Summary
Inflammation i ögonytan skadar ögonytans vävnader och äventyrar ögats vitala funktioner. Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att inducera okulär inflammation och samla komprometterade vävnader i en musmodell av Meibomian körteldysfunktion (MGD).
Abstract
Okulära ytsjukdomar inkluderar en rad störningar som stör funktionerna och strukturerna i hornhinnan, konjunktiva och det tillhörande okulära ytkörtelnätverket. Meibomiska körtlar (MG) utsöndrar lipider som skapar ett täckskikt som förhindrar avdunstning av den vattenhaltiga delen av tårfilmen. Neutrofiler och extracellulära DNA-fällor fyller MG och ögonytan i en musmodell av allergisk ögonsjukdom. Aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) formulerar en nätliknande matris bestående av extracellulärt kromatin som täcker MG-utlopp och villkorar MG-dysfunktion. Här presenteras en metod för att inducera okulär ytinflammation och MG-dysfunktion. Förfarandena för att samla organ relaterade till ögonytan, såsom hornhinnan, konjunktiva och ögonlocken, beskrivs i detalj. Med hjälp av etablerade tekniker för bearbetning av varje organ visas också de viktigaste morfologiska och histopatologiska egenskaperna hos MG-dysfunktion. Okulära exsudater erbjuder möjlighet att bedöma det inflammatoriska tillståndet hos den okulära ytan. Dessa förfaranden möjliggör undersökning av aktuella och systemiska antiinflammatoriska ingrepp på preklinisk nivå.
Introduction
Varje ögonblick fyller på den släta tårfilmen som sprids över hornhinnan. Det okulära ytepitelet underlättar fördelningen och korrekt orientering av tårfilmen på ögonytan. Muciner tillhandahålls av hornhinnan och konjunktiva epitelceller för att hjälpa till att placera den vattenhaltiga delen av tårfilmen som kommer från lacrimalkörtlarna på ögonens yta. Slutligen utsöndrar MG lipider som skapar ett täckskikt som förhindrar avdunstning av den vattenhaltiga delen av tårfilmen 1,2,3. På detta sätt skyddar de samordnade funktionerna hos alla ögonorgan den okulära ytan från invaderande patogener eller skador och stöder kristallklar syn utan smärta eller obehag.
I en frisk okulär yta sveper den okulära flytande urladdningen eller ögonreumet bort damm, döda epitelceller, bakterier, slem och immunceller. Aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) formulerar en nätliknande matris bestående av extracellulärt kromatin och införlivar dessa komponenter i ögonreumet. AggNETs löser inflammation genom proteolytisk nedbrytning av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner4. Men när de blir dysfunktionella driver dessa avvikande aggNETs patogenesen av sjukdomar som vaskulära ocklusioner i COVID-195, gallsten6 och sialolithiasis7. På samma sätt spelar aggNET på den okulära ytan en skyddande roll och bidrar till att lösa inflammation i den högexponerade ytan8. Antingen en överdriven bildning eller brist på aggNET i ögonytan kan försämra tårfilmens stabilitet och / eller orsaka hornhinnesår, cikatriserande konjunktivit och torra ögonsjukdomar. Till exempel är obstruktionen av MG en ledande orsak till torra ögonsjukdomar9. AggNETs är också kända för att ansluta flödet av lipidsekretion från kanalerna i MG och orsaka Meibomian körtel dysfunktion (MGD). Överbelastningen av MG-öppningar av aggNETs orsakar brist på fettvätska som omsluter den okulära ytan och retrograd flaskvätska, vilket resulterar i dysfunktion i körtelfunktionen och acinarskador. Denna dysfunktion kan resultera i tårfilmsavdunstning, fibros av marginalerna på ögonlocken, ögoninflammation och skadlig skada på MG10,11.
Flera djurmodeller har utvecklats genom åren för att imitera den patologiska processen med MGD hos människor. Till exempel har C57BL/6-möss i åldern 1 år hjälpt till att studera åldersrelaterade effekter på torra ögonsjukdomar (DED) och MGD, vilket återspeglar ögonsjukdomspatologin hos patienter i åldern 50 år och äldre12,13,14. Dessutom är kaniner lämpliga modeller för att undersöka effekterna av farmakologiska ingrepp. Därför har inducerande MGD hos kaniner rapporterats genom antingen topisk administrering av adrenalin eller systemisk introduktion av 13-cis-retinsyra (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Även om dessa djurmodeller var tillräckliga för att bestämma de olika faktorer som bidrog till patofysiologin hos MGD, var de begränsade i deras användning. Till exempel var murinmodellen av åldersrelaterad MGD idealisk för att dechiffrera element endast hos äldre vuxna, och därför verkade kaniner vara den mest lämpliga djurmodellen för att studera okulära ytsjukdomar, eftersom de möjliggör undersökning av flera patofysiologiska mekanismer. På grund av bristen på omfattande analysverktyg för att detektera proteiner vid ögonytan och eftersom många delar av kaningenomet är oannoterade är de dock begränsade för undersökningar20,21.
Dessutom gav dessa djurmodeller som användes för att undersöka patogenesen av torra ögonsjukdomar inte tillräckliga detaljer för att analysera den immunologiska armen av sjukdomen som initierar inflammation i ögonytan. Följaktligen visade den murina modellen av MGD som utvecklats av Reyes et al. ett samband mellan allergisk ögonsjukdom hos möss och MGD hos människor och lyfte fram immunetiologin som är ansvarig för obstruktiv MGD21. Denna modell associerar allergisk ögonsjukdom med ett TH17-svar som rekryterar neutrofiler till konjunktiva och ögonlock, vilket orsakar MGD och kronisk okulär inflammation21. Induktionen av MGD och okulär inflammation i denna murina modell är ett värdefullt verktyg för att undersöka uppströms händelser under utvecklingen av lokal inflammation som drivs av ett pågående immunsvar21. Det nuvarande protokollet beskriver ögonytans inflammation åtföljd av obstruktiv MGD. I denna metod immuniseras möss och utmanas efter 2 veckor på ögonytan med immunogenet i 7 dagar. Vidare beskrivs stegen för att isolera okulärt exsudat och de associerade okulära organen under akut inflammation och dissektion av hornhinnan, konjunktiva och ögonlocken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök med djur utfördes enligt de institutionella riktlinjerna för djurskydd och godkändes av djurskyddskommissionen vid Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) (tillståndsnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Kvinnliga C57Bl/6-möss i åldern 7-9 veckor användes för den aktuella studien. Mössen erhölls från kommersiella källor (se materialförteckningen) och förvarades under specifika patogenfria förhållanden med 12 timmars dag/natt-cykler.
1. Induktion av murin okulär ytinflammation
- Utför immunogenberedning för immunisering.
- Bered immunogenet nyligen på immuniseringsdagen, blanda ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) och kikhosttoxin (100 μg / ml) i saltlösning och adjuvansen aluminiumhydroxid (40 mg / ml) (se materialtabell) i en 1: 1-andel.
VARNING: Utför öppning, beredning och immunogenberedning av kikhosttoxin i ett laminärt säkerhetsskåp. Använd skyddskläder och undvik kontakt med huden. - Inkubera immunogen- och adjuvansblandningen vid rumstemperatur i 30 minuter och ladda 100 μl i en 1 ml spruta.
- Utför intraperitoneal injektion av immunogenlösningen i en icke-bedövad mus.
- Håll musen mjukt i svansen medan du tar tag i burgallret. Håll fast huden på ryggen och nackområdet mellan tummen och pekfingret och fixera svansen och underbenen mellan ringen och lillfingret mot handflatan.
- Håll den fasta musen med huvudet nedåt.
- Injicera 100 μl av den beredda immunogenlösningen i höger eller vänster kvadrant i nedre bukhålan.
- Bered immunogenet nyligen på immuniseringsdagen, blanda ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) och kikhosttoxin (100 μg / ml) i saltlösning och adjuvansen aluminiumhydroxid (40 mg / ml) (se materialtabell) i en 1: 1-andel.
- Utför okulär ytutmaning 2 veckor efter immunisering.
- Bedöva musen med isofluran (2,5%).
- Applicera 5 μl OVA (50 mg/ml) eller saltlösning (0,9 % NaCl) per öga på båda ögonen och vänta tills droppen absorberas av ögat. Detta tar ~5 min.
- Upprepa proceduren 1x dagligen i 7 dagar.
OBS: Den aktuella administreringen av mediciner kan göras på samma sätt.
2. Samling av okulära exsudater
- Återställ de okulära exsudaterna som bildats under utmaningsfasen genom att applicera 50 μl steril saltlösning på ögat omedelbart efter utmaningen.
- För att erhålla en encellssuspension, behandla den uppsamlade okulära urladdningen med rekombinant MNase (2 x 106 gel U/ml, se materialtabell) som innehåller kofaktorkalcium (5 mM) vid 37 °C i 20 minuter.
- Centrifugera vid 400 x g i 7 min vid rumstemperatur.
- Isolera supernatanten och mät cytokinerna och kemokinerna med multiplexerad ELISA enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning).
OBS: Den erhållna supernatanten kan användas för proteinanalys och pelleten för funktionella analyser såsom immunofenotypning, fagocytos, degranulering och genuttryck.
3. Excision av okulära ytvävnader
- Dissekera ögonlocken och ögongloben enligt stegen nedan.
- Avliva musen genom CO2-kvävning och cervikal dislokation.
- Placera musen på en jämn yta.
- Desinficera orbitalområdet runt ögat med en vattpinne impregnerad med 70% etanol.
- Gör ett snitt mellan örat och retro-orbital sinus och längs ytan ovanför skivepitelbenet vertikalt, förläng snittet horisontellt under det nedre ögonlocket längs maxillärbenet och ovanför det övre ögonlocket längs frontbenet. Detta bildar ett snitt runt ögat (figur 1).
- Håll försiktigt den dissekerade vävnaden runt ögat med böjda pincett och dra ut vävnaden och ögongloben.
- Placera de utskurna organen i steril PBS.
- Trimma överflödig ansiktsmuskelvävnad runt de utskurna övre ögonlocken med en skalpell och under stereomikroskopet.
- Samla konjunktiva enligt stegen nedan.
- Placera det övre ögonlocket på en torr petriskål under stereomikroskopet.
- Använd fin pincett och en skalpell, skala det vitaktiga slemhinnan mycket försiktigt ur ögonlockets inre yta.
- Dissekera sedan hornhinnan enligt stegen nedan.
- Lägg ögongloben på en ny torr petriskål ovanpå torrisen i 3 minuter.
- Ta petriskålen på bänkytan i ett stabilt läge.
- Gör ett litet snitt vid hornhinnans kant bredvid limbus med fin skarp sax.
- Förläng snittet med skalpellen runt ögonklotet och separera sclera från hornhinnan.
- Ta bort rester av iris och linsen från baksidan av hornhinnan genom att generöst spola med saltlösning.
4. Dokumentation av meibomisk körtel (MG) obstruktion
- För att bedöma MG och dess öppningar, placera utskurna ögonlock i upprätt läge under stereomikroskopet (figur 2).
- Ta bilder med epi-belysning med vitt ljus enligt kamerans exponeringstid och ISO-inställningar.
OBS: Morfometrisk analys av dessa bilder ger tillförlitlig kvantifiering av pluggstorleken vid utloppet på körtlarna. Kvantifieringen kan utföras genom att med trollstavsverktyget beskriva ögonpluggarna och utföra kommandot "Analysera partiklar" i Image J-programvaran (se Materialförteckning).
5. Transillumination av ögonlock (Meibomian körtelmorfologi)
- För att bedöma MG-området, placera de utskurna ögonlocken i ett horisontellt läge och slå på bakgrundsbelysningen på stereomikroskopet utrustat med en infraröd kamera (figur 3).
- Ta bilder genom att justera exponeringstiden enligt kamerans (se materialförteckning) ISO.
OBS: Infraröd avbildning av dessa transilluminerade ögonlock under stereomikroskopet kan hjälpa till att mäta formen och storleken på varje acini. Morfometrisk analys av dessa bilder ger tillförlitlig kvantifiering av storleken och antalet MG. Kvantifieringen kan utföras genom att beskriva MG med trollstavsverktyget och utföra kommandot "Analysera partiklar" i Image J-programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver de sekventiella stegen för att upprätta en murin modell av okulär ytinflammation. Protokollen syftar till att visa hur man applicerar terapier lokalt, får okulära exsudater och punktskatteassocierade tillbehörsorgan som friska och inflammerade ögonlock (figur 2), hornhinnan och bindhinnan. Uppmärksamhet måste ägnas när de övre ögonlocken dissekeras för isolering av konjunktiva, och det måste förvaras i 1x PBS under dissektion av hornhinnan. Detta förhindrar torkning av konjunktiva, som kan användas för histologiska, farmakokinetiska och genuttrycksstudier.
OVA och saltlösning applicerades topiskt i 7 på varandra följande dagar efter ovannämnda protokoll. Möss som utmanades lokalt med saltlösning visade en hälsosam okulär yta med vidöppna ögon och ett regelbundet blinkande mönster. Okulär inflammation initierades dock hos immuniserade C57BL/6J-möss som utmanades med OVA. Instillationen av OVA-lösning på ögonytan orsakade klåda och inte smärta under de första 2 timmarna efter instillation. Exsudat och ögonlockseksem observerades endast under de sista 3 dagarna av utmaningsfasen. Ingen smärta var uppenbar, att döma djurens beteende. Därför antogs en måttlig stressnivå för mössen under en kort tidsperiod. Den dagliga OVA-utmaningen utlöste kliniska manifestationer som riklig okulär urladdning, kemos och smal öppning av ögonen. Dessutom fästes de övre och nedre ögonlocken ofta vid varandra, vilket försämrade den väsentliga funktionen att blinka (figur 2). Strikta avbrottskriterier (Supplementary File) följdes för denna modell och godkändes av den lokala etiska nämnden för djurförsök. Det omedelbara avbrottet utfördes om en mus nådde 15 poäng vid en viss tidpunkt.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Efter eutanasi skars ögonorganen ut och observerades vid högre förstoring. De utskurna ögonlocken under ett mikroskop visade stora ocklusioner som täppte till öppningarna av MG och ödem, i skarp kontrast till de friska ögonlocken som visar små pluggar i körteln som kantar ögonlocket (figur 3).
Ytterligare undersökning av körtelns infraröda transillumination avslöjar det racemiska utseendet på MG: s acini. Detta gör det möjligt att kvantifiera de synliga meibomiska körtlarna (anges i rött). Ögonlocken från saltlösningsutmanade möss visade att den runda acini bildade MG. I jämförelse inducerade tillämpningen av OVA förstörelsen och förlusten av viss MG hos möss med allergisk ögonsjukdom (AED, figur 4). Den histologiska analysen av ögonlocken visade dilaterad MG jämfört med naiva möss administrerade med endast saltlösning i 7 dagar (figur 5), vilket möjliggör ackumulering av neutrofiler som producerar aggNET som slutligen hindrar öppningarna i körteln.
Att separera hornhinnan från ögats sclera kan vara besvärligt på grund av den hala slemhinnan på ögongloben. Inkubera ögongloben på torris i en petriskål i 3 minuter gör det möjligt att fixera ögat, göra ett litet snitt vid limbus och dissekera hornhinnan (figur 6).
Stegen som anlitades i protokollavsnittet underlättade insamlingen av hornhinnan och konjunktiva. Dessutom orsakade den lokala administreringen av OVA allvarlig inflammation i konjunktiva, med ett hyperemiskt utseende (Figur 7).
Analysen av okulära exsudater avslöjar molekylära mekanismer i utvecklingen av MGD. Cytokin- och kemokinkvantifiering som beskrivs visade förhöjda nivåer av den huvudsakliga kemokin som underlättar neutrofil extravasation, fagocytos och degranulering (CXCL-1) hos supernatanterna från möss med AED8. Dessutom var den främsta medlaren för det akuta fassvaret och neutrofilproduktionen, IL-6, också signifikant förhöjd hos möss med AED. Å andra sidan visade koncentrationen av IL-10, ett antiinflammatoriskt cytokin, inga signifikanta förändringar hos både naiva och AED-möss (Figur 8).
Figur 1: Excision av ansiktsvävnaden som omger orbitalområdet. Snittspåret är markerat med rött. Detta gör det möjligt att excitera ögonorganen och undersöka påverkan och effekterna av olika lokalt administrerade terapier på tillbehörsögonorgan som konjunktiva och hornhinna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Administrering av äggceller orsakar kliniska manifestationer av MGD . (A) Möss som administreras saltlösning visar en frisk okulär yta med vidöppna ögon. (B) OVA-applicering inducerar allvarlig ögoninflammation, ögonöppning och tecken på kemos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Duktala pluggar som hindrar de meibomiska körtlarna (MG) som ligger längs ögonlocken. (A) Representativt makrofotografi av ett friskt ögonlock utan överdriven ögonurladdning från en mus som administrerats saltlösning endast i 7 dagar. (B) Ögonlock som visar stora duktala ocklusioner av MG och ödem efter utmaningsperioden. Skalstreck = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transilluminating macrophotography möjliggör visualisering av MG: s acini (röda linjer). (A) Att förbättra infraröda nivåer visualiserar den friska acini hos naiva möss och avslöjar den distinkta fickformade acini i de friska ögonlocken. (B) Acini verkar tjock i mössens drabbade ögonlock med OVA-applicering. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Histologisk analys av ögonlocken visar dilaterade kanaler av MG hos möss med upprepad OVA-förolämpning i 7 dagar . (A) Naiva musögonlock visar frånvaron av dilaterade kanaler, vilket visar ett hälsosamt fungerande okulärt organ (B) i motsats till möss med OVA-utmaning. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Snitt vid hornhinnan bredvid limbus och separation av hornhinnan från sclera. Bild av ögongloben som visar snittpunkten (indikeras med vit pil). Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Lokal administrering av OVA . (A) Makrofotografier av murina okulära organ som visar hornhinnan. Skalstång: 600 μm. (B) Inflammerad bindhinna från möss som utmanas med OVA. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Mätning av inflammatoriska markörer i de insamlade okulära exsudaterna. Kvantitativ analys av cytokiner och kemokiner i supernatanten av centrifugerat okulärt exsudat hos naiva möss (n = 7) och möss med MGD (n = 8). Data uttrycks som median med ett intervall på 5%-95%. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av det tvåsidiga Mann-Whitney U-testet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den oljiga utsöndringen av de meibomiska körtlarna är av stor betydelse för ett friskt öga22. Obstruktionen av dessa talgkörtlar av aggregerade neutrofila extracellulära fällor (aggNETs) som stämmer upp som parallella strängar som ligger på tarsalplattorna i båda ögonlocken kan emellertid störa tårfilmen23. Denna störning resulterar i Meibomian körtel dysfunktion (MGD)1 och accelererad tåravdunstning och villkorar skadan på ögonytan2. Detta protokoll beskriver etablering av immunmedierad okulär ytinflammation som leder till MG-obstruktion.
Studier från musmodeller har bekräftat de underliggande immunmedierade mekanismerna som orsakar MG-obstruktion i samband med okulär ytinflammation. Ett robust TH17-svar som rekryterar neutrofiler i musmodellen av AED och en ökning av neutrofiler och andra myeloida celler i tårvätskan hos patienter med MGD indikerar rollen som neutrofiler som hindrar MG21. Förekomsten av aggNETs som täcker MG-öppningarna bekräftades med peptidylarginindiminas 4 hos möss med AED. I denna modell visade neutrofiler en minskad kapacitet att aggregera och bildade aggNET som hindrade kanalerna och öppningarna i MG-körtlarna10. Dessutom visade tåranalys från patienter med MGD en ökning av anafylatoxin C5a och kemokin IL-8, vilket visade ökad aktivitet i komplementsystemet och en hög tillströmning av neutrofil infiltration. Slutligen understryker en ökning av nivån av cytokiner associerade med flera neutrofila funktioner, såsom IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 och MIG / CXCL9, neutrofilernas främsta position i patogenesen av MGD11.
Förekomsten av MGD är en betydande bidragsgivare till utvecklingen av DED, och att undersöka rollen hos de många element som är involverade i patogenesen av okulära manifestationer är komplicerat24. Därför påverkas valet av djur som modeller starkt av den fråga som undersöks. Till exempel fungerar kaniner som konventionella modeller för farmaceutisk testning av formuleringar; Katt-, svin- och hundmodeller är lämpliga för att undersöka patologiska egenskaper som liknar mänskliga patienter, och möss är främst lämpliga för genetisk manipulation25.
Djurmodeller är värdefulla verktyg för att undersöka sjukdomspatogenes och undersöka den terapeutiska effekten av olika interventioner in vivo. Till exempel inkluderar konventionella behandlingar administrering av ögondroppsinstillationer för att behandla kliniska okulära manifestationer; På grund av tårflödet och lacrimaldräneringssystemet avlägsnas emellertid sådana okulära ingrepp snabbt från ögonytan. Detta orsakar endast tillfälliga åtgärder och kräver upprepade administreringar och höga doser. För att lösa detta problem fungerade kaninmodellen av torra ögonsjukdomar (DED) som det perfekta mediet för att undersöka termogeler och kolsyrade nanogeler (CNG) som alternativa topiska behandlingar. Termogeler erhållna genom konjugering av olika grader av sulfatering av hyaluronsyra och en aminterminerad poly (N-isopropylakrylamid), när den administreras till ögat, omvandlas till en gel. I kaninmodellen av DED behölls denna gel under en längre tid, och en enda droppe reparerade det skadade hornhinneepiteliet, stoppade apoptos och undertryckt okulär inflammation under en uppföljning av 7 dagar, vilket tyder på ett avbrott i leukocytinfiltrationen på grund av hämningen av selektinmedierad leukocytinteraktion26.
Dessutom, i kaninmodellen av DED, kolsyrade nanogeler (CNG) som ögondroppar visade fria radikaler som behandlade tårbrist och överdriven tåravdunstning orsakad av ett förvärrat inflammatoriskt svar och oxidativ stress. CNG erhölls via pyrolys av lysinhydroklorid (Lys-CNG) och administrerades, och en enda dos mildrade DED-symtomen inom 4 dagar. En liknande terapeutisk effekt kunde endast uppnås med flera behandlingar av en 10-faldig högre mängd ciklosporin A-ögondroppsinstillationer. Dessa nya biokompatibla farmaceutiska interventioner uppvisade överlägsna perspektiv som endosinterventioner och mer utökad okulär retention i prekliniska djurmodeller27.
Knockouten av flera gener i musmodeller har avslöjat rollen för flera proteiner som är involverade i patogenesen av MGD. Till exempel inducerar det dysreglerade genuttrycket av den peroxisomproliferatoraktiverade receptor-gamma (PPAR γ)24 och förändringar i dess signalväg förändringar i cellcykelinträde / proliferation, lipidsyntes och Meibomian körtelatrofi under åldrande13. Dessutom indikerade frånvaron av βENaC (β - epitelial natriumkanal) i en musmodell att MG-dysfunktionsfenotypen som förekommer hos kvinnor var associerad med MG-atrofi och öppningsobstruktion som hos människor med pseudohypoaldosteronism 1(PHA)28. Den väsentliga rollen för CD147 belystes också hos möss, och det tros upprätthålla det rika lipidinnehållet i meibocyter29. Möss som saknade enzymet superoxiddismutas 1 visade förhöjd oxidativ lipid- och DNA-skada, vilket var kopplat till en ökning av MG-inflammation30. Slutligen leder en enda mutation i ELOVL4 som kodar för det enzym som krävs för att syntetisera extremt långkedjiga fettsyrarester som bildar meibum lipidomet till funktionella förändringar i den främre okulära ytan31. Intressant nog inducerades MGD också hos möss med en speciell diet med ofullständig lipidkomposition för att utvärdera den terapeutiska effekten av azitromycin som en oftalmisk formulering32.
Medan de flesta studier som använder musmodeller har identifierat flera gener som är involverade i MGD, saknar många ett underliggande immunologiskt tillstånd. AED-modellen ger en hel rad möjliga ingrepp från induktionen av immunsvaret, genereringen av IgE-antikroppar och effektorfasen, åtföljd av flera patologiska förändringar som liknar human evaporativ MGD.
När man undersöker MGD med hjälp av det nämnda protokollet är det viktigt att tillsätta immunogen (OVA och kikhosttoxin) till alun i en 1: 1-andel. Man bör inkubera blandningen i 30 min vid rumstemperatur för god adsorption av ovalbumin-kikhosttoxinet till alun. Dessa interaktioner är avgörande för att utlösa ett adekvat immunsvar. Dessutom måste man under immunisering vara uppmärksam vid injektion, eftersom detta kan leda till perforering av de underliggande organen i bukhålan. Detta kan leda till otillräcklig immunisering och systemisk inflammation i musen, med djupgående effekter på immunsvaret.
Okulära exsudater är stora webbliknande extracellulära kromatinstrukturer som burar infiltrerande immunceller. Därför är MNas-behandling av insamlade okulära exsudater från denna modell avgörande för att erhålla encellssuspensioner11. Dessutom är dessa exsudater lätta att samla vid ögonytan och är en källa till livskraftiga neutrofiler som har transmigrerat från cirkulationen. Huvudbegränsningen för denna teknik är mängden exsudat som ska samlas in från ögonytorna. Genom att tillsätta 50 μl saltlösning till varje öga kan man återhämta upp till 100 μL exsudat från en mus. Detta räcker knappt för 1-2 flödescytometri (FACS) färgningar och supernatanter för biokemiska studier.
Dissekering med en skalpell för att senare plocka ögat och omgivande vävnader kan ofta orsaka skada på den ytliga temporala venen, underlägsen palpebralvenen eller ögonvinkelvenen. Det rekommenderas att skapa ett snitt i huden med mindre djup runt ögat eftersom blödningen kan störa ytterligare histologiska preparat. Under dissektion av en vävnad är det viktigt att lagra andra vävnader i PBS eftersom torkning eller otillräcklig smörjning kan leda till förlust av strukturella egenskaper.
Under dissektion av hornhinnan från ögongloben, om inkubationen av ögonklotet på torris inte möjliggör en stadig kontroll, kan man förlänga tiden till upp till 5 min så att snittet vid limbus och separation av hornhinnan är möjligt.
Potentiella tillämpningar
Okulär ytinflammation i samband med MGD är en multifaktoriell sjukdom. Utvecklingen och utvecklingen av dysfunktion i dessa lipidutsöndrande körtlar kan orsakas av oftalmiska, systemiska, hormonella och genetiska faktorer, kemikalier, läkemedel, mekaniska skadliga medel och immunologiska svar33. Flera studier har rapporterat neutrofiler som orsakar ocklusion av meibomiska körtlar och inflammation 11,21,34,35,36,37,38. Utvecklingen av aktuella och systemiska antiinflammatoriska ingrepp som stör dessa immunologiska vägar kan erbjuda lindring för patienter som lider av okulärt obehag på grund av MGD. Den murina modellen av allergisk ögonsjukdom kan användas i en preklinisk miljö för att undersöka de farmakokinetiska och farmakodynamiska egenskaperna hos dessa medel. Denna sjukdomsmodell möjliggör utveckling av lämpliga strategier för att hantera MGD och hjälper till att bestämma korrekt administrering av aktuella eller systemiska antiinflammatoriska medel som riktar sig mot vitala komponenter i sjukdomsframkallande vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, och av Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) till MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
