Summary
Oküler yüzey iltihabı oküler yüzey dokularına zarar verir ve gözün hayati fonksiyonlarını tehlikeye atar. Mevcut protokol, oküler inflamasyonu indüklemek ve Meibomian bezi disfonksiyonunun (MGD) bir fare modelinde tehlikeye atılmış dokuları toplamak için bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Oküler yüzey hastalıkları, kornea, konjonktiva ve ilişkili oküler yüzey bezi ağının fonksiyonlarını ve yapılarını bozan bir dizi bozukluğu içerir. Meibomian bezleri (MG), gözyaşı filminin sulu kısmının buharlaşmasını önleyen bir kaplama tabakası oluşturan lipitleri salgılar. Nötrofiller ve hücre dışı DNA tuzakları, alerjik göz hastalığının bir fare modelinde MG ve oküler yüzeyi doldurur. Agrega nötrofil hücre dışı tuzakları (aggNET'ler), MG çıkışlarını tıkayan ve MG disfonksiyonunu koşullandıran hücre dışı kromatinden oluşan ağ benzeri bir matris formüle eder. Burada oküler yüzey inflamasyonunu ve MG disfonksiyonunu indüklemek için bir yöntem sunulmuştur. Kornea, konjonktiva ve göz kapakları gibi oküler yüzeyle ilgili organların toplanmasına yönelik prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Her organın işlenmesi için belirlenmiş teknikler kullanılarak, MG disfonksiyonunun başlıca morfolojik ve histopatolojik özellikleri de gösterilmiştir. Oküler eksüdalar, oküler yüzeyin enflamatuar durumunu değerlendirme fırsatı sunar. Bu prosedürler topikal ve sistemik antiinflamatuar girişimlerin preklinik düzeyde araştırılmasını sağlar.
Introduction
Bir gözün her yanıp sönmesi, korneanın üzerine dağılmış pürüzsüz gözyaşı filmini doldurur. Oküler yüzey epitelyası, gözyaşı filminin oküler yüzeydeki dağılımını ve doğru yönlendirilmesini kolaylaştırır. Müsinler, göz yüzeyindeki lakrimal bezlerden gelen gözyaşı filminin sulu kısmının konumlandırılmasına yardımcı olmak için kornea ve konjonktiva epitel hücreleri tarafından sağlanır. Son olarak, MG, gözyaşı filmi 1,2,3'ün sulu kısmının buharlaşmasını önleyen bir kaplama tabakası oluşturan lipitleri salgılar. Bu şekilde, tüm oküler organların koordineli fonksiyonları, oküler yüzeyi istilacı patojenlerden veya yaralanmalardan korur ve herhangi bir ağrı veya rahatsızlık olmadan kristal berraklığında görmeyi destekler.
Sağlıklı bir oküler yüzeyde, oküler akan akıntı veya göz romatı tozu, ölü epitel hücrelerini, bakterileri, mukusları ve bağışıklık hücrelerini süpürür. Agrega nötrofil hücre dışı tuzakları (aggNET'ler), hücre dışı kromatinden oluşan ağ benzeri bir matris formüle eder ve bu bileşenleri göz romatizmine dahil eder. AggNET'ler, pro-inflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin proteolitik yıkımı ile inflamasyonu çözer4. Bununla birlikte, işlevsiz hale geldiklerinde, bu anormal aggNET'ler COVID-195'te vasküler tıkanıklıklar, safra kesesi taşları6 ve sialolitiyazis7 gibi hastalıkların patogenezini yönlendirir. Benzer şekilde, oküler yüzeydeki aggNET'ler koruyucu bir rol oynar ve yüksek oranda maruz kalan yüzey8'in iltihaplanmasının çözülmesine katkıda bulunur. Oküler yüzeyde abartılı bir oluşum veya aggNET eksikliği gözyaşı filmi stabilitesini bozabilir ve/veya kornea yaralarına, sikatrize edici konjonktivite ve kuru göz hastalığına neden olabilir. Örneğin, MG'nin tıkanması, kuru göz hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir9. AggNET'lerin ayrıca MG kanallarından lipit sekresyon akışını tıkadığı ve Meibomian bezi disfonksiyonuna (MGD) neden olduğu bilinmektedir. MG deliklerinin aggNET'ler tarafından tıkanıklığı, oküler yüzeyi saran yağlı sıvı eksikliğine ve retrograd şişelenmiş sıvıya neden olarak bez fonksiyonunun işlev bozukluğuna ve asinar hasara neden olur. Bu işlev bozukluğu gözyaşı filmi buharlaşmasına, göz kapaklarındaki kenar boşluklarının fibrozisine, göz iltihabına ve MG10,11'de zararlı hasara neden olabilir.
İnsanlarda MGD'nin patolojik sürecini taklit etmek için yıllar içinde çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, 1 yaşındaki C57BL / 6 fareleri, 50 yaş ve üstü12,13,14 yaş ve üstü hastalarda oküler hastalık patolojisini yansıtan kuru göz hastalığı (DED) ve MGD üzerindeki yaşa bağlı etkilerin incelenmesine yardımcı olmuştur. Ayrıca, tavşanlar farmakolojik müdahalelerin etkilerini araştırmak için uygun modellerdir. Bu nedenle, tavşanlarda MGD'nin indüklenmesi, epinefrin topikal uygulaması veya 13-cis-retinoik asidin (izotretinoin) sistemik olarak sokulması ile bildirilmiştir 15,16,17,18,19.
Bu hayvan modelleri, MGD'nin patofizyolojisine katkıda bulunan farklı faktörleri belirlemek için yeterli olmasına rağmen, kullanımları kısıtlanmıştır. Örneğin, yaşa bağlı MGD'nin murin modeli, yalnızca yaşlı yetişkinlerde elementleri deşifre etmek için idealdi ve bu nedenle, tavşanlar, çoklu patofizyolojik mekanizmaların araştırılmasını sağladıkları için oküler yüzey hastalıklarını incelemek için en uygun hayvan modeli olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, oküler yüzeydeki proteinleri tespit etmek için kapsamlı analitik araçların bulunmaması ve tavşan genomunun birçok bölümünün açıklamasız olması nedeniyle,araştırmalar için sınırlıdır 20,21.
Ek olarak, kuru göz hastalığının patogenezini araştırmak için kullanılan bu hayvan modelleri, oküler yüzeyin iltihaplanmasını tetikleyen bozukluğun immünolojik kolunu analiz etmek için yeterli ayrıntı sağlamamıştır. Buna göre, Reyes ve ark. tarafından geliştirilen MGD'nin murin modeli, farelerde alerjik göz hastalığı ile insanlarda MGD arasında bir ilişki olduğunu göstermiş ve obstrüktif MGD21'den sorumlu immün etiyolojiyi vurgulamıştır. Bu model, alerjik göz hastalığını, konjonktiva ve göz kapağına nötrofilleri işe alan, MGD ve kronik oküler inflamasyona neden olan TH17 yanıtı ile ilişkilendirir21. Bu murin modelinde MGD ve oküler inflamasyonun indüksiyonu, devam eden bir bağışıklık tepkisi 21 tarafından yönlendirilen lokal inflamasyonun gelişimi sırasında yukarı akış olaylarını araştırmak için değerli bir araçtır21. Mevcut protokol, obstrüktif MGD'nin eşlik ettiği oküler yüzey inflamasyonunu tanımlamaktadır. Bu yöntemde, fareler bağışıklanır ve 2 hafta sonra, 7 gün boyunca immünojen ile oküler yüzeyde meydan okunur. Ayrıca, akut inflamasyon sırasında oküler eksüda ve ilişkili oküler organları izole etme adımları ve kornea, konjonktiva ve göz kapaklarının diseksiyonu anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm prosedürler, hayvan refahı ile ilgili kurumsal kılavuzlara göre yürütülmüş ve Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) hayvan refahı komisyonu tarafından onaylanmıştır (izin numarası: 55.2.2-2532-2-1217). Bu çalışmada 7-9 haftalık dişi C57Bl/6 fareler kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve 12 saat gündüz / gece döngüleri ile spesifik patojensiz koşullarda tutuldu.
1. Murin oküler yüzey inflamasyonunun indüksiyonu
- Bağışıklama için immünojen preparatı gerçekleştirin.
- İmmünojeni, aşılama gününde taze olarak hazırlayın, ovalbümin (OVA, 50 mg / mL) ve boğmaca toksini (100 μg / mL) tuzlu suda ve adjuvan alüminyum hidroksit (40 mg / mL) (bakınız Malzeme Tablosu) 1: 1 oranında karıştırın.
DİKKAT: Boğmaca toksininin açılmasını, sulandırılmasını ve immünojen preparatını laminer bir güvenlik kabininde gerçekleştirin. Koruyucu giysiler giyin ve ciltle herhangi bir temastan kaçının. - İmmünojen ve adjuvan karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve 100 μL'yi 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
- İmmünojen çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonunu anestezi yapılmamış bir farede gerçekleştirin.
- Kafes ızgarasını kavrarken fareyi kuyruğundan yumuşak bir şekilde tutun. Sırtın derisini ve boyun bölgesini başparmak ve işaret parmağı arasında sıkıca tutun ve yüzük ile küçük parmak arasındaki kuyruğu ve alt ekstremiteleri elin avucuna sabitleyin.
- Sabit fareyi başı aşağı bakacak şekilde tutun.
- Hazırlanan immünojen çözeltisinin 100 μL'sini alt karın boşluğunun sağ veya sol çeyreğine enjekte edin.
- İmmünojeni, aşılama gününde taze olarak hazırlayın, ovalbümin (OVA, 50 mg / mL) ve boğmaca toksini (100 μg / mL) tuzlu suda ve adjuvan alüminyum hidroksit (40 mg / mL) (bakınız Malzeme Tablosu) 1: 1 oranında karıştırın.
- Bağışıklamadan 2 hafta sonra oküler yüzey meydan okuması yapın.
- Fareyi izofluran ile uyuşturun (% 2.5).
- Her iki göze de göz başına 5 μL OVA (50 mg / mL) veya salin (% 0.9 NaCl) uygulayın ve damla göz tarafından emilene kadar bekleyin. Bu işlem ~ 5 dakika sürer.
- Prosedürü 7 gün boyunca günde 1 kez tekrarlayın.
NOT: İlaçların topikal uygulaması aynı şekilde yapılabilir.
2. Oküler eksüdaların toplanması
- Meydan okumadan hemen sonra göze 50 μL steril salin uygulayarak meydan okuma aşamasında oluşan oküler eksüdaları geri kazanın.
- Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için, toplanan oküler deşarjı 20 dakika boyunca 37 ° C'de kofaktör kalsiyum (5 mM) içeren rekombinant MNaz (2 x 106 jel U / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
- Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı izole edin ve üreticinin talimatlarına göre çoklanmış ELISA kullanarak sitokinleri ve kemokinleri ölçün (bkz.
NOT: Elde edilen süpernatant protein analizi için ve pelet immünofenotipleme, fagositoz, degranülasyon ve gen ekspresyonu gibi fonksiyonel testler için kullanılabilir.
3. Oküler yüzey dokularının eksizyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek göz kapaklarını ve göz küresini disseke edin.
- Fareyi CO2 boğulması ve servikal çıkık ile ötenazileştirin.
- Fareyi düz bir yüzeye yerleştirin.
- Göz çevresindeki orbital alanı% 70 etanol ile emprenye edilmiş bir çubukla dezenfekte edin.
- Kulak ile retro-orbital sinüs arasında ve skuamöz kemiğin üzerindeki yüzey boyunca dikey olarak bir kesi yapın, insizyonu maksiller kemik boyunca alt göz kapağının altına yatay olarak ve frontal kemik boyunca üst göz kapağının üzerine uzatın. Bu, göz çevresinde bir kesi oluşturur (Şekil 1).
- Kavisli forseps kullanarak disseke edilmiş dokuyu gözün etrafında dikkatlice tutun ve dokuyu ve göz küresini dışarı çekin.
- Eksize edilen organları steril PBS'ye yerleştirin.
- Eksize edilmiş üst göz kapaklarının etrafındaki fazla yüz kası dokusunu bir neşter kullanarak ve stereomikroskop altında kesin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek konjonktivayı toplayın.
- Üst göz kapağını stereomikroskop altında kuru bir Petri kabına yerleştirin.
- İnce cımbız ve neşter kullanarak, beyazımsı mukoza tabakasını göz kapağının iç yüzeyinden çok nazikçe soyun.
- Ardından, aşağıdaki adımları izleyerek korneayı disseke edin.
- Göz küresini 3 dakika boyunca kuru buzun üzerine yeni bir kuru Petri kabına yerleştirin.
- Petri kabını tezgah yüzeyine sabit bir konumda alın.
- İnce keskin makas kullanarak limbusun yanındaki kornea sınırında küçük bir kesi yapın.
- Göz küresinin etrafındaki neşterle insizyonu uzatarak sklerayı korneadan ayırın.
- İris ve lens kalıntılarını korneanın arka tarafından tuzlu su çözeltisi ile cömertçe yıkayarak çıkarın.
4. Meibomian bezi (MG) tıkanıklığının belgelenmesi
- MG ve deliklerini değerlendirmek için, eksize edilmiş göz kapaklarını stereomikroskop altında dik bir pozisyona yerleştirin (Şekil 2).
- Kameranın pozlama süresine ve ISO ayarlarına göre beyaz ışıklı epi-aydınlatmalı görüntüler yakalayın.
NOT: Bu görüntülerin morfometrik analizi, bezlerin çıkışındaki fiş boyutunun güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. Niceleme, değnek aleti ile göz tıkaçlarının ana hatlarını çizerek ve Image J yazılımının "Parçacıkları Analiz Et" komutunu çalıştırarak gerçekleştirilebilir (bkz.
5. Göz kapaklarının transilluminatasyonu (Meibomian bezi morfolojisi)
- MG alanını değerlendirmek için, eksize edilen göz kapaklarını yatay bir konuma yerleştirin ve kızılötesi kamera ile donatılmış stereomikroskopun arka ışığını açın (Şekil 3).
- Pozlama süresini fotoğraf makinesinin ISO'suna göre ayarlayarak görüntüler yakalayın (bkz.
NOT: Bu transilluminated göz kapaklarının stereomikroskop altında kızılötesi görüntülenmesi, her bir acini'nin şeklini ve boyutunu ölçmeye yardımcı olabilir. Bu görüntülerin morfometrik analizi, MG'nin boyutunun ve sayısının güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. Niceleme, MG'yi değnek aracıyla özetleyerek ve Image J yazılımının "Parçacıkları Analiz Et" komutunu çalıştırarak gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, oküler yüzey inflamasyonunun murin modelini oluşturmak için sıralı adımları açıklamaktadır. Protokoller, terapötiklerin lokal olarak nasıl uygulanacağını, oküler eksüdaların nasıl elde edileceğini ve sağlıklı ve iltihaplı göz kapakları (Şekil 2), kornea ve konjonktiva gibi ilişkili aksesuar organların nasıl çıkarılacağını göstermeyi amaçlamaktadır. Konjonktivanın izolasyonu için üst göz kapakları diseke edildiğinde dikkat edilmeli ve korneanın diseksiyonu sırasında 1x PBS'de saklanmalıdır. Bu, histolojik, farmakokinetik ve gen ekspresyon çalışmaları için kullanılabilecek konjonktivanın kurumasını önleyecektir.
OVA ve salin, yukarıda belirtilen protokolü takip eden 7 gün boyunca topikal olarak uygulandı. Topikal olarak salin ile meydan okuyan fareler, geniş açık gözlere ve düzenli bir yanıp sönme paterni ile sağlıklı bir oküler yüzey gösterdi. Bununla birlikte, OVA ile mücadele eden immünize C57BL / 6J farelerde oküler inflamasyon tetiklendi. OVA çözeltisinin oküler yüzeye damlatılması, damlatma işleminden sonraki ilk 2 saat boyunca ağrıya değil, kaşıntıya neden oldu. Eksüda ve göz kapağı egzaması sadece challenge aşamasının son 3 günü boyunca gözlendi. Hayvanların davranışlarını yargılayan hiçbir acı belirgin değildi. Bu nedenle, kısa bir süre boyunca fareler için ılımlı bir stres seviyesi olduğu varsayılmaktadır. Günlük OVA mücadelesi, bol miktarda oküler akıntı, kemoz ve gözlerin dar açılması gibi klinik bulguları tetikledi. Ek olarak, üst ve alt göz kapakları sıklıkla birbirine yapışarak yanıp sönmenin temel işlevini bozdu (Şekil 2). Bu model için katı kesinti kriterleri (Ek Dosya) izlendi ve hayvan deneyleri için yerel etik kurul tarafından onaylandı. Derhal kesinti, bir farenin herhangi bir zamanda 15 noktaya ulaşması durumunda gerçekleştirildi.
Ek Dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ötanaziden sonra, oküler organlar eksize edildi ve daha yüksek büyütmede gözlendi. Mikroskop altında eksize edilen göz kapakları, MG ve ödem deliklerini tıkayan büyük tıkanıklıklar gösterdi; bu, göz kapağını kaplayan bezin küçük tıkaçlarını gösteren sağlıklı göz kapaklarının tam tersi olarak (Şekil 3).
Bezin kızılötesi transilluminationunun daha fazla incelenmesi, MG'nin acini'sinin rasemik görünümünü ortaya koymaktadır. Bu, görünür Meibomian bezlerinin (kırmızı ile belirtilen) ölçülmesini sağlar. Salin meydan okuyan farelerin göz kapakları, MG'yi oluşturan yuvarlak akini gösterdi. Buna karşılık, OVA uygulaması, alerjik göz hastalığı olan farelerde bazı MG'lerin yıkımına ve kaybına neden olmuştur (AEİ, Şekil 4). Göz kapaklarının histolojik analizi, 7 gün boyunca sadece salin ile uygulanan naif farelere kıyasla genişlemiş MG gösterdi (Şekil 5), sonunda bezin deliklerini tıkayan aggNET üreten nötrofillerin birikmesine izin verdi.
Korneayı gözün sklerasından ayırmak, göz küresinin kaygan mukoza yüzeyi nedeniyle hantal olabilir. Göz küresinin bir Petri kabında kuru buz üzerinde 3 dakika boyunca inkübe edilmesi, gözün sabitlenmesine, limbusta küçük bir kesi yapılmasına ve korneanın diseksiyonuna izin verir (Şekil 6).
Protokol bölümünde yer alan adımlar, kornea ve konjonktivanın toplanmasını kolaylaştırdı. Ek olarak, OVA'nın lokal uygulaması, hiperemik bir görünümle konjonktivaya ciddi inflamasyon uyguladı (Şekil 7).
Oküler eksüdaların analizi, MGH gelişiminde moleküler mekanizmaları ortaya koymaktadır. Tarif edildiği gibi sitokin ve kemokin miktarı, AED8'li farelerden süpernatantlarda nötrofil ekstravazasyonunu, fagositozu ve degranülasyonu (CXCL-1) kolaylaştıran majör kemokinin yüksek seviyelerini göstermiştir. Ek olarak, akut faz yanıtının ve nötrofil üretiminin ana aracısı IL-6, AED'li farelerde de önemli ölçüde yükselmiştir. Öte yandan, bir anti-enflamatuar sitokin olan IL-10 konsantrasyonu, hem naif hem de AED farelerde önemli bir değişiklik göstermemiştir (Şekil 8).
Şekil 1: Orbital bölgeyi çevreleyen yüz dokusunun eksizyonu. Kesi izi kırmızı renkle gösterilir. Bu, oküler organların eksize edilmesine ve topikal olarak uygulanan çeşitli terapötiklerin konjonktiva ve kornea gibi aksesuar oküler organlar üzerindeki etkisinin ve etkilerinin araştırılmasına olanak tanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OVA uygulaması MGD'nin klinik bulgularına neden olur . (A) Salin uygulanan fareler, gözleri tamamen açık sağlıklı bir oküler yüzey gösterir. (B) OVA uygulaması ciddi oküler yüzey iltihabına, gözlerin dar açılmasına ve kemoz bulgularına neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Göz kapakları boyunca yer alan Meibomian bezlerini (MG) tıkayan duktal tıkaçlar. (A) Sadece 7 gün boyunca fare tarafından uygulanan salinden aşırı oküler akıntı olmadan sağlıklı bir göz kapağının temsili makro fotoğrafı. (B) Meydan okuma döneminden sonra MG'nin büyük duktal tıkanıklıklarını ve ödemi gösteren göz kapağı. Ölçek çubuğu = 300 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Transilluminating makro fotoğrafçılık, MG'nin acini'sinin (kırmızı çizgiler) görselleştirilmesini sağlar. (A) Kızılötesi seviyelerin arttırılması, naif farelerin sağlıklı acini'sini görselleştirir ve sağlıklı göz kapaklarındaki belirgin cep şeklindeki acini'yi ortaya çıkarır. (B) Acini, farelerin etkilenen göz kapaklarında OVA uygulaması ile kalın görünür. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Göz kapaklarının histolojik analizi, 7 gün boyunca tekrarlanan OVA hakareti olan farelerde MG'nin genişlemiş kanallarını göstermektedir. (A) Naif fare göz kapakları, OVA meydan okuması olan farelerin aksine, sağlıklı işleyen bir oküler organ (B) gösteren herhangi bir dilate kanalın bulunmadığını göstermektedir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Korneada limbusun yanında insizyon ve korneanın skleradan ayrılması. Kesi noktasını gösteren göz küresinin görüntüsü (beyaz okla gösterilir). Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: OVA'nın lokal uygulaması . (A) Korneayı gösteren murin oküler organlarının makro fotoğrafları. Ölçek çubuğu: 600 μm. (B) OVA ile mücadele eden farelerden iltihaplı konjonktiva. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Toplanan oküler eksüdalarda inflamatuar belirteçlerin ölçümü. Naif farelerin (n = 7) ve MGD'li farelerin (n = 8) santrifüjlü oküler eksüdasının süpernatantındaki sitokinlerin ve kemokinlerin kantitatif analizi. Veriler %5-%95 aralığında medyan olarak ifade edilir. İstatistiksel anlamlılık, iki kuyruklu Mann-Whitney U-testi kullanılarak hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meibomian bezlerinin yağlı salgılanması sağlıklı bir göz için büyük önem taşımaktadır22. Bununla birlikte, bu yağ bezlerinin, her iki göz kapağının tarsal plakalarında bulunan paralel iplikçikler olarak sıralanan toplanmış nötrofil hücre dışı tuzaklar (aggNET'ler) tarafından tıkanması, gözyaşı filmi23'ü bozabilir. Bu bozulma Meibomian bezi disfonksiyonu (MGD)1 ve hızlandırılmış gözyaşı buharlaşması ile sonuçlanır ve oküler yüzeyin hasarını şartlandırır2. Bu protokol, MG obstrüksiyonuna yol açan immün aracılı oküler yüzey inflamasyonunun oluşturulmasını tanımlar.
Fare modellerinden yapılan çalışmalar, oküler yüzey inflamasyonu ile ilişkili MG obstrüksiyonuna neden olan altta yatan immün aracılı mekanizmaları doğrulamıştır. AED'nin fare modelinde nötrofiller işe alan sağlam bir TH17 yanıtı ve MGD'li hastaların gözyaşı sıvısındaki nötrofillerde ve diğer miyeloid hücrelerde bir artış, MG21'i engelleyen nötrofillerin rolünü göstermektedir. MG deliklerini tıkayan aggNET'lerin varlığı, AED'li farelerde peptidil arginin deiminaz 4 ile doğrulandı. Bu modelde, nötrofiller agrega kapasitesinin azaldığını gösterdi ve MG bezlerinin kanallarını ve deliklerini tıkayan aggNET'ler oluşturdu10. Ayrıca, MGD'li hastalardan yapılan gözyaşı analizi, anafilatoksin C5a ve kemokin IL-8'de bir artış göstererek, kompleman sisteminin aktivitesinin arttığını ve yüksek miktarda nötrofil infiltrasyonu olduğunu göstermiştir. Son olarak, IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 ve MIG / CXCL9 gibi çeşitli nötrofil fonksiyonlarıyla ilişkili sitokinlerin seviyesindeki artış, MGD11'in patogenezinde nötrofillerin asal konumunu vurgulamaktadır.
MGD oluşumu DED gelişimine önemli bir katkıda bulunur ve oküler bulguların patogenezinde rol oynayan çok sayıda elementin rolünün incelenmesi karmaşıktır24. Bu nedenle, hayvanların model olarak seçilmesi, araştırılan sorudan büyük ölçüde etkilenmektedir. Örneğin, tavşanlar formülasyonların farmasötik testleri için geleneksel modeller olarak hizmet eder; kedi, domuz ve köpek modelleri, insan hastalarına benzer patolojik özellikleri araştırmak için uygundur ve fareler öncelikle genetik manipülasyon için uygundur25.
Hayvan modelleri, hastalık patogenezini araştırmak ve çeşitli girişimlerin in vivo terapötik etkinliğini incelemek için değerli araçlardır. Örneğin, geleneksel tedaviler arasında klinik oküler bulguları tedavi etmek için göz damlası damlatmalarının uygulanması; ancak gözyaşı akımı ve lakrimal drenaj sistemi nedeniyle bu tür oküler girişimler oküler yüzeyden hızla uzaklaştırılır. Bu sadece geçici eyleme neden olur ve tekrarlanan uygulamalar ve yüksek dozlar gerektirir. Bu sorunu çözmek için, kuru göz hastalığının tavşan modeli (DED), alternatif topikal tedaviler olarak termojelleri ve karbonize nanojelleri (CNG'ler) incelemek için ideal bir ortam olarak hizmet etti. Hyaluronik asidin farklı derecelerde sülfatlanması ve amin ile sonlandırılmış bir poli (N-izopropil akrilamid konjuge edilmesiyle elde edilen termojeller), göze uygulandığında bir jele dönüşür. DED'in tavşan modelinde, bu jel daha uzun süre tutuldu ve tek bir damla hasarlı kornea epitelini onardı, apoptozu durdurdu ve 7 günlük bir takip sırasında oküler inflamasyonu bastırdı, bu da selektin aracılı lökosit etkileşiminin inhibisyonu nedeniyle lökosit infiltrasyonunda bir kesinti olduğunu düşündürdü26.
Ayrıca, DED'in tavşan modelinde, göz damlası olarak karbonize nanojeller (CNG'ler), şiddetlenmiş bir enflamatuar yanıt ve oksidatif stresin neden olduğu gözyaşı eksikliğini ve aşırı gözyaşı buharlaşmasını tedavi eden serbest radikal süpürme gösterdi. CNG'ler, lizin hidroklorürün (Lys-CNG'ler) pirolizi yoluyla elde edildi ve uygulandı ve tek bir doz 4 gün içinde DED semptomlarını hafifletti. Benzer bir terapötik etki, ancak 10 kat daha yüksek miktarda siklosporin A göz damlası damlatmalarının çeşitli tedavileri ile elde edilebilirdi. Bu yeni biyouyumlu farmasötik girişimler, klinik öncesi hayvan modellerinde tek dozluk müdahaleler ve daha genişletilmiş oküler retansiyon olarak üstün bakış açıları sergilemiştir27.
Fare modellerinde çeşitli genlerin nakavt edilmesi, MGD'nin patogenezinde rol oynayan çoklu proteinlerin rolünü ortaya çıkarmıştır. Örneğin, peroksizom proliferatörle aktive edilmiş reseptör-gamanın (PPAR γ)24 düzensiz gen ekspresyonu ve sinyal yolundaki değişiklikler,13 yaşlılık sırasında hücre döngüsü girişi / proliferasyonu, lipit sentezi ve Meibomian bezi atrofisinde değişikliklere neden olur. Ek olarak, bir fare modelinde βENaC'nin (β - epitelyal sodyum kanalı) bulunmaması, kadınlarda yaygın olan MG disfonksiyon fenotipinin, psödohipoaldosteronizm 1 (PHA) 28'li insanlarda olduğu gibi MG atrofisi ve delik tıkanıklığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. CD147'nin temel rolü farelerde de açıklığa kavuşturulmuştur ve meibositlerin zengin lipit içeriğini koruduğuna inanılmaktadır29. Süperoksit dismutaz 1 enzimi için eksik olan fareler, MG inflamasyonundaki30'daki artışla bağlantılı olarak yüksek oksidatif lipit ve DNA hasarı gösterdi. Son olarak, ELOVL4'te meibum lipidomu oluşturan son derece uzun zincirli yağ asidi kalıntılarını sentezlemek için gerekli enzimi kodlayan tek bir mutasyon, ön oküler yüzeyde fonksiyonel değişikliklere yol açar31. İlginç bir şekilde, MGD, azitromisinin oftalmik bir formülasyon olarak terapötik etkinliğini değerlendirmek için tamamlanmamış lipit bileşimine sahip özel bir diyete sahip farelerde de indüklenmiştir32.
Fare modellerini kullanan çalışmaların çoğu, MGD'de yer alan birkaç geni tanımlamış olsa da, birçoğu altta yatan bir immünolojik durumdan yoksundur. AED modeli, immün yanıtın indüklenmesinden, IgE antikorlarının oluşumundan ve efektör fazından, insan buharlaştırıcı MGD'ye benzeyen çeşitli patolojik değişikliklerin eşlik ettiği bir dizi olası müdahale sağlar.
Bahsedilen protokolü kullanarak MGD'yi araştırırken, şaplara 1: 1 oranında immünojen (OVA ve boğmaca toksini) eklemek çok önemlidir. Ovalbumin-boğmaca toksininin şaplara iyi adsorpsiyonu için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek gerekir. Bu etkileşimler yeterli bir bağışıklık tepkisini tetiklemek için hayati öneme sahiptir. Ek olarak, bağışıklama sırasında, enjekte edilirken dikkat edilmelidir, çünkü bu, periton boşluğunun altta yatan organlarının delinmesine neden olabilir. Bu, farede yetersiz bağışıklama ve sistemik inflamasyona neden olabilir ve bağışıklık tepkisi üzerinde derin etkileri olabilir.
Oküler eksüdalar, bağışıklık hücrelerine sızan kafes oluşturan büyük ağ benzeri hücre dışı kromatin yapılarıdır. Bu nedenle, bu modelden toplanan oküler eksüdaların MNaz tedavisi, tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi için hayati öneme sahiptir11. Ek olarak, bu eksüdaların oküler yüzeyde toplanması kolaydır ve dolaşımdan göç eden canlı nötrofillerin kaynağıdır. Bu tekniğin temel sınırlaması oküler yüzeylerden toplanacak eksüda miktarıdır. Her göze 50 μL salin eklenmesi, bir fareden 100 μL'ye kadar eksüdanın geri kazanılmasını sağlar. Bu, biyokimyasal çalışmalar için 1-2 akış sitometrisi (FACS) boyaması ve süpernatanlar için zar zor yeterlidir.
Daha sonra gözü ve çevresindeki dokuları koparmak için bir neşter ile diseksiyon sıklıkla yüzeysel temporal ven, inferior palpebral ven veya oküler açılı vende yaralanmaya neden olabilir. Deride göz çevresinde daha az derinliğe sahip bir kesi oluşturulması tavsiye edilir, çünkü kanama daha ileri histolojik preparatlara müdahale edebilir. Bir dokunun diseksiyonu sırasında, diğer dokuların PBS'de saklanması esastır, çünkü kurutma veya yetersiz yağlama yapısal özelliklerin kaybına neden olabilir.
Korneanın göz küresinden diseksiyonu sırasında, göz küresinin kuru buz üzerinde inkübasyonu sabit bir kontrol sağlamazsa, limbustaki insizyonun ve korneanın ayrılmasının mümkün olması için süreyi 5 dakikaya kadar uzatabilir.
Potansiyel uygulamalar
MGH ile ilişkili oküler yüzey inflamasyonu multifaktöriyel bir hastalıktır. Bu lipid salgılayan bezlerde disfonksiyonun gelişimi ve ilerlemesi oftalmik, sistemik, hormonal ve genetik faktörler, kimyasallar, ilaçlar, mekanik zararlı ajanlar ve immünolojik yanıtlardan kaynaklanabilir33. Birçok çalışma, Meibomian bezlerinin tıkanmasına ve inflamasyona neden olan nötrofillerin 11,21,34,35,36,37,38 olduğunu bildirmiştir. Bu immünolojik yollara müdahale eden topikal ve sistemik anti-enflamatuar müdahalelerin geliştirilmesi, MGD'ye bağlı oküler rahatsızlıktan muzdarip hastalara rahatlama sağlayabilir. Allerjik göz hastalığının murin modeli, bu ajanların farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklerini araştırmak için klinik öncesi bir ortamda kullanılabilir. Bu hastalık modeli, MGD ile mücadele için uygun stratejilerin geliştirilmesini sağlar ve hastalığa neden olan yollarda hayati bileşenleri hedef alan topikal veya sistemik anti-enflamatuar ajanların uygun şekilde uygulanmasının belirlenmesine yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı (DFG) 2886 PANDORA Projesi-No.B3 tarafından desteklenmiştir; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Proje 861878 ve Volkswagen-Stiftung (Hibe 97744) tarafından MH'ye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
