Summary
Eine Entzündung der Augenoberfläche schädigt das Augenoberflächengewebe und beeinträchtigt lebenswichtige Funktionen des Auges. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer Augenentzündung und zur Sammlung von kompromittiertem Gewebe in einem Mausmodell der Meibom-Drüsendysfunktion (MGD).
Abstract
Zu den Erkrankungen der Augenoberfläche gehören eine Reihe von Erkrankungen, die die Funktionen und Strukturen der Hornhaut, der Bindehaut und des damit verbundenen Augenoberflächennetzwerks stören. Meibom-Drüsen (MG) sezernieren Lipide, die eine Deckschicht bilden, die die Verdunstung des wässrigen Teils des Tränenfilms verhindert. Neutrophile und extrazelluläre DNA-Fallen bevölkern MG und die Augenoberfläche in einem Mausmodell für allergische Augenerkrankungen. Aggregierte extrazelluläre Neutrophilenfallen (aggNETs) formulieren eine netzartige Matrix, die aus extrazellulärem Chromatin besteht, die MG-Ausgänge verdeckt und MG-Dysfunktion konditioniert. Hier wird eine Methode zur Induktion von Augenoberflächenentzündungen und MG-Dysfunktion vorgestellt. Die Verfahren zur Entnahme von Organen im Zusammenhang mit der Augenoberfläche, wie Hornhaut, Bindehaut und Augenlider, werden detailliert beschrieben. Mit etablierten Techniken zur Verarbeitung jedes Organs werden auch die wichtigsten morphologischen und histopathologischen Merkmale der MG-Dysfunktion gezeigt. Augenexsudate bieten die Möglichkeit, den Entzündungszustand der Augenoberfläche zu beurteilen. Diese Verfahren ermöglichen die Untersuchung topischer und systemischer entzündungshemmender Interventionen auf präklinischer Ebene.
Introduction
Jeder Wimpernschlag füllt den glatten Tränenfilm, der über die Hornhaut verteilt ist, wieder auf. Die Augenoberflächenepithel erleichtern die Verteilung und korrekte Ausrichtung des Tränenfilms auf der Augenoberfläche. Mucine werden von den Hornhaut- und Bindehautepithelzellen bereitgestellt, um den wässrigen Teil des Tränenfilms aus den Tränendrüsen auf der Augenoberfläche zu positionieren. Schließlich sondert MG Lipide ab, die eine Deckschicht bilden, die die Verdunstung des wässrigen Teils des Tränenfilms 1,2,3 verhindert. Auf diese Weise schützen die aufeinander abgestimmten Funktionen aller Augenorgane die Augenoberfläche vor eindringenden Krankheitserregern oder Verletzungen und unterstützen eine kristallklare Sicht ohne Schmerzen oder Beschwerden.
In einer gesunden Augenoberfläche fegt der okuläre fließende Ausfluss oder Augenrheum Staub, tote Epithelzellen, Bakterien, Schleim und Immunzellen weg. Aggregierte extrazelluläre Neutrophilenfallen (aggNETs) formulieren eine netzartige Matrix aus extrazellulärem Chromatin und bauen diese Komponenten in das Augenrheum ein. AggNETs lösen Entzündungen durch den proteolytischen Abbau von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinenauf 4. Wenn sie jedoch dysfunktional werden, treiben diese aberranten aggNETs die Pathogenese von Krankheiten wie Gefäßverschlüssen bei COVID-195, Gallensteinen6 und Sialolithiasis7 voran. In ähnlicher Weise spielen aggNETs auf der Augenoberfläche eine schützende Rolle und tragen zur Auflösung von Entzündungen der stark exponierten Oberfläche bei8. Entweder eine übertriebene Bildung oder ein Mangel an aggNETs in der Augenoberfläche kann die Stabilität des Tränenfilms beeinträchtigen und/oder Hornhautwunden, vernarbende Konjunktivitis und Erkrankungen des trockenen Auges verursachen. Zum Beispiel ist die Obstruktion von MG eine Hauptursache für die Erkrankung des trockenen Auges9. Es ist auch bekannt, dass AggNETs den Fluss der Lipidsekretion aus den MG-Kanälen verstopfen und eine Meibom-Drüsendysfunktion (MGD) verursachen. Die Stauung von MG-Öffnungen durch aggNETs verursacht einen Mangel an Fettflüssigkeit, die die Augenoberfläche umhüllt, und retrograde abgefüllte Flüssigkeit, was zu Funktionsstörungen der Drüsenfunktion und Azinusschäden führt. Diese Dysfunktion kann zu Tränenfilmverdunstung, Fibrose der Ränder an den Augenlidern, Augenentzündungen und schädlichen Schäden am MG10,11 führen.
Im Laufe der Jahre wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um den pathologischen Prozess der MGD beim Menschen nachzuahmen. Zum Beispiel haben C57BL / 6-Mäuse im Alter von 1 Jahr dazu beigetragen, altersbedingte Auswirkungen auf die Krankheit des trockenen Auges (DED) und MGD zu untersuchen, was die Pathologie der Augenerkrankung bei Patienten im Alter von 50 Jahren und älter widerspiegelt12,13,14. Darüber hinaus sind Kaninchen geeignete Modelle, um die Wirkung pharmakologischer Interventionen zu untersuchen. Daher wurde die Induktion von MGD bei Kaninchen entweder durch die topische Verabreichung von Adrenalin oder die systemische Einführung von 13-cis-Retinsäure (Isotretinoin)15,16,17,18,19 berichtet.
Obwohl diese Tiermodelle ausreichend waren, um die verschiedenen Faktoren zu bestimmen, die zur Pathophysiologie von MGD beitragen, waren sie in ihrer Verwendung eingeschränkt. Zum Beispiel war das murine Modell der altersbedingten MGD ideal für die Entschlüsselung von Elementen nur bei älteren Erwachsenen, und daher schienen Kaninchen das am besten geeignete Tiermodell zu sein, um Augenoberflächenerkrankungen zu untersuchen, da sie die Untersuchung mehrerer pathophysiologischer Mechanismen ermöglichen. Aufgrund des Fehlens umfassender analytischer Werkzeuge zum Nachweis von Proteinen an der Augenoberfläche und weil viele Teile des Kaninchengenoms unkommentiert sind, sind sie jedoch für Untersuchungen eingeschränkt20,21.
Darüber hinaus lieferten diese Tiermodelle, die zur Untersuchung der Pathogenese der Erkrankung des trockenen Auges verwendet wurden, keine ausreichenden Details, um den immunologischen Arm der Erkrankung zu analysieren, die die Entzündung der Augenoberfläche auslöst. Dementsprechend zeigte das von Reyes et al. entwickelte Mausmodell von MGD einen Zusammenhang zwischen allergischen Augenerkrankungen bei Mäusen und MGD beim Menschen und hob die Immunätiologie hervor, die für obstruktive MGD21 verantwortlich ist. Dieses Modell assoziiert allergische Augenerkrankungen mit einer TH17-Reaktion, die Neutrophile in die Bindehaut und das Augenlid rekrutiert, was MGD und chronische Augenentzündungen verursacht21. Die Induktion von MGD und Augenentzündung in diesem murinen Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung vorgelagerter Ereignisse während der Entwicklung lokaler Entzündungen, die durch eine anhaltende Immunantwort angetrieben werden21. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Entzündung der Augenoberfläche, begleitet von obstruktiver MGD. Bei dieser Methode werden Mäuse immunisiert und nach 2 Wochen 7 Tage lang auf der Augenoberfläche mit dem Immunogen herausgefordert. Weiterhin werden die Schritte zur Isolierung des Augenexsudats und der zugehörigen Augenorgane bei akuten Entzündungen und der Dissektion von Hornhaut, Bindehaut und Augenlidern beschrieben.
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Protocol
Alle Verfahren mit Tieren wurden nach den institutionellen Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt und von der Tierschutzkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) genehmigt (Genehmigungsnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Für die vorliegende Studie wurden weibliche C57Bl/6-Mäuse im Alter von 7-9 Wochen verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit 12 h Tag/Nacht-Zyklen gehalten.
1. Induktion einer Entzündung der Augenoberfläche der Maus
- Führen Sie eine Immunogenvorbereitung für die Immunisierung durch.
- Bereiten Sie das Immunogen frisch am Tag der Immunisierung vor, indem Sie Ovalbumin (OVA, 50 mg/ml) und Keuchhustentoxin (100 μg/ml) in Kochsalzlösung und dem Adjuvans Aluminiumhydroxid (40 mg/ml) (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1 mischen.
VORSICHT: Führen Sie die Öffnung, Rekonstitution und Immunogenpräparation von Pertussistoxin in einer laminaren Sicherheitswerkbank durch. Tragen Sie Schutzkleidung und vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit der Haut. - Das Immunogen- und Adjuvansgemisch bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren und 100 μL in eine 1-ml-Spritze laden.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Immunogenlösung in einer nicht betäubten Maus durch.
- Halten Sie die Maus sanft am Schwanz, während Sie das Käfiggitter greifen. Halten Sie die Haut des Rückens und die Nackenregion fest zwischen Daumen und Zeigefinger und fixieren Sie den Schwanz und die unteren Gliedmaßen zwischen dem Ring und dem kleinen Finger gegen die Handfläche.
- Halten Sie die feste Maus mit dem Kopf nach unten.
- Injizieren Sie 100 μL der vorbereiteten Immunogenlösung in den rechten oder linken Quadranten der unteren Bauchhöhle.
- Bereiten Sie das Immunogen frisch am Tag der Immunisierung vor, indem Sie Ovalbumin (OVA, 50 mg/ml) und Keuchhustentoxin (100 μg/ml) in Kochsalzlösung und dem Adjuvans Aluminiumhydroxid (40 mg/ml) (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1 mischen.
- Führen Sie 2 Wochen nach der Immunisierung eine Augenoberflächenprovokation durch.
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (2,5%).
- Tragen Sie 5 μL OVA (50 mg/ml) oder Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) pro Auge auf beide Augen auf und warten Sie, bis der Tropfen vom Auge absorbiert wird. Dies dauert ~5 Min.
- Wiederholen Sie den Vorgang 1x täglich für 7 Tage.
HINWEIS: Die topische Verabreichung von Medikamenten kann auf die gleiche Weise erfolgen.
2. Entnahme von Augenexsudaten
- Gewinnen Sie die während der Provokationsphase gebildeten Augenexsudate zurück, indem Sie unmittelbar nach der Challenge 50 μL sterile Kochsalzlösung auf das Auge auftragen.
- Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, behandeln Sie den gesammelten Augenausfluss mit rekombinanter MNase (2 x 106 Gel U/ml, siehe Materialtabelle), die den Cofaktor Calcium (5 mM) bei 37 °C für 20 min enthält.
- Bei 400 x g 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Isolieren Sie den Überstand und messen Sie die Zytokine und Chemokine mit einem gemultiplexten ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der erhaltene Überstand kann für die Proteinanalyse und das Pellet für funktionelle Assays wie Immunphänotypisierung, Phagozytose, Degranulation und Genexpression verwendet werden.
3. Exzision von Augenoberflächengewebe
- Sezieren Sie die Augenlider und die Augenkugel mit den folgenden Schritten.
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung und zervikale Dislokation.
- Platzieren Sie die Maus auf einer ebenen Fläche.
- Desinfizieren Sie den Augenorbitalbereich mit einem Tupfer, der mit 70% Ethanol imprägniert ist.
- Machen Sie einen Schnitt zwischen dem Ohr und dem retroorbitalen Sinus und entlang der Oberfläche über dem Plattenepithelknochen vertikal, wobei der Schnitt horizontal unter dem unteren Augenlid entlang des Oberkieferknochens und oberhalb des oberen Augenlids entlang des Stirnbeins verlängert wird. Dies bildet einen Schnitt um das Auge herum (Abbildung 1).
- Halten Sie das sezierte Gewebe vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette um das Auge herum und ziehen Sie das Gewebe und den Augapfel heraus.
- Legen Sie die herausgeschnittenen Organe in steriles PBS.
- Schneiden Sie überschüssiges Gesichtsmuskelgewebe um die herausgeschnittenen oberen Augenlider mit einem Skalpell und unter dem Stereomikroskop.
- Sammeln Sie die Bindehaut, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Legen Sie das obere Augenlid auf eine trockene Petrischale unter dem Stereomikroskop.
- Mit einer feinen Pinzette und einem Skalpell die weißlich-schleimige Schicht ganz vorsichtig aus der Innenseite des Augenlids abziehen.
- Als nächstes sezieren Sie die Hornhaut mit den folgenden Schritten.
- Legen Sie die Augenkugel für 3 min auf eine neue trockene Petrischale auf Trockeneis.
- Nehmen Sie die Petrischale in stabiler Position auf die Bankfläche.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt am Rand der Hornhaut neben dem Limbus mit einer feinen scharfen Schere.
- Verlängern Sie den Schnitt mit dem Skalpell um den Augenglobus und trennen Sie die Sklera von der Hornhaut.
- Entfernen Sie Reste der Iris und der Linse von der Rückseite der Hornhaut, indem Sie großzügig mit Kochsalzlösung spülen.
4. Dokumentation der Obstruktion der Meibom-Drüse (MG)
- Um das MG und seine Öffnungen zu beurteilen, platzieren Sie die herausgeschnittenen Augenlider in aufrechter Position unter dem Stereomikroskop (Abbildung 2).
- Nehmen Sie Bilder mit Weißlicht-Epi-Beleuchtung gemäß der Belichtungszeit der Kamera und den ISO-Einstellungen auf.
HINWEIS: Die morphometrische Analyse dieser Bilder liefert eine zuverlässige Quantifizierung der Pfropfengröße am Ausgang der Drüsen. Die Quantifizierung kann durchgeführt werden, indem mit dem Zauberstabwerkzeug die Augenstöpsel skizziert und der Befehl "Partikel analysieren" der Image J-Software ausgeführt wird (siehe Materialtabelle).
5. Durchleuchtung von Augenlidern (Meibom-Drüsenmorphologie)
- Um den MG-Bereich zu beurteilen, platzieren Sie die ausgeschnittenen Augenlider in einer horizontalen Position und schalten Sie die Hintergrundbeleuchtung des Stereomikroskops ein, das mit einer Infrarotkamera ausgestattet ist (Abbildung 3).
- Nehmen Sie Bilder auf, indem Sie die Belichtungszeit entsprechend der ISO-Norm der Kamera (siehe Materialtabelle) anpassen.
HINWEIS: Infrarotaufnahmen dieser transbeleuchteten Augenlider unter dem Stereomikroskop können helfen, die Form und Größe jedes Acini zu messen. Die morphometrische Analyse dieser Bilder liefert eine zuverlässige Quantifizierung der Größe und Anzahl von MG. Die Quantifizierung kann durchgeführt werden, indem das MG mit dem Zauberstabwerkzeug skizziert und der Befehl "Partikel analysieren" der Image J-Software ausgeführt wird.
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Representative Results
Das vorliegende Protokoll beschreibt die sequentiellen Schritte zur Erstellung eines murinen Modells der Augenoberflächenentzündung. Die Protokolle sollen zeigen, wie Therapeutika lokal angewendet, Augenexsudate gewonnen und assoziierte akzessorische Organe wie gesunde und entzündete Augenlider (Abbildung 2), Hornhaut und Bindehaut herausgeschnitten werden können. Es muss darauf geachtet werden, dass die oberen Augenlider zur Isolierung der Bindehaut seziert werden, und sie muss während der Dissektion der Hornhaut in 1x PBS gelagert werden. Dies verhindert das Austrocknen der Bindehaut, die für histologische, pharmakokinetische und Genexpressionsstudien verwendet werden kann.
OVA und Kochsalzlösung wurden topisch an 7 aufeinanderfolgenden Tagen nach dem oben genannten Protokoll angewendet. Mäuse, die topisch mit Kochsalzlösung herausgefordert wurden, zeigten eine gesunde Augenoberfläche mit weit geöffneten Augen und einem regelmäßigen Blinzelmuster. Eine Augenentzündung wurde jedoch bei immunisierten C57BL/6J-Mäusen ausgelöst, die mit OVA herausgefordert wurden. Das Einträufeln von OVA-Lösung auf die Augenoberfläche verursachte in den ersten 2 Stunden nach dem Einträufeln Juckreiz und keine Schmerzen. Exsudat und Augenlidekzeme wurden nur während der letzten 3 Tage der Provokationsphase beobachtet. Kein Schmerz war offensichtlich, wenn man das Verhalten der Tiere beurteilte. Daher wurde von einem moderaten Stressniveau für die Mäuse über einen kurzen Zeitraum ausgegangen. Die tägliche OVA-Herausforderung löste klinische Manifestationen wie reichlich Augenausfluss, Chemose und enge Öffnung der Augen aus. Darüber hinaus klebten Ober- und Unterlider häufig aneinander, was die wesentliche Funktion des Blinzelns beeinträchtigte (Abbildung 2). Für dieses Modell wurden strenge Unterbrechungskriterien (Supplementary File) befolgt und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche genehmigt. Die sofortige Unterbrechung wurde durchgeführt, wenn eine Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt 15 Punkte erreichte.
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Nach der Euthanasie wurden die Augenorgane herausgeschnitten und bei höherer Vergrößerung beobachtet. Die ausgeschnittenen Augenlider unter einem Mikroskop zeigten große Okklusionen, die die Öffnungen des MG und des Ödems verstopften, im krassen Gegensatz zu den gesunden Augenlidern, die kleine Pfropfen der Drüse zeigten, die das Augenlid auskleideten (Abbildung 3).
Eine weitere Untersuchung der Infrarotdurchleuchtung der Drüse zeigt das racemische Aussehen der Acini des MG. Dies ermöglicht die Quantifizierung der sichtbaren Meibom-Drüsen (rot markiert). Die Augenlider von Kochsalzlösungsmäusen zeigten die runden Acini, die das MG bildeten. Im Vergleich dazu induzierte die Anwendung von OVA die Zerstörung und den Verlust einiger MG bei Mäusen mit allergischen Augenerkrankungen (AED, Abbildung 4). Die histologische Analyse der Augenlider zeigte ein erweitertes MG im Vergleich zu naiven Mäusen, denen 7 Tage lang nur Kochsalzlösung verabreicht wurde (Abbildung 5), was die Ansammlung von Neutrophilen ermöglichte, die aggNETs produzieren, die schließlich die Öffnungen der Drüse verstopfen.
Das Trennen der Hornhaut von der Sklera des Auges kann aufgrund der rutschigen Schleimhautoberfläche der Augenkugel umständlich sein. Das Inkubieren des Augapfels auf Trockeneis in einer Petrischale für 3 min ermöglicht es, das Auge zu fixieren, einen kleinen Schnitt am Limbus zu machen und die Hornhaut zu sezieren (Abbildung 6).
Die im Protokollabschnitt aufgeführten Schritte erleichterten die Entnahme der Hornhaut und der Bindehaut. Darüber hinaus verursachte die lokale Verabreichung von OVA eine schwere Entzündung der Bindehaut mit einem hyperämischen Aussehen (Abbildung 7).
Die Analyse von Augenexsudaten zeigt molekulare Mechanismen bei der Entwicklung von MGD. Die beschriebene Zytokin- und Chemokinquantifizierung zeigte erhöhte Konzentrationen des Hauptchemokins, das die Extravasation, Phagozytose und Degranulation von Neutrophilen, Phagozytose und Degranulation (CXCL-1) in den Überständen von Mäusen mit AED8 erleichtert. Darüber hinaus war der Hauptmediator der akuten Phasenantwort und der neutrophilen Produktion, IL-6, bei Mäusen mit AED ebenfalls signifikant erhöht. Auf der anderen Seite zeigte die Konzentration von IL-10, einem entzündungshemmenden Zytokin, sowohl bei naiven als auch bei AED-Mäusen keine signifikanten Veränderungen (Abbildung 8).
Abbildung 1: Exzision des Gesichtsgewebes, das die Orbitalregion umgibt. Die Inzisionsspur ist rot markiert. Dies ermöglicht es, die Augenorgane herauszuschneiden und den Einfluss und die Wirkung verschiedener topisch verabreichter Therapeutika auf akzessorische Augenorgane wie Bindehaut und Hornhaut zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Verabreichung von OVA verursacht klinische Manifestationen von MGD. (A) Mäuse, denen Kochsalzlösung verabreicht wird, zeigen eine gesunde Augenoberfläche mit weit geöffneten Augen. (B) Die Anwendung der OVA induziert eine schwere Entzündung der Augenoberfläche, die enge Öffnung der Augen und Anzeichen einer Chemose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Duktale Pfropfen, die die Meibom-Drüsen (MG) entlang der Augenlider verstopfen. (A) Repräsentative Makroaufnahme eines gesunden Augenlids ohne übermäßigen Augenausfluss aus einer Maus, der nur 7 Tage lang Kochsalzlösung verabreicht wurde. (B) Augenlid mit großen duktalen Verschlüssen des MG und Ödemen nach der Herausforderungsperiode. Maßstabsbalken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Transilluminierende Makrofotografie ermöglicht die Visualisierung der Acini (rote Linien) des MG. (A) Die Verbesserung der Infrarotwerte visualisiert die gesunden Acini naiver Mäuse und enthüllt die ausgeprägten taschenförmigen Acini in den gesunden Augenlidern. (B) Die Acini erscheinen dick in den betroffenen Augenlidern der Mäuse mit OVA-Anwendung. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die histologische Analyse der Augenlider zeigt erweiterte MG-Gänge bei Mäusen mit wiederholter OVA-Beleidigung für 7 Tage . (A) Naive Mausaugenlider zeigen das Fehlen von erweiterten Kanälen und zeigen ein gesund funktionierendes Augenorgan (B) im Gegensatz zu Mäusen mit OVA-Herausforderung. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Schnitt an der Hornhaut neben dem Limbus und Trennung der Hornhaut von der Sklera. Bild des Augapfels mit dem Schnittpunkt (gekennzeichnet durch einen weißen Pfeil). Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Lokale Verabreichung von OVA . (A) Makroaufnahmen der Augenorgane der Maus, die die Hornhaut zeigen. Maßstabsbalken: 600 μm. (B) Entzündete Bindehaut von Mäusen, die mit OVA herausgefordert wurden. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Messung von Entzündungsmarkern in den gesammelten Augenexsudaten. Quantitative Analyse von Zytokinen und Chemokinen im Überstand von zentrifugiertem okulärem Exsudat von naiven Mäusen (n = 7) und Mäusen mit MGD (n = 8). Die Daten werden als Median mit einem Bereich von 5 % bis 95 % ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das ölige Sekret der Meibom-Drüsen ist für ein gesundes Auge von großer Bedeutung22. Die Obstruktion dieser Talgdrüsen durch aggregierte neutrophile extrazelluläre Fallen (aggNETs), die sich als parallele Stränge auf den Tarsalplatten beider Augenlider aneinanderreihen, kann jedoch den Tränenfilmstören 23. Diese Störung führt zu einer Meibom-Drüsendysfunktion (MGD)1 und beschleunigter Tränenverdunstung und konditioniert die Schädigung der Augenoberfläche2. Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung einer immunvermittelten Augenoberflächenentzündung, die zu einer MG-Obstruktion führt.
Studien aus Mausmodellen haben die zugrunde liegenden immunvermittelten Mechanismen bestätigt, die MG-Obstruktion verursachen, die mit einer Entzündung der Augenoberfläche verbunden ist. Eine robuste TH17-Rekrutierung von Neutrophilen im Mausmodell von AED und ein Anstieg von Neutrophilen und anderen myeloischen Zellen in der Tränenflüssigkeit von Patienten mit MGD weisen auf die Rolle von Neutrophilen hin, die das MG21 behindern. Das Vorhandensein von aggNETs, die die MG-Öffnungen verdecken, wurde mit Peptidylarginin-Deiminase 4 bei Mäusen mit AED bestätigt. In diesem Modell zeigten Neutrophile eine verminderte Fähigkeit zur Aggregation und bildeten aggNETs, die die Kanäle und Öffnungen der MG-Drüsen10 blockierten. Darüber hinaus zeigte die Tränenanalyse von Patienten mit MGD einen Anstieg von Anaphylatoxin C5a und Chemokin IL-8, was eine erhöhte Aktivität des Komplementsystems und einen hohen Zustrom neutrophiler Infiltration zeigte. Schließlich unterstreicht eine Erhöhung des Zytokinspiegels, die mit mehreren neutrophilen Funktionen wie IL-6, IL-18, MCP-1/CCL-2 und MIG/CXCL9 assoziiert sind, die Hauptposition von Neutrophilen in der Pathogenese von MGD11.
Das Auftreten von MGD trägt wesentlich zur Entwicklung von DED bei, und die Untersuchung der Rolle der zahlreichen Elemente, die an der Pathogenese okulärer Manifestationen beteiligt sind, ist kompliziert24. Daher wird die Auswahl der Tiere als Modelle stark von der untersuchten Fragestellung beeinflusst. Zum Beispiel dienen Kaninchen als konventionelle Modelle für pharmazeutische Tests von Formulierungen; Katzen-, Schweine- und Hundemodelle eignen sich zur Untersuchung pathologischer Merkmale ähnlich wie menschliche Patienten, und Mäuse eignen sich hauptsächlich für genetische Manipulationen25.
Tiermodelle sind wertvolle Werkzeuge, um die Krankheitspathogenese zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit verschiedener Interventionen in vivo zu untersuchen. Zum Beispiel umfassen konventionelle Behandlungen die Verabreichung von Augentropfeninstillationen zur Behandlung klinischer Augenmanifestationen; Aufgrund des Tränenflusses und des Tränendrainagesystems werden solche Augeneingriffe jedoch schnell von der Augenoberfläche entfernt. Dies verursacht nur vorübergehende Maßnahmen und erfordert wiederholte Verabreichungen und hohe Dosen. Um dieses Problem zu lösen, diente das Kaninchenmodell der Krankheit des trockenen Auges (DED) als ideales Medium, um Thermogele und karbonisierte Nanogele (CNGs) als alternative topische Behandlungen zu untersuchen. Thermogele, die durch Konjugation verschiedener Sulfatierungsgrade von Hyaluronsäure und einem aminterminierten Poly (N-Isopropylacrylamid) erhalten werden, verwandeln sich bei Verabreichung an das Auge in ein Gel. Im Kaninchenmodell von DED wurde dieses Gel für eine längere Zeit beibehalten, und ein einziger Tropfen reparierte die beschädigten Hornhautepithelien, stoppte die Apoptose und unterdrückte die Augenentzündung während einer Nachbeobachtungszeit von 7 Tagen, was auf eine Unterbrechung der Leukozyteninfiltration aufgrund der Hemmung der Selektin-vermittelten Leukozyteninteraktion hindeutet26.
Darüber hinaus zeigten im Kaninchenmodell von DED karbonisierte Nanogele (CNGs) als Augentropfen freie Radikale, die Tränenmangel und übermäßige Tränenverdunstung behandelten, die durch eine verstärkte Entzündungsreaktion und oxidativen Stress verursacht wurden. CNGs wurden durch die Pyrolyse von Lysinhydrochlorid (Lys-CNGs) gewonnen und verabreicht, und eine Einzeldosis milderte die DED-Symptome innerhalb von 4 Tagen. Eine ähnliche therapeutische Wirkung war nur mit mehreren Behandlungen einer 10-fach höheren Menge an Ciclosporin-A-Augentropfen-Instillationen erreichbar. Diese neuartigen biokompatiblen pharmazeutischen Interventionen zeigten überlegene Perspektiven als Einzeldosis-Interventionen und eine längere Augenretention in präklinischen Tiermodellen27.
Das Knockout mehrerer Gene in Mausmodellen hat die Rolle mehrerer Proteine enthüllt, die an der Pathogenese von MGD beteiligt sind. Zum Beispiel induzieren die fehlregulierte Genexpression des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-gamma (PPAR γ)24 und Veränderungen in seinem Signalweg Veränderungen des Zellzykluseintritts / der Zellproliferation, der Lipidsynthese und der Meibom-Drüsenatrophie während des Alterns13. Darüber hinaus zeigte das Fehlen des βENaC (β - epithelialen Natriumkanals) in einem Mausmodell, dass der bei Frauen vorherrschende Phänotyp der MG-Dysfunktion mit MG-Atrophie und Öffnungsobstruktion wie beim Menschen mit Pseudohypoaldosteronismus 1(PHA)28 assoziiert war. Die wesentliche Rolle von CD147 wurde auch bei Mäusen aufgeklärt, und es wird angenommen, dass es den reichen Lipidgehalt von Meibozyten beibehält29. Mäuse, denen das Enzym Superoxiddismutase 1 fehlte, zeigten erhöhte oxidative Lipid- und DNA-Schäden, die mit einer Zunahme der MG-Entzündung verbunden waren30. Schließlich führt eine einzige Mutation im ELOVL4, die für das Enzym kodiert, das zur Synthese extrem langkettiger Fettsäurereste erforderlich ist, die das Meimum-Lipidom bilden, zu funktionellen Veränderungen in der vorderen Augenoberfläche31. Interessanterweise wurde MGD auch bei Mäusen mit einer speziellen Diät mit unvollständiger Lipidzusammensetzung induziert, um die therapeutische Wirksamkeit von Azithromycin als ophthalmologische Formulierung zu bewerten32.
Während die meisten Studien mit Mausmodellen mehrere Gene identifiziert haben, die an MGD beteiligt sind, fehlt vielen eine zugrunde liegende immunologische Erkrankung. Das AED-Modell bietet eine ganze Reihe möglicher Interventionen von der Induktion der Immunantwort über die Erzeugung von IgE-Antikörpern bis hin zur Effektorphase, begleitet von mehreren pathologischen Veränderungen, die der menschlichen Verdunstungs-MGD ähneln.
Bei der Untersuchung von MGD unter Verwendung des genannten Protokolls ist es wichtig, dem Alaun im Verhältnis 1:1 Immunogen (OVA und Pertussis-Toxin) zuzusetzen. Man sollte die Mischung für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, um eine gute Adsorption des Ovalbumin-Pertussis-Toxins an den Alaun zu gewährleisten. Diese Wechselwirkungen sind entscheidend für die Auslösung einer adäquaten Immunantwort. Darüber hinaus muss während der Immunisierung während der Injektion darauf geachtet werden, da dies zu einer Perforation der darunter liegenden Organe der Peritonealhöhle führen kann. Dies kann zu einer unzureichenden Immunisierung und systemischen Entzündungen bei der Maus führen, mit tiefgreifenden Auswirkungen auf die Immunantwort.
Okuläre Exsudate sind große netzartige extrazelluläre Chromatinstrukturen, die infiltrierende Immunzellen einsperren. Daher ist die MNase-Behandlung von gesammelten okulären Exsudaten aus diesem Modell von entscheidender Bedeutung, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten11. Darüber hinaus sind diese Exsudate leicht an der Augenoberfläche zu sammeln und sind eine Quelle für lebensfähige Neutrophile, die aus dem Kreislauf transmigriert sind. Die Haupteinschränkung dieser Technik ist die Menge an Exsudat, die von den Augenoberflächen gesammelt werden soll. Die Zugabe von 50 μL Kochsalzlösung zu jedem Auge ermöglicht die Rückgewinnung von bis zu 100 μL Exsudat aus einer Maus. Dies reicht kaum für 1-2 Durchflusszytometrie (FACS) Färbungen und Überstände für biochemische Studien.
Das Sezieren mit einem Skalpell, um später das Auge und das umgebende Gewebe zu zupfen, kann oft zu Verletzungen der oberflächlichen Schläfenvene, der Vena palpebral inferior oder der Augenwinkelvene führen. Es wird empfohlen, einen Hautschnitt mit weniger Tiefe um das Auge herum zu erstellen, da die Blutung weitere histologische Vorbereitungen beeinträchtigen kann. Während der Dissektion eines Gewebes ist die Lagerung anderer Gewebe in PBS unerlässlich, da das Trocknen oder unzureichende Schmierung zum Verlust struktureller Merkmale führen kann.
Während der Dissektion der Hornhaut aus der Augenkugel, wenn die Inkubation der Augenkugel auf Trockeneis keine stetige Kontrolle ermöglicht, kann man die Zeit auf bis zu 5 min verlängern, so dass der Schnitt am Limbus und die Trennung der Hornhaut möglich ist.
Mögliche Anwendungen
Die mit MGD verbundene Entzündung der Augenoberfläche ist eine multifaktorielle Erkrankung. Die Entwicklung und das Fortschreiten einer Funktionsstörung in diesen lipidsekretierenden Drüsen kann durch ophthalmische, systemische, hormonelle und genetische Faktoren, Chemikalien, Medikamente, mechanische Schadstoffe und immunologische Reaktionen verursachtwerden 33. Mehrere Studien haben Neutrophile berichtet, die einen Verschluss der Meibom-Drüsen und Entzündungen verursachen 11,21,34,35,36,37,38. Die Entwicklung topischer und systemischer entzündungshemmender Interventionen, die diese immunologischen Signalwege stören, kann Patienten mit Augenbeschwerden aufgrund von MGD Linderung verschaffen. Das murine Modell der allergischen Augenerkrankung kann in einem präklinischen Umfeld verwendet werden, um die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften dieser Wirkstoffe zu untersuchen. Dieses Krankheitsmodell ermöglicht die Entwicklung geeigneter Strategien zur Bekämpfung von MGD und hilft bei der Bestimmung der richtigen Verabreichung von topischen oder systemischen entzündungshemmenden Wirkstoffen, die auf lebenswichtige Komponenten in krankheitsverursachenden Signalwegen abzielen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) 2886 PANDORA Projekt-Nr.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; SFB 1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Projekt 861878, und von der Volkswagen-Stiftung (Förderung 97744) an MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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