומן באדום). העפעפיים של עכברים מאותגרים מלוחים הראו את האצ'יני העגול שיוצר את ה-MG. לשם השוואה, היישום של OVA גרם להרס ואובדן של חלק מה-MG בעכברים עם מחלת עיניים אלרגית (AED, איור 4). הניתוח ההיסטולוגי של העפעפיים הראה MG מורחב בהשוואה לעכברים תמימים שניתנו עם מלח בלבד במשך 7 ימים (איור 5), מה שאפשר הצטברות של נויטרופילים המייצרים aggNETs שלבסוף חוסמים את פתחי הבלוטה.
הפרדת הקרנית מהסקלרה של העין עלולה להיות מסורבלת בגלל המשטח הרירי החלקלק של כדור הארץ. דגירה של גלגל העין על קרח יבש בצלחת פטרי למשך 3 דקות מאפשרת לקבע את העין, לבצע חתך קטן בלימבוס ולנתח את הקרנית (איור 6).
השלבים שגויסו בסעיף הפרוטוקול הקלו על איסוף הקרנית והלחמית. בנוסף, מתן מקומי של OVA גרם לדלקת קשה בלחמית, עם מראה היפראמי (איור 7).
ניתוח של הפרשות עיניים חושף מנגנונים מולקולריים בפיתוח של MGD. כימות ציטוקינים וכימוקין כפי שתואר הראה רמות גבוהות של הכימוקין העיקרי המקל על אקסטרווסציה של נויטרופילים, פאגוציטוזה ודגרנולציה (CXCL-1) בסופרנטנטים מעכברים עםAED 8. בנוסף, המתווך העיקרי של תגובת הפאזה החריפה וייצור הנויטרופילים, IL-6, היה גם הוא גבוה באופן משמעותי בעכברים עם AED. מצד שני, הריכוז של IL-10, ציטוקין נוגד דלקת, לא הראה שינויים משמעותיים הן בעכברים תמימים והן בעכברי AED (איור 8).
איור 1: כריתה של רקמת הפנים המקיפה את האזור המסלולי. שביל החתך מסומן באדום. זה מאפשר לכרות את איברי העין ולחקור את ההשפעה וההשפעות של טיפולים שונים הניתנים באופן מקומי על איברי עיניים נלווים כגון הלחמית והקרנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מתן OVA גורם לביטויים קליניים של MGD . (A) עכברים שקיבלו תמיסת מלח מראים משטח עיניים בריא עם עיניים פקוחות לרווחה. (B) מריחת OVA גורמת לדלקת חמורה בפני השטח של העיניים, לפתיחה צרה של העיניים ולסימני כימוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תקעים צינוריים החוסמים את בלוטות המייבומיאן (MG) הממוקמות לאורך העפעפיים. (A) צילום מאקרו מייצג של עפעף בריא ללא הפרשות עיניים מוגזמות מעכבר שניתן לו מי מלח למשך 7 ימים בלבד. (B) עפעף המציג חסימות צינוריות גדולות של MG ובצקת לאחר תקופת האתגר. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: צילום מאקרו טרנס-מאיר מאפשר הדמיה של האצ'יני (קווים אדומים) של ה-MG. (A) שיפור רמות האינפרא אדום ממחיש את האצ'יני הבריא של עכברים תמימים וחושף את האצ'יני המובהק בצורת כיס בעפעפיים הבריאים. (B) האצ'יני נראה עבה בעפעפיים הפגועים של העכברים עם מריחת OVA. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח היסטולוגי של העפעפיים מראה צינורות מורחבים של MG בעכברים עם עלבון OVA חוזר ונשנה במשך 7 ימים . (A) עפעפי עכבר תמימים מראים היעדר צינורות מורחבים, המתארים איבר עיניים מתפקד בריא (B) בניגוד לעכברים עם אתגר OVA. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: חתך בקרנית ליד הלימבוס והפרדה של הקרנית מהסקלרה. תמונה של גלגל העין המציגה את נקודת החתך (מסומנת על ידי חץ לבן). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: ניהול מקומי של OVA . (A) תצלומי מאקרו של איברי עיניים מורין המראים את הקרנית. סרגל קנה מידה: 600 מיקרומטר. (B) דלקת לחמית מעכברים המאותגרים עם OVA. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: מדידת סמני דלקת בהפרשות העיניים שנאספו. ניתוח כמותי של ציטוקינים וכימוקינים בסופר-נטנט של הפרשת עיניים צנטריפוגדית של עכברים תמימים (n = 7) ועכברים עם MGD (n = 8). הנתונים מבוטאים כחציון עם טווח של 5%-95%. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן U-Mann-Whitney הדו-זנב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההפרשה השומנית של בלוטות Meibomian היא בעלת חשיבות רבה לעין בריאה22. עם זאת, החסימה של בלוטות החלב הללו על ידי מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות מצטברות (aggNETs) המיישרות קו כגדילים מקבילים הממוקמים על הלוחות הטרסליים של שני העפעפיים יכולה לשבש את סרט הדמעות23. הפרעה זו גורמת לתפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD)1 ולאידוי מואץ של דמעות וממתנת את הנזק של משטח העין2. פרוטוקול זה מתאר יצירת דלקת על פני השטח של העין בתיווך מערכת החיסון המובילה לחסימת MG.
מחקרים ממודלים של עכברים אישרו את המנגנונים הבסיסיים המתווכים במערכת החיסון הגורמים לחסימת MG הקשורה לדלקת על פני העיניים. תגובת TH17 חזקה המגייסת נויטרופילים במודל העכבר של AED ועלייה בנויטרופילים ובתאים מיאלואידים אחרים בנוזל הדמעות של חולים עם MGD מצביעה על תפקידם של נויטרופילים החוסמים את MG21. נוכחותם של aggNETs המסתירים את פתחי MG אושרה עם פפטידיל ארגינין דימינאז 4 בעכברים עם AED. במודל זה, נויטרופילים הראו יכולת מופחתת לצבור ויצרו aggNETs שחסמו את הצינורות והפתחים של בלוטות MG10. יתר על כן, ניתוח דמעות מחולים עם MGD הראה עלייה אנפילטוקסין C5a וכימוקין IL-8, המדגים פעילות מוגברת של מערכת המשלים וזרם גבוה של חדירת נויטרופילים. לבסוף, עלייה ברמת הציטוקינים הקשורים למספר פונקציות נויטרופילים, כגון IL-6, IL-18, MCP-1/CCL-2 ו-MIG/CXCL9, מדגישה את המיקום הראשוני של נויטרופילים בפתוגנזה של MGD11.
המופע של MGD הוא תורם משמעותי לפיתוח של DED, ובחינת התפקיד של אלמנטים רבים המעורבים פתוגנזה של ביטויים עיניים הוא מסובך24. לכן, בחירת בעלי החיים כמודלים מושפעת מאוד מהשאלה הנחקרת. לדוגמה, ארנבות משמשות כמודלים קונבנציונליים לבדיקות פרמצבטיות של פורמולציות; מודלים של חתולים, חזירים וכלבים מתאימים לחקר מאפיינים פתולוגיים הדומים לחולים אנושיים, ועכברים מתאימים בעיקר למניפולציה גנטית25.
מודלים של בעלי חיים הם כלים חשובים לחקר פתוגנזה של מחלות ולבחינת היעילות הטיפולית של התערבויות שונות in vivo. לדוגמה, טיפולים קונבנציונליים כוללים מתן החדרות טיפות עיניים לטיפול בתופעות עיניים קליניות; עם זאת, בשל זרימת דמעה ומערכת ניקוז הדמעות, התערבויות עיניים כאלה מוסרות במהירות מפני השטח של העין. זה גורם לפעולה זמנית בלבד ודורש מתן חוזר ומינונים גבוהים. כדי לפתור בעיה זו, מודל הארנב של מחלת העין היבשה (DED) שימש כמדיום האידיאלי לבחינת תרמוג'לים וננו-ג'לים פחמניים (CNGs) כטיפולים מקומיים חלופיים. תרמוג'לים המתקבלים על ידי הצמדת דרגות שונות של סולפציה של חומצה היאלורונית ופולי אמין (N-איזופרופיל אקרילאמיד), כאשר הם ניתנים לעין, הופכים לג'ל. בדגם הארנב של DED, ג'ל זה נשמר למשך זמן רב יותר, וטיפה אחת תיקנה את אפיתליה הקרנית הפגועה, עצרה אפופטוזיס והדחיק דלקת עיניים במהלך מעקב של 7 ימים, מה שמרמז על הפרעה בחדירת לויקוציטים עקב עיכוב אינטראקציה לויקוציטים בתיווך סלקטין26.
יתר על כן, במודל הארנב של DED, ננו-ג'לים פחמניים (CNGs) כטיפות עיניים הראו נטרול רדיקלים חופשיים בטיפול במחסור בדמעות ואידוי דמעות מוגזם שנגרם על ידי תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית. CNGs התקבלו באמצעות פירוליזה של ליזין הידרוכלוריד (Lys-CNGs) וניתנו, ומנה אחת הפחיתה את תסמיני DED תוך 4 ימים. השפעה טיפולית דומה הייתה ניתנת להשגה רק עם מספר טיפולים של כמות גבוהה פי 10 של החדרות ציקלוספורין A טיפות עיניים. התערבויות תרופתיות חדשניות אלה בעלות תאימות ביולוגית הציגו פרספקטיבות מעולות כהתערבויות במינון יחיד ושימור עיניים מורחב יותר במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים27.
הנוקאאוט של כמה גנים במודלים של עכברים חשף את תפקידם של חלבונים מרובים המעורבים בפתוגנזה של MGD. לדוגמה, ביטוי גנים לא מווסת של קולטן-גמא המופעל על-ידי פרוקסיזום (PPAR γ)24 ושינויים במסלול האיתות שלו גורמים לשינויים בכניסה/התפשטות של מחזור התא, סינתזת שומנים ואטרופיה של בלוטת Meibomian במהלך הזדקנות13. בנוסף, היעדר βENaC (β - ערוץ נתרן אפיתל) במודל עכבר הצביע על כך שהפנוטיפ של תפקוד לקוי של MG הנפוץ אצל נקבות היה קשור לאטרופיה של MG וחסימת פתחים כמו בבני אדם עם פסאודוהיפואלדוסטרוניזם 1(PHA)28. התפקיד החיוני של CD147 הובהר גם בעכברים, והוא האמין לשמור על תוכן השומנים העשיר של meibocytes29. עכברים שסבלו ממחסור באנזים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 הראו רמות גבוהות של נזק חמצוני לשומנים ולדנ"א, שנקשר לעלייה בדלקת MG30. לבסוף, מוטציה אחת ב-ELOVL4 המקודדת את האנזים הנדרש לסינתזה של שאריות חומצות שומן ארוכות שרשרת במיוחד היוצרות את ה-meibum lipidome מובילה לשינויים תפקודיים במשטח העין הקדמי31. מעניין, MGD היה גם המושרה בעכברים עם דיאטה מיוחדת עם הרכב שומנים שלם כדי להעריך את היעילות הטיפולית של azithromycin כמו פורמולה אופתלמי32.
בעוד שרוב המחקרים המשתמשים במודלים של עכברים זיהו מספר גנים המעורבים ב-MGD, רבים מהם חסרים מצב חיסוני בסיסי. מודל AED מספק מגוון שלם של התערבויות אפשריות החל מהשראת התגובה החיסונית, יצירת נוגדני IgE ושלב האפקטור, המלווה במספר שינויים פתולוגיים הדומים ל- MGD אידוי אנושי.
כאשר חוקרים MGD תוך שימוש בפרוטוקול שהוזכר, חיוני להוסיף אימונוגן (OVA ורעלן שעלת) לאלום ביחס של 1:1. יש לדגור את התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לספיחה טובה של רעלן השעלת לאלום. אינטראקציות אלה חיוניות להפעלת תגובה חיסונית נאותה. בנוסף, במהלך החיסון, יש לשים לב בזמן ההזרקה, שכן זה עלול לגרום ניקוב של האיברים הבסיסיים של חלל הצפק. הדבר עלול לגרום לחיסון לקוי ולדלקת מערכתית בעכבר, עם השפעה עמוקה על התגובה החיסונית.
הפרשות עיניים הן מבנים גדולים של כרומטין חוץ-תאי דמויי רשת, הכלואים תאים חיסוניים חודרים. לכן, טיפול MNase של הפרשת עיניים שנאספו ממודל זה הוא חיוני להשגת תרחיפים חד-תאיים11. בנוסף, ההפרשות הללו קלות לאיסוף על פני העין והן מקור לנויטרופילים בני קיימא שעברו מהמחזור. המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא כמות exudate להיאסף מן משטחי העין. הוספת 50 μL של מלח לכל עין מאפשרת התאוששות של עד 100 μL של הפרשה מעכבר אחד. זה בקושי מספיק עבור 1-2 ציטומטריה זרימה (FACS) כתמים ו supernatants עבור מחקרים ביוכימיים.
ניתוח עם אזמל כדי למרוט מאוחר יותר את העין ואת הרקמות הסובבות יכול לעתים קרובות לגרום לפגיעה בווריד הזמני השטחי, בווריד הפלפברלי התחתון או בווריד זווית העין. מומלץ ליצור חתך בעור עם פחות עומק סביב העין שכן הדימום יכול להפריע לתכשירים היסטולוגיים נוספים. במהלך כריתה של רקמה אחת, אחסון רקמות אחרות ב- PBS הוא חיוני מכיוון שייבוש או שימון לא מספיק עלולים לגרום לאובדן תכונות מבניות.
במהלך כריתת הקרנית מכדור העין, אם הדגירה של גלובוס העין על קרח יבש אינה מאפשרת שליטה יציבה, ניתן להאריך את הזמן עד 5 דקות כך שהחתך בלימבוס והפרדת הקרנית אפשריים.
יישומים פוטנציאליים
דלקת פני השטח של העין הקשורה ל- MGD היא מחלה רב-גורמית. התפתחות והתקדמות של תפקוד לקוי בבלוטות הפרשת שומנים אלה יכולה להיגרם על ידי גורמים עיניים, מערכתיים, הורמונליים וגנטיים, כימיקלים, תרופות, חומרים רעילים מכניים ותגובות אימונולוגיות33. מספר מחקרים דיווחו על נויטרופילים הגורמים לחסימה של בלוטות Meibomian ודלקת 11,21,34,35,36,37,38. פיתוח התערבויות אנטי דלקתיות מקומיות ומערכתיות המפריעות למסלולים חיסוניים אלה יכול להציע הקלה לחולים הסובלים מאי נוחות בעיניים עקב MGD. מודל מורין של מחלת עיניים אלרגית יכול לשמש בסביבה פרה-קלינית כדי לחקור את התכונות הפרמקוקינטיות והפרמקודינמיות של סוכנים אלה. מודל מחלה זה מאפשר לפתח אסטרטגיות מתאימות להתמודדות עם MGD ומסייע לקבוע מתן תקין של חומרים אנטי דלקתיים מקומיים או מערכתיים המכוונים לרכיבים חיוניים במסלולים הגורמים למחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) 2886 פרויקט PANDORA No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), פרויקט H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, ועל ידי קרן פולקסווגן (מענק 97744) ל- MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
