Summary
A inflamação da superfície ocular prejudica os tecidos da superfície ocular e compromete as funções vitais do olho. O presente protocolo descreve um método para induzir inflamação ocular e coletar tecidos comprometidos em um modelo de camundongo de disfunção da glândula de Meibomian (MGD).
Abstract
As doenças da superfície ocular incluem uma série de distúrbios que perturbam as funções e estruturas da córnea, da conjuntiva e da rede de glândulas da superfície ocular associada. As glândulas meibomianas (MG) secretam lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal. Neutrófilos e armadilhas de DNA extracelular povoam MG e a superfície ocular em um modelo de rato de doença ocular alérgica. As armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular que oclui as saídas de MG e condiciona a disfunção de MG. Aqui, um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da MG é apresentado. Os procedimentos para a coleta de órgãos relacionados à superfície ocular, como córnea, conjuntiva e pálpebras, são descritos em detalhes. Usando técnicas estabelecidas para o processamento de cada órgão, as principais características morfológicas e histopatológicas da disfunção da MG também são mostradas. Os exsudatos oculares oferecem a oportunidade de avaliar o estado inflamatório da superfície ocular. Esses procedimentos possibilitam a investigação de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas em nível pré-clínico.
Introduction
Cada piscar de olhos reabastece o filme lacrimal liso disperso sobre a córnea. Os epitélios da superfície ocular facilitam a distribuição e a orientação correta do filme lacrimal na superfície ocular. As mucinas são fornecidas pelas células epiteliais da córnea e da conjuntiva para ajudar a posicionar a parte aquosa do filme lacrimal proveniente das glândulas lacrimais na superfície dos olhos. Finalmente, a MG secreta lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal 1,2,3. Desta forma, as funções coordenadas de todos os órgãos oculares protegem a superfície ocular de patógenos invasores ou lesões e suportam a visão cristalina sem qualquer dor ou desconforto.
Em uma superfície ocular saudável, a descarga ocular que flui ou o reum ocular varre a poeira, as células epiteliais mortas, as bactérias, o muco e as células imunes. Armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular e incorporam esses componentes no reum ocular. Os AggNETs resolvem a inflamação pela degradação proteolítica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas4. No entanto, quando se tornam disfuncionais, esses aggNETs aberrantes impulsionam a patogênese de doenças como oclusões vasculares na COVID-195, cálculos biliares6 e sialolitíase7. Da mesma forma, os aggNETs na superfície ocular desempenham um papel protetor e contribuem para a resolução da inflamação da superfície altamente exposta8. Uma formação exagerada ou a falta de aggNETs na superfície ocular pode prejudicar a estabilidade do filme lacrimal e/ou causar feridas na córnea, conjuntivite cicatrizante e doença do olho seco. Por exemplo, a obstrução da MG é uma das principais causas de doença do olho seco9. AggNETs também são conhecidos por obstruir o fluxo de secreção lipídica dos ductos de MG e causar disfunção da glândula meibomiana (MGD). A congestão dos orifícios de MG por aggNETs causa falta de fluido gorduroso envolvendo a superfície ocular e fluido engarrafado retrógrado, resultando em disfunção da função da glândula e danos acinares. Essa disfunção pode resultar em evaporação do filme lacrimal, fibrose das margens das pálpebras, inflamação ocular e dano prejudicial à MG10,11.
Vários modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para imitar o processo patológico da MGD em humanos. Por exemplo, camundongos C57BL/6 com 1 ano de idade ajudaram a estudar os efeitos relacionados à idade na doença do olho seco (DED) e MGD, refletindo a patologia da doença ocular em pacientes com 50 anos ou mais12,13,14. Além disso, os coelhos são modelos apropriados para investigar os efeitos das intervenções farmacológicas. Portanto, a indução de MGD em coelhos tem sido relatada pela administração tópica de epinefrina ou pela introdução sistêmica de ácido 13-cis-retinóico (isotretinoína)15,16,17,18,19.
Embora esses modelos animais fossem adequados para determinar os diferentes fatores que contribuem para a fisiopatologia da MGD, eles foram restritos em sua utilização. Por exemplo, o modelo murino de MGD relacionada à idade foi ideal para decifrar elementos apenas em adultos mais velhos e, portanto, os coelhos pareceram ser o modelo animal mais adequado para estudar doenças da superfície ocular, pois permitem a investigação de múltiplos mecanismos fisiopatológicos. No entanto, devido à falta de ferramentas analíticas abrangentes para detectar proteínas na superfície ocular e porque muitas partes do genoma do coelho não são anotadas, elas são limitadas para investigações20,21.
Além disso, esses modelos animais utilizados para investigar a patogênese da doença do olho seco não forneceram detalhes adequados para analisar o braço imunológico do distúrbio que instiga a inflamação da superfície ocular. Nesse sentido, o modelo murino de MGD desenvolvido por Reyes et al. mostrou associação entre doença ocular alérgica em camundongos e MGD em humanos e destacou a etiologia imunológica responsável pela MGD obstrutiva21. Esse modelo associa a doença alérgica ocular a uma resposta TH17 que recruta neutrófilos para a conjuntiva e pálpebra, causando MGD e inflamação ocular crônica21. A indução de MGD e inflamação ocular neste modelo murino é uma ferramenta valiosa para investigar eventos a montante durante o desenvolvimento de inflamação local impulsionada por uma resposta imune contínua21. O protocolo atual descreve a inflamação da superfície ocular acompanhada de MGD obstrutiva. Neste método, os ratos são imunizados e, após 2 semanas, desafiados na superfície ocular com o imunógeno por 7 dias. Além disso, os passos para isolar o exsudato ocular e os órgãos oculares associados durante a inflamação aguda e a dissecção da córnea, conjuntiva e pálpebras são descritos.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre bem-estar animal e aprovados pela comissão de bem-estar animal da Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permissão: 55.2.2-2532-2-1217). Camundongos fêmeas C57Bl/6, com idades entre 7-9 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos em condições específicas livres de patógenos com ciclos de 12 h dia/noite.
1. Indução da inflamação da superfície ocular murina
- Realizar preparação de imunógenos para imunização.
- Preparar o imunógeno recentemente no dia da imunização, misturando ovalbumina (OVA, 50 mg/mL) e toxina pertussis (100 μg/mL) em solução salina e o hidróxido de alumínio adjuvante (40 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.
CUIDADO: Realizar a abertura, reconstituição e preparação de imunógenos da toxina pertussis em um gabinete de segurança laminar. Use roupas de proteção e evite qualquer contato com a pele. - Incubar a mistura de imunógenos e adjuvantes à temperatura ambiente durante 30 min e carregar 100 μL numa seringa de 1 ml.
- Realizar injeção intraperitoneal da solução de imunógeno em um camundongo não anestesiado.
- Segure o mouse suavemente pela cauda enquanto agarra a grade da gaiola. Segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o dedo indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o anel e o dedo mínimo contra a palma da mão.
- Mantenha o mouse fixo com a cabeça para baixo.
- Injete 100 μL da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior.
- Preparar o imunógeno recentemente no dia da imunização, misturando ovalbumina (OVA, 50 mg/mL) e toxina pertussis (100 μg/mL) em solução salina e o hidróxido de alumínio adjuvante (40 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.
- Realizar desafio da superfície ocular 2 semanas após a imunização.
- Anestesiar o rato com isoflurano (2,5%).
- Aplique 5 μL de OVA (50 mg/mL) ou solução salina (0,9% de NaCl) por olho em ambos os olhos e aguarde até que a gota seja absorvida pelo olho. Isso leva ~ 5 min.
- Repita o procedimento 1x ao dia por 7 dias.
NOTA: A administração tópica de medicamentos pode ser feita da mesma maneira.
2. Coleta de exsudados oculares
- Recupere os exsudatos oculares formados durante a fase de desafio, aplicando 50 μL de solução salina estéril ao olho imediatamente após o desafio.
- Para obter uma suspensão unicelular, trate a descarga ocular coletada com MNase recombinante (2 x 106 gel U/mL, ver Tabela de Materiais) contendo o cofator cálcio (5 mM) a 37 °C por 20 min.
- Centrífuga a 400 x g durante 7 min à temperatura ambiente.
- Isole o sobrenadante e meça as citocinas e quimiocinas usando ELISA multiplexado de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O sobrenadante obtido pode ser usado para análise de proteínas e o pellet para ensaios funcionais, como imunofenotipagem, fagocitose, degranulação e expressão gênica.
3. Excisão dos tecidos da superfície ocular
- Disseque as pálpebras e o globo ocular seguindo os passos abaixo.
- Eutanasiar o rato por asfixia por CO2 e luxação cervical.
- Coloque o mouse em uma superfície uniforme.
- Desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete impregnado com etanol a 70%.
- Faça uma incisão entre a orelha e o seio retroorbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Isso forma uma incisão ao redor do olho (Figura 1).
- Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.
- Coloque os órgãos excisados em PBS estéril.
- Apare o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas usando um bisturi e sob o estereomicroscópio.
- Recolha a conjuntiva seguindo os passos abaixo.
- Coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca sob o estereomicroscópio.
- Usando pinças finas e um bisturi, descasque a camada mucosa esbranquiçada muito suavemente para fora da superfície interna da pálpebra.
- Em seguida, disseque a córnea seguindo os passos abaixo.
- Coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima do gelo seco por 3 minutos.
- Leve a placa de Petri para a superfície do banco em uma posição estável.
- Faça uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo usando uma tesoura fina e afiada.
- Prolongue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea.
- Remova os restos da íris e da lente da parte de trás da córnea lavando generosamente com solução salina.
4. Documentação da obstrução da glândula de Meibomian (MG)
- Para avaliar o MG e seus orifícios, colocar as pálpebras excisadas em posição vertical sob o estereomicroscópio (Figura 2).
- Capture imagens com epiiluminação de luz branca de acordo com o tempo de exposição da câmera e as configurações ISO.
NOTA: A análise morfométrica dessas imagens fornece quantificação confiável do tamanho do plugue na saída das glândulas. A quantificação pode ser realizada delineando com a ferramenta varinha os plugues oculares e executando o comando "Analisar partículas" do software Image J (ver Tabela de Materiais).
5. Transiluminação das pálpebras (morfologia da glândula de Meibom)
- Para avaliar a área de MG, coloque as pálpebras excisadas na posição horizontal e acenda a luz de fundo do estereomicroscópio equipado com uma câmera infravermelha (Figura 3).
- Capture imagens ajustando o tempo de exposição de acordo com a ISO da câmera (consulte Tabela de Materiais).
NOTA: A imagem infravermelha dessas pálpebras transiluminadas sob o estereomicroscópio pode ajudar a medir a forma e o tamanho de cada ácino. A análise morfométrica dessas imagens fornece quantificação confiável do tamanho e do número de MG. A quantificação pode ser realizada delineando o MG com a ferramenta varinha e executando o comando "Analisar Partículas" do software Image J.
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Representative Results
O presente protocolo descreve as etapas sequenciais para o estabelecimento de um modelo murino de inflamação da superfície ocular. Os protocolos visam mostrar como aplicar terapêutica localmente, obter exsudatos oculares e órgãos acessórios associados ao consumo como pálpebras saudáveis e inflamadas (Figura 2), córnea e conjuntiva. Deve-se ter atenção quando as pálpebras superiores são dissecadas para o isolamento da conjuntiva, e deve ser armazenada em 1x PBS durante a dissecção da córnea. Isso evitará a secagem da conjuntiva, que pode ser usada para estudos histológicos, farmacocinéticos e de expressão gênica.
OVA e soro fisiológico foram aplicados topicamente por 7 dias consecutivos seguindo o protocolo supracitado. Ratos desafiados topicamente com solução salina mostraram uma superfície ocular saudável com olhos bem abertos e um padrão regular de piscar. No entanto, a inflamação ocular foi instigada em camundongos C57BL/6J imunizados desafiados com OVA. A instilação da solução de OVA na superfície ocular causou coceira, e não dor, nas primeiras 2 horas após a instilação. Exsudato e eczema palpebral foram observados apenas durante os últimos 3 dias da fase de desafio. Nenhuma dor era evidente, julgando o comportamento dos animais. Portanto, um nível moderado de estresse para os camundongos durante um curto período de tempo foi assumido. O desafio diário de OVA desencadeou manifestações clínicas como secreção ocular abundante, quemose e abertura estreita dos olhos. Além disso, as pálpebras superior e inferior frequentemente aderiram umas às outras, prejudicando a função essencial de piscar (Figura 2). Critérios rigorosos de interrupção (Arquivo Suplementar) foram seguidos para este modelo e foram aprovados pelo conselho de ética local para experimentação animal. A interrupção imediata foi realizada se um rato atingisse 15 pontos a qualquer momento.
Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
Após a eutanásia, os órgãos oculares foram excisados e observados em maior ampliação. As pálpebras excisadas ao microscópio apresentavam grandes oclusões obstruindo os orifícios da MG e edema, em forte contraste com as pálpebras saudáveis, mostrando pequenos tampões da glândula que reveste a pálpebra (Figura 3).
Um exame mais aprofundado da transiluminação infravermelha da glândula revela a aparência racêmica dos ácinos da MG. Isso permite quantificar as glândulas Meibomianas visíveis (indicadas em vermelho). As pálpebras de camundongos com solução salina mostraram os ácinos redondos formando o MG. Em comparação, a aplicação de OVA induziu a destruição e perda de algum MG em camundongos com doença alérgica ocular (DEA, Figura 4). A análise histológica das pálpebras mostrou MG dilatada em comparação com camundongos ingênuos administrados com apenas soro fisiológico por 7 dias (Figura 5), permitindo o acúmulo de neutrófilos produzindo aggNETs que finalmente obstruem os orifícios da glândula.
Separar a córnea da esclera do olho pode ser complicado devido à superfície mucosa escorregadia do globo ocular. Incubar o globo ocular em gelo seco em uma placa de Petri por 3 min permite fixar o olho, fazer uma pequena incisão no limbo e dissecar a córnea (Figura 6).
As etapas alistadas na seção do protocolo facilitaram a coleta da córnea e da conjuntiva. Além disso, a administração local de OVA infligiu inflamação grave à conjuntiva, com aspecto hiperêmico (Figura 7).
A análise dos exsudados oculares revela mecanismos moleculares no desenvolvimento da MGD. A quantificação de citocinas e quimiocinas, conforme descrita, mostrou níveis elevados da quimiocina maior, facilitando o extravasamento de neutrófilos, fagocitose e degranulação (CXCL-1) nos sobrenadantes de camundongos com DEA8. Além disso, o principal mediador da resposta de fase aguda e da produção de neutrófilos, a IL-6, também foi significativamente elevado em camundongos com DEA. Por outro lado, a concentração de IL-10, uma citocina anti-inflamatória, não mostrou alterações significativas em camundongos ingênuos e com DEA (Figura 8).
Figura 1: Excisão do tecido facial ao redor da região orbitária. A trilha de incisão é indicada em vermelho. Isso permite extirpar os órgãos oculares e investigar a influência e os efeitos de várias terapias administradas topicamente em órgãos oculares acessórios, como a conjuntiva e a córnea. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A administração de OVA causa manifestações clínicas de MGD . (A) Os ratos que receberam solução salina mostram uma superfície ocular saudável com os olhos bem abertos. (B) A aplicação de OVA induz inflamação grave da superfície ocular, a abertura estreita dos olhos e sinais de quemose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tamponamentos ductais obstruindo as glândulas meibomianas (MG) localizadas ao longo das pálpebras. (A) Macrofotografia representativa de uma pálpebra saudável sem descarga ocular excessiva de um rato administrado soro fisiológico durante apenas 7 dias. (B) Pálpebra apresentando grandes oclusões ductais do MG e edema após o período de desafio. Barra de escala = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A macrofotografia transiluminante permite a visualização dos ácinos (linhas vermelhas) do MG. (A) Melhorar os níveis infravermelhos visualiza os ácinos saudáveis de ratos ingênuos e revela os distintos ácinos em forma de bolso nas pálpebras saudáveis. (B) Os ácinos aparecem espessos nas pálpebras afetadas dos camundongos com a aplicação de OVA. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A análise histológica das pálpebras mostra ductos dilatados de MG em camundongos com insulto repetido de OVA por 7 dias. (A) Pálpebras de camundongos ingênuos mostram a ausência de quaisquer ductos dilatados, representando um órgão ocular funcional saudável (B) em contraste com camundongos com desafio OVA. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Incisão na córnea junto ao limbo e separação da córnea da esclera. Imagem do globo ocular mostrando o ponto de incisão (indicado pela seta branca). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Administração local de OVA . (A) Macrofotografias de órgãos oculares murinos mostrando a córnea. Barra de escala: 600 μm. (B) Conjuntiva inflamada de camundongos desafiados com OVA. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Mensuração dos marcadores inflamatórios nos exsudatos oculares coletados. Análise quantitativa de citocinas e quimiocinas no sobrenadante de exsudato ocular centrifugado de camundongos ingênuos (n = 7) e camundongos com MGD (n = 8). Os dados são expressos como mediana com uma faixa de 5% a 95%. A significância estatística foi calculada pelo teste U bicaudal de Mann-Whitney. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A secreção oleosa das glândulas meibomianas é de grande importância para um olho saudável22. No entanto, a obstrução dessas glândulas sebáceas por armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) que se alinham como filamentos paralelos localizados nas placas tarsais de ambas as pálpebras pode interromper o filme lacrimal23. Essa ruptura resulta em disfunção da glândula de Meibomian (MGD)1 e evaporação acelerada da lágrima e condiciona o dano da superfície ocular2. Este protocolo descreve o estabelecimento de inflamação da superfície ocular imunomediada que leva à obstrução da MG.
Estudos de modelos de camundongos confirmaram os mecanismos imunomediados subjacentes que causam obstrução da MG associada à inflamação da superfície ocular. Uma resposta robusta de TH17 recrutando neutrófilos no modelo de camundongo de DEA e um aumento de neutrófilos e outras células mieloides no fluido lacrimal de pacientes com MGD indicam o papel dos neutrófilos obstruindo a MG21. A presença de aggNETs ocluindo os orifícios de MG foi confirmada com peptidil arginina deiminase 4 em camundongos com DEA. Nesse modelo, os neutrófilos apresentaram diminuição da capacidade de agregação e formaram aggNETs que obstruíram os ductos e orifícios das glândulas MG10. Além disso, a análise lacrimal de pacientes com MGD mostrou um aumento na anafilatoxina C5a e quimiocina IL-8, demonstrando aumento da atividade do sistema complemento e um alto influxo de infiltração de neutrófilos. Finalmente, um aumento no nível de citocinas associadas a várias funções neutrófilas, como IL-6, IL-18, MCP-1/CCL-2 e MIG/CXCL9, ressalta a posição privilegiada dos neutrófilos na patogênese da MGD11.
A ocorrência de MGD é um contribuinte significativo para o desenvolvimento de DED, e examinar o papel dos numerosos elementos envolvidos na patogênese das manifestações oculares é complicado24. Portanto, a seleção de animais como modelos é fortemente influenciada pela questão investigada. Por exemplo, os coelhos servem como modelos convencionais para testes farmacêuticos de formulações; modelos felinos, suínos e caninos são adequados para investigar características patológicas semelhantes a pacientes humanos, e camundongos são adequados principalmente para manipulação genética25.
Os modelos animais são ferramentas valiosas para investigar a patogênese da doença e examinar a eficácia terapêutica de várias intervenções in vivo. Por exemplo, os tratamentos convencionais incluem a administração de instilações de colírio para tratar manifestações oculares clínicas; no entanto, devido ao fluxo lacrimal e ao sistema de drenagem lacrimal, tais intervenções oculares são rapidamente removidas da superfície ocular. Isso causa apenas ação temporária e requer administrações repetidas e altas doses. Para resolver esse problema, o modelo coelho de doença do olho seco (DED) serviu como o meio ideal para examinar termogéis e nanogéis carbonizados (GNCs) como tratamentos tópicos alternativos. Os termogéis obtidos pela conjugação de diferentes graus de sulfatação do ácido hialurônico e um poli terminado com amina (N-isopropil acrilamida), quando administrados ao olho, se transformam em um gel. No modelo coelho de DED, esse gel foi retido por mais tempo, e uma única gota reparou o epitélio corneano danificado, interrompeu a apoptose e reprimiu a inflamação ocular durante um seguimento de 7 dias, sugerindo uma interrupção na infiltração leucocitária devido à inibição da interação leucocitária mediada pela selectina26.
Além disso, no modelo coelho de DED, nanogéis carbonizados (GNC) como colírio mostraram eliminação de radicais livres tratando deficiência lacrimal e evaporação excessiva de lágrimas causada por uma resposta inflamatória exacerbada e estresse oxidativo. Os GNCs foram obtidos através da pirólise do cloridrato de lisina (Lys-CNGs) e administrados, e uma dose única atenuou os sintomas de DED em 4 dias. Um efeito terapêutico semelhante só foi possível com vários tratamentos de uma quantidade 10 vezes maior de instilações de colírio de ciclosporina A. Essas novas intervenções farmacêuticas biocompatíveis exibiram perspectivas superiores como intervenções de dose única e retenção ocular mais prolongada em modelos animais pré-clínicos27.
O knockout de vários genes em modelos de ratos revelou o papel de múltiplas proteínas envolvidas na patogênese da MGD. Por exemplo, a expressão gênica desregulada do receptor-gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR γ)24 e alterações em sua via de sinalização induzem alterações na entrada/proliferação do ciclo celular, síntese lipídica e atrofia da glândula meibomiana durante o envelhecimento13. Além disso, a ausência do βENaC (β - canal epitelial de sódio) em um modelo de camundongo indicou que o fenótipo de disfunção de MG prevalente em mulheres estava associado à atrofia e obstrução do orifício de MG como em humanos com pseudo-hipoaldosteronismo 1(PHA)28. O papel essencial do CD147 também foi elucidado em camundongos, acreditando-se que ele mantenha o rico conteúdo lipídico dos meibócitos29. Camundongos deficientes para a enzima superóxido dismutase 1 mostraram lipídios oxidativos elevados e danos ao DNA, o que foi associado a um aumento na inflamação MG30. Finalmente, uma única mutação no ELOVL4 que codifica a enzima necessária para sintetizar resíduos de ácidos graxos de cadeia extremamente longa formando o lipidoma meibum leva a alterações funcionais na superfície ocular anterior31. Curiosamente, a MGD também foi induzida em camundongos com dieta especial com composição lipídica incompleta para avaliar a eficácia terapêutica da azitromicina como formulação oftálmica32.
Embora a maioria dos estudos que empregam modelos de camundongos tenha identificado vários genes envolvidos na MGD, muitos não possuem uma condição imunológica subjacente. O modelo de DEA fornece toda uma gama de possíveis intervenções, desde a indução da resposta imune, a geração de anticorpos IgE e a fase efetora, acompanhada por várias alterações patológicas semelhantes à MGD evaporativa humana.
Ao investigar a MGD utilizando o protocolo mencionado, é crucial adicionar imunógeno (OVA e toxina pertussis) ao alúmen em uma proporção de 1:1. Deve-se incubar a mistura por 30 min à temperatura ambiente para uma boa adsorção da toxina ovalbumina-coqueluche para o alúlum. Essas interações são vitais para desencadear uma resposta imune adequada. Além disso, durante a imunização, deve-se prestar atenção durante a injeção, pois isso pode resultar em perfuração dos órgãos subjacentes da cavidade peritoneal. Isso pode resultar em imunização inadequada e inflamação sistêmica no camundongo, com efeitos profundos na resposta imune.
Os exsudatos oculares são grandes estruturas extracelulares de cromatina semelhantes a teias que se infiltram nas células do sistema imunológico. Portanto, o tratamento com MNase dos exsudatos oculares coletados a partir desse modelo é vital para a obtenção de suspensões unicelulares11. Além disso, esses exsudatos são fáceis de coletar na superfície ocular e são uma fonte de neutrófilos viáveis que transmigraram da circulação. A principal limitação desta técnica é a quantidade de exsudato a ser coletado das superfícies oculares. A adição de 50 μL de solução salina a cada olho permite a recuperação de até 100 μL de exsudato de um rato. Isso é pouco suficiente para colorações de citometria de fluxo 1-2 (FACS) e sobrenadantes para estudos bioquímicos.
Dissecar com um bisturi para mais tarde arrancar o olho e os tecidos circundantes pode muitas vezes causar lesões na veia temporal superficial, veia palpebral inferior ou veia do ângulo ocular. É aconselhável criar uma incisão na pele com menos profundidade ao redor do olho, pois o sangramento pode interferir com outras preparações histológicas. Durante a dissecção de um tecido, o armazenamento de outros tecidos em PBS é essencial, pois a secagem ou a lubrificação insuficiente podem resultar em perda de características estruturais.
Durante a dissecção da córnea do globo ocular, se a incubação do globo ocular no gelo seco não permitir um controle constante, pode-se estender o tempo para até 5 minutos para que a incisão no limbo e a separação da córnea sejam possíveis.
Aplicações potenciais
A inflamação da superfície ocular associada à MGD é uma doença multifatorial. O desenvolvimento e a progressão da disfunção nessas glândulas secretoras de lipídios podem ser causados por fatores oftálmicos, sistêmicos, hormonais e genéticos, produtos químicos, drogas, agentes nocivos mecânicos e respostas imunológicas33. Vários estudos têm relatado neutrófilos causando oclusão das glândulas meibomianas e inflamação 11,21,34,35,36,37,38. O desenvolvimento de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas que interferem nessas vias imunológicas pode oferecer alívio aos pacientes que sofrem de desconforto ocular devido à MGD. O modelo murino de doença alérgica ocular pode ser utilizado em um ambiente pré-clínico para investigar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas desses agentes. Este modelo de doença permite o desenvolvimento de estratégias apropriadas para combater a MGD e ajuda a determinar a administração adequada de agentes anti-inflamatórios tópicos ou sistêmicos que visam componentes vitais nas vias causadoras da doença.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), Projeto H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, e pela Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) à MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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