Summary
Este procedimiento describe un modelo de entrenamiento de resistencia de rueda de marcha con carga progresiva traducible en ratones. La principal ventaja de este modelo de entrenamiento de resistencia es que es totalmente voluntario, lo que reduce el estrés de los animales y la carga sobre el investigador.
Abstract
Los modelos de ejercicio basados en la resistencia de roedores desarrollados anteriormente, que incluyen la ablación sinérgica, la estimulación eléctrica, la escalada de escaleras pesadas y, más recientemente, el tirón de trineo con peso, son altamente efectivos para proporcionar un estímulo hipertrófico para inducir adaptaciones del músculo esquelético. Si bien estos modelos han demostrado ser invaluables para la investigación del músculo esquelético, son invasivos o involuntarios y requieren mucha mano de obra. Afortunadamente, muchas cepas de roedores corren voluntariamente largas distancias cuando se les da acceso a una rueda para correr. Los modelos de carrera de rueda cargada (LWR) en roedores son capaces de inducir adaptaciones comúnmente observadas con el entrenamiento de resistencia en humanos, como el aumento de la masa muscular y la hipertrofia de fibras, así como la estimulación de la síntesis de proteínas musculares. Sin embargo, la adición de una carga moderada en la rueda no logra disuadir a los ratones de correr grandes distancias, lo que refleja más un modelo de entrenamiento de resistencia / resistencia, o los ratones dejan de correr casi por completo debido al método de aplicación de carga. Por lo tanto, se ha desarrollado un nuevo modelo de carrera de rueda de alta carga (HLWR) para ratones donde se aplica resistencia externa y se aumenta progresivamente, lo que permite a los ratones continuar corriendo con cargas mucho más altas que las utilizadas anteriormente. Los resultados preliminares de este nuevo modelo HLWR sugieren que proporciona suficiente estímulo para inducir adaptaciones hipertróficas durante el protocolo de entrenamiento de 9 semanas. En este documento, se describen los procedimientos específicos para ejecutar este modelo de entrenamiento de ejercicio basado en la resistencia progresiva simple pero económico en ratones.
Introduction
La masa muscular esquelética comprende aproximadamente el 40% de la masa corporal en humanos adultos; Por lo tanto, mantener la masa muscular esquelética durante toda la vida es fundamental. La masa muscular esquelética desempeña un papel integral en el metabolismo energético, el mantenimiento de la temperatura corporal central y la homeostasis de la glucosa1. El mantenimiento del músculo esquelético es un equilibrio entre la síntesis de proteínas y la degradación de proteínas, pero todavía existen muchas lagunas en la comprensión de los intrincados mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. Para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el mantenimiento y crecimiento de la masa muscular, los modelos de investigación de sujetos humanos a menudo emplean intervenciones basadas en ejercicios de resistencia, ya que los estímulos mecánicos desempeñan un papel integral en la regulación de la masa muscular esquelética. Si bien la investigación con sujetos humanos ha sido exitosa, el tiempo necesario para exhibir adaptaciones y preocupaciones éticas con respecto a los procedimientos invasivos (es decir, biopsias musculares) limitan la cantidad de datos que se pueden obtener. Si bien las adaptaciones al ejercicio de resistencia son bastante ubicuas en todas las especies de mamíferos, los modelos animales brindan el beneficio de poder controlar con precisión la dieta y el régimen de ejercicio, al tiempo que permiten la recolección de tejidos completos en todo el cuerpo, como el cerebro, el hígado, el corazón y el músculo esquelético.
Se han desarrollado muchos modelos de entrenamiento de resistencia para su uso en roedores: ablación sinérgica2, estimulación eléctrica3,4, escalada de escalera ponderada5, tirón de trineo ponderado6 y sentadilla en cuclillas7. Es evidente que todos estos modelos, si se hacen correctamente, pueden ser modelos efectivos para inducir adaptaciones del músculo esquelético, como la hipertrofia. Sin embargo, las desventajas de estos modelos son que en su mayoría son involuntarios, no forman parte del comportamiento normal de los roedores, requieren mucho tiempo / mano de obra e invasivos.
Afortunadamente, muchas cepas de ratones y ratas corren voluntariamente largas distancias cuando se les da acceso a una rueda para correr. Además, los modelos de ejercicios de rueda de carrera libre (FWR) no se basan en un acondicionamiento extensivo, refuerzo positivo / negativo o anestesia para forzar el movimiento o la actividad muscular 8,9. La actividad de correr depende en gran medida de la tensión del ratón, el sexo, la edad y una base individual. Lightfoot et al. compararon la actividad de carrera de 15 cepas diferentes de ratones y encontraron que la distancia diaria de carrera varía de 2,93 km a 7,93 km, con ratones C57BL / 6 corriendo más lejos, independientemente del sexo10. La FWR es comúnmente aceptada como un excelente modelo para inducir adaptaciones de resistencia en músculos esqueléticos y cardíacos 11,12,13,14,15,16; Sin embargo, la utilización de la carrera de ruedas en modelos de entrenamiento de resistencia se investiga con menos frecuencia.
Como se podría sospechar, el efecto hipertrófico de la carrera de la rueda podría aumentarse agregando resistencia a la rueda de rodadura, denominada carrera de rueda cargada (LWR), lo que requiere mayores esfuerzos para correr en la rueda para imitar más de cerca el entrenamiento de resistencia. Utilizando diversos métodos de aplicación de carga, estudios previos han demostrado que el modelo LWR que utiliza ratas y ratones mostró rutinariamente aumentos en la masa muscular de las extremidades de 5% -30% en cuestión de 6-8 semanas 17,18,19,20,21. Además, D'hulst et al. demostraron que un solo ataque de LWR condujo a un aumento del 50% mayor en la activación de la vía de señalización de síntesis de proteínas en comparación con FWR22. La resistencia de la rueda se ha aplicado más comúnmente mediante un método de carga constante basado en la fricción, mediante el cual se utiliza un freno magnético o un perno de tensión para aplicar la resistencia de la rueda 12,19,23,24. Una advertencia del método de carga constante basado en la fricción es que cuando se aplica una resistencia moderada a alta, el animal no puede superar la alta resistencia para iniciar el movimiento de la rueda, cesando efectivamente el entrenamiento. Lo más importante es que muchos de los sistemas de jaulas y ruedas utilizados para los modelos de ruedas de rodadura de roedores son bastante costosos y requieren equipo especializado.
Recientemente, Dungan et al. desarrollaron un modelo de funcionamiento progresivo de rueda ponderada (PoWeR), que aplica una carga a la rueda asimétricamente a través de masas externas adheridas a un solo lado de la rueda. Se cree que la carga desequilibrada de la rueda y la resistencia variable del modelo PoWeR fomentan la actividad continua de carrera y promueven ráfagas más cortas de carrera de rueda cargada en ratones, imitando más de cerca las series y repeticiones realizadas con el entrenamiento de resistencia17. A pesar de que la distancia promedio de carrera es de 10-12 km por día, el modelo PoWeR produjo un aumento del 16% y 17% en la masa húmeda del músculo plantar y el área de sección transversal de fibra (CSA), respectivamente. A pesar de muchas ventajas prácticas, el modelo PoWeR de LWR tiene algunas limitaciones. Como reconocen los autores, el modelo PoWeR es un estímulo "híbrido" de alto volumen que refleja un modelo combinado de ejercicio de resistencia / resistencia (es decir, entrenamiento concurrente en humanos), en oposición a un modelo más estrictamente basado en ejercicios de resistencia, que potencialmente introduce un efecto de interferencia y contribuye a la hipertrofia menos pronunciada o diferentes mecanismos por los cuales se induce la hipertrofia25 . Es imperativo garantizar que no ocurra un fenómeno de entrenamiento simultáneo en lo que se pretende que sea un modelo de entrenamiento de ejercicios de resistencia. Por lo tanto, el modelo PoWeR se modificó para desarrollar un modelo LWR que utiliza cargas más altas que las utilizadas anteriormente para parecerse más a un modelo de entrenamiento de resistencia. En este documento, se proporcionan detalles para un modelo LWR de entrenamiento de resistencia progresiva simple y económico de 9 semanas en ratones C57BL / 6.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de los Apalaches (# 22-05).
1. Animales
- Adquirir ratones C57BL/6 de la colonia de ratones interna.
NOTA: Se utilizaron ratones machos de 5-8 meses de edad al inicio del estudio. La actividad diaria de correr alcanza su punto máximo y se estabiliza alrededor de las 9-10 semanas de edad de26 años. Estudios previos han demostrado que los ratones viejos (22-24 meses) también realizarán carreras de ruedas cargadas27. - Aloje a los ratones individualmente en una jaula de roedores estándar con una tapa de alambre y mantenga la jaula en un ambiente controlado (20-24 ° C con un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h).
- Proporcionar comida estándar para roedores y agua ad libitum.
2. Aparatos de rueda de rodadura
- Configuración del volante:
NOTA: Las ruedas de rodadura se ensamblan / configuran de manera similar para todos los protocolos de carrera, excepto para agregar imanes de carga de 1 g o 2.5 g.- Pegue un solo imán sensor de 1 g a la circunferencia media exterior de la rueda de rodadura (Figura 1).
- Utilice esta rueda con un solo imán sensor de 1 g solo durante la primera semana de aclimatación de la rueda.
- Funcionamiento de la rueda cargada (LWR; protocolo de carga idéntico al PoWeR17): Siga los pasos 2.1.4-2.1.6.
- La semana 2 para LWR requiere 2 g de carga (ver Tabla 1).
- Pegue dos imanes de 1 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 2A).
NOTA: Aquí, es útil usar cinta adhesiva para mantener los imanes en su lugar hasta que el pegamento se seque firmemente; De lo contrario, pueden ser atraídos por el imán del sensor y desprenderse. - Aplique carga adicional en las semanas 3, 4 y 6 colocando otro imán de 1 g encima de cualquiera de los imanes ya presentes.
NOTA: No se necesita pegamento ya que los imanes se adhieren firmemente entre sí. Por ejemplo, con 6 g de carga en la semana 6, los imanes se apilarán cada uno a tres alturas (Figura 2B). - Funcionamiento de ruedas de alta carga (HLWR): Siga los pasos 2.1.8-2.1.11.
NOTA: El protocolo HLWR requiere tres juegos de ruedas. El ensamblaje de diferentes juegos de ruedas permite al investigador reutilizar las configuraciones de ruedas para otros ratones una vez que la rueda se limpia y desinfecta a fondo (el investigador debe determinar los números de cada juego según el tamaño de la cohorte / grupo). - El primer juego de ruedas (requerido solo para la semana 2) tendrá un solo imán de 2.5 g; pegar (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) un imán de 2,5 g en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3A).
- El segundo juego de ruedas (requerido solo para la semana 3) tendrá dos imanes de 2.5 g; pega (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) dos imanes de 2,5 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3B).
- El tercer juego de ruedas (requerido para la semana 4 y posteriores) tendrá tres imanes de 2,5 g uno al lado del otro; pegamento (consulte la NOTA a continuación Paso 2.1.5) tres imanes de 2,5 g uno al lado del otro en la circunferencia exterior de la rueda (Figura 3C).
- Aplique carga adicional durante las semanas 6 y 8 colocando otro imán de 2,5 g encima de cualquiera de los imanes ya presentes (Figuras 3D, E).
Figura 1: Rueda de rodadura básica con un solo imán sensor de 1 g pegado a la circunferencia exterior media de la rueda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Rueda de rodadura cargada (LWR) con imán sensor e imanes de carga de 1 g. (A) Ejemplo de 2 g de carga, dos imanes de 1 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (B) ejemplo de 6 g de carga, dos imanes de 1 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda con 4 g adicionales de carga aplicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Rueda de rodadura de alta carga (HLWR) con imán sensor e imanes de carga de 2,5 g. (A) ejemplo de 2,5 g de carga, un imán de 2,5 g pegado al borde exterior de la rueda; (B) ejemplo de 5 g de carga, dos imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (C) ejemplo de 7,5 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda; (D) ejemplo de 10 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda, con 2,5 g adicionales de carga aplicada; (E) ejemplo de 12,5 g de carga, tres imanes de 2,5 g pegados uno al lado del otro al borde exterior de la rueda, con 5 g adicionales de carga aplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Montaje de la jaula
- Ensamble las ruedas para correr usando una jaula equipada con una computadora digital para bicicletas para monitorear el tiempo de ejercicio (h) y la distancia recorrida (km). La velocidad media (km/h) se deriva aritméticamente.
- Asegúrese de que se inserte una batería nueva en el ciclocomputador antes del montaje.
- Ajuste el tamaño de la rueda durante la programación inicial de la computadora para bicicletas (consulte las instrucciones del fabricante); Calcule la distancia por revolución midiendo la circunferencia exterior de la rueda de rodadura (por ejemplo, 3.580 mm para el tipo de rueda utilizado en este documento).
- Coloque el sensor del ordenador de la bicicleta dentro de una superficie sólida en el exterior de la tapa del armazón, directamente encima de donde se encuentra el imán del sensor de la rueda. Asegúrese de que todos los componentes de la computadora y el sensor estén contenidos dentro de una barrera sólida fuera de la jaula para evitar que los ratones mastiquen los componentes.
- Utilice la tapa de una caja de punta de pipeta vacía con un pequeño rectángulo recortado para que resida el sensor magnético de la bicicleta, y la parte principal de la caja (con la rejilla del portapropinas retirada) para sostener la computadora para bicicletas y el cable (Figura 4A).
- Perfore dos orificios a través de las esquinas de la superficie sólida para asegurar el sensor magnético de la bicicleta y el soporte de la rueda en su lugar en el exterior de la jaula (Figura 4A).
- Inserte la distancia entre ejes de rodadura, boca abajo, a través de los huecos de la tapa de la jaula, pero encima de la superficie sólida descrita en el paso 3.2 (figura 4B).
- Asegure la distancia entre ejes y el sensor de la computadora a la parte superior de la jaula con hardware (Figura 4C, D).
- Asegúrese de que el imán del sensor y el sensor de la computadora estén separados no más de 1 cm para permitir el registro adecuado del movimiento de la rueda (la mayoría de los sensores estándar de la computadora para bicicletas son bidireccionales y registrarán el movimiento positivo de la rueda en cualquier dirección de rotación).
- Fije la rueda de rodadura adecuada (como se describió anteriormente) a la distancia entre ejes desde el interior de la tapa de la jaula y coloque firmemente la tapa en la jaula (Figura 4E, F).
- Con la rueda colgando de la tapa de la jaula, asegúrese de que al menos 2,5 cm de espacio libre del suelo de la jaula. Coloque una cantidad mínima de material de cama en la jaula para asegurarse de que la rueda gire libremente pero no se vea obstaculizada por la acumulación de ropa de cama.
- Durante la experimentación, registre los datos de la computadora de la bicicleta en un horario de intervalos constante para garantizar un monitoreo preciso de la actividad.
- Reconocer que los ratones son una especie nocturna; Por lo tanto, la mayor parte de su actividad natural en jaula (incluido el funcionamiento de la rueda) se realizará durante las horas oscuras del ciclo de luz.
Figura 4: Montaje de la jaula de la rueda de rodadura. (A) Computadora para bicicleta y sensor magnético colocado en superficie sólida / bandeja; (B) distancia entre ejes invertida colocada encima de la superficie sólida/bandeja y el sensor (vista superior; tenga en cuenta los dos orificios en la superficie/bandeja del sensor para asegurar la base a la tapa de la jaula con hardware), (C) distancia entre ejes invertida con hardware ensamblado (vista inferior); (D) distancia entre ejes invertida con hardware ensamblado (vista superior); (E) conjunto de jaula completa (vista superior); y (F) conjunto de jaula completa (vista lateral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Protocolos de carga de entrenamiento físico
- Aloje individualmente ratones sedentarios (SED) durante 9 semanas en una jaula que contiene una rueda de correr bloqueada para evitar correr.
NOTA: La Tabla 1 proporciona el programa de carga para los protocolos LWR (PoWeR) y HLWR utilizados en el diseño experimental. - Reduzca la carga para los grupos LWR y HLWR, si es necesario, para garantizar que los ratones continúen haciendo ejercicio durante todo el protocolo de 9 semanas.
| Semana | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | Carga (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n =7) | Carga (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
Tabla 1. Protocolos de funcionamiento de ruedas cargadas
5. Pruebas de función muscular in situ , recolección de tejidos y análisis de tejidos
- Después de la intervención de entrenamiento de 9 semanas, anestesiar a los ratones usando isoflurano inhalado (4% de inducción; 2% de mantenimiento) con oxígeno suplementario, y asegurar un monitoreo adecuado del plano anestésico durante todo el procedimiento.
- Realizar una prueba de función muscular in situ en el complejo gastrocnemio, plantaris, sóleo (GPS) para probar la fuerza muscular isométrica28. Establecer una curva fuerza-frecuencia estimulando directamente el nervio ciático con agujas de electrodos 27 G a 11 frecuencias ascendentes entre 1-300 Hz, con contracciones tetánicas que ocurren alrededor de 100-150 hz29.
- Inmediatamente después de la prueba de función muscular, eutanasia a los ratones a través de la dislocación cervical y confirme la eutanasia mediante la extirpación del corazón. Extirpe cuidadosamente los músculos plantaris y sóleo y registre la masa de tejido húmedo.
- Cubra cada muestra muscular en un medio de incrustación (OCT) y móntela en un corcho. Congélelo en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelo a -80 °C hasta que se realice un análisis inmunohistoquímico adicional (IHC) en secciones de tejido muscular (10 μm de espesor).
- Analizar la CSA de la fibra muscular utilizando inmunofluorescencia para laminina. Mida CSA de fibra utilizando una plataforma automática de cuantificación de imágenes30.
6. Análisis estadístico
- Exprese todos los datos como media ± SD.
- Realizar análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico con significación establecida en p ≤ 0,05.
- Compare los datos de carrera de rueda y volumen de entrenamiento con ANOVA bidireccional de medidas repetidas.
- Compare la masa corporal, la masa tisular, la CSA y la función muscular con un ANOVA unidireccional. Si se encuentran ratios F significativos, comparar las diferencias dentro del grupo utilizando análisis post hoc de Fisher LSD.
- Calcule los tamaños de efecto y, a continuación, interprete como 0,01, 0,06 y 0,14 para tamaños de efecto pequeño, mediano y grande, respectivamente.
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Representative Results
En este estudio, 24 ratones C57BL / 6 (6.3 ± 0.7 meses al inicio de este estudio) fueron asignados aleatoriamente a uno de tres grupos de tratamiento: sedentario (SED), carrera de rueda cargada (LWR; igual que PoWeR descrito por Dungan et al.17) o LWR alto (HLWR), y luego completaron su respectivo protocolo de 9 semanas. Después de la semana de aclimatación (semana 1), no hubo diferencias de grupo o grupo x tiempo en la distancia de carrera o el volumen de entrenamiento (Figura 5).
Figura 5: Características de la rueda de rodadura para los grupos LWR (cuadrados rellenos verdes) y HLWR (triángulos rellenos rojos). A) Distancia media diaria de carrera (km); (B) volumen medio de entrenamiento (km/día∙g) expresado como distancia diaria de carrera (km/día) multiplicado por la carga diaria de la rueda (en g). Los datos se expresan como media del grupo ± DE. LWR, n = 4; HLWR, n = 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La masa de sóleo normalizada fue 21,4% mayor en el grupo HLWR que en el grupo SED (p < 0,001), a pesar de que no hubo diferencia en la fibra CSA (p = 0,536) (Figura 6A). Aunque la masa muscular plantar y el CSA promedio de fibra no mostraron diferencias estadísticamente significativas (p = 0,573 y p = 0,111, respectivamente), parece haber un cambio en la proporción de fibras con un CSA más grande en el plantar de HLWR, en comparación con SED y LWR (Figura 6B). No hubo diferencias significativas en la contracción o la fuerza máxima del complejo GPS entre los grupos, medida por una prueba de función muscular in situ (Tabla 2).
Figura 6: Proporciones del área de la sección transversal de la fibra. (A) Proporciones de fibra muscular del sóleo y (B) plantaris (%) por área de sección transversal para los grupos SED (círculos rellenos de negro), LWR (cuadrados llenos de verde) y HLWR (triángulos llenos de rojo) (n = 3-4 / grupo). El músculo sóleo contiene proporciones similares de fibra CSA en todos los grupos. El músculo plantar del grupo HLWR parece tener una mayor proporción de fibras con CSA más grande, en comparación con los grupos SED y LWR. Los datos se expresan como media de grupo para cada categoría de tamaño de fibra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo | |||||
| SED | LWR | HLWR | Valor p | Tamaño del efecto (ƞ2) | |
| Masa corporal pre-entrenamiento (g) | 26.35 ± 2.12 | 28.07 ± 3.42 | 25,71 ± 2,22 | 0.299 | 0.324 |
| Masa corporal post-entrenamiento (g) | 26,82 ± 1,96 | 28,91 ± 2,80 | 27,43 ± 2,07 | 0.251 | 0.341 |
| Masa del sóleo (mg/g BM) | 0,28 ± 0,03 | 0,31 ± 0,02 | 0.34 ± 0.03# | 0.003 | 0.611 |
| Masa plantaris (mg/g BM) | 0,61 ± 0,06 | 0,64 ± 0,03 | 0,63 ± 0,06 | 0.573 | 0.239 |
| Soleus CSA (μm²) | 2042 ± 320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| Plantaris CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| Fuerza de contracción (N/g GPS) | 2,96 ± 0,47 | 3,19 ± 0,58 | 3,42 ± 0,78 | 0.254 | 0.340 |
| Fuerza tetánica máxima (N/g GPS) | 11,43 ± 1,77 | 13,04 ± 2,87 | 13.13 ± 1.70 | 0.136 | 0.395 |
| # - indica significativamente diferente a SED; Tamaño del efecto (ƞ2): pequeño = 0.01; medio = 0,06; grande = 0,140 | |||||
Tabla 2. Características del animal, masa tisular, fuerza muscular y área de la sección transversal de la fibra
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Discussion
Los modelos de ejercicios de resistencia existentes en roedores han demostrado ser invaluables para la investigación del músculo esquelético; Sin embargo, muchos de estos modelos son invasivos, involuntarios y/o requieren mucho tiempo y mano de obra. LWR es un modelo excelente que no solo induce adaptaciones musculares similares a las observadas en otros modelos de entrenamiento de ejercicios de resistencia bien aceptados, sino que también proporciona un estímulo de ejercicio crónico y de bajo estrés para el animal con un compromiso mínimo de tiempo / trabajo por parte del investigador. Además, dado que los modelos LWR requieren una intervención directa mínima del investigador, cohortes enteras de ratones pueden ser fácilmente entrenadas simultáneamente para estudios de intervención a corto o largo plazo. Sin embargo, la aplicación de una carga de rueda moderada no logra disuadir a los ratones de correr grandes distancias (muy poca resistencia), o los ratones dejan de correr casi por completo debido al método de aplicación de la carga (demasiada resistencia). El modelo LWR progresivo de carrera de rueda ponderada (PoWeR) desarrollado por Dungan et al. (2019)17 produce adaptaciones musculares significativas, como la hipertrofia de fibra, pero también promueve un cambio hacia un fenotipo más oxidativo. La limitación de PoWeR como un modelo verdaderamente "basado en la resistencia" es que provoca un estímulo de mayor volumen (distancia) y menor carga (resistencia), que refleja más un régimen de entrenamiento híbrido que proporciona una combinación de estímulos de resistencia y resistencia. Por lo tanto, se ha desarrollado un nuevo modelo de carrera de rueda de alta carga (HLWR) para ratones que modificó el modelo PoWeR para proporcionar más de un estímulo sesgado por la resistencia donde la carga externa se aplica y aumenta progresivamente, lo que permite a los ratones continuar corriendo, pero con cargas mucho más altas que las utilizadas anteriormente. Nuestro modelo utilizó el mismo concepto de carga de ruedas desequilibrada que el modelo PoWeR, pero con un sistema más simple y menos costoso. Además del comportamiento esporádico "normal" (encendido y apagado) de la rueda de los ratones, la carga desequilibrada de la rueda hace que los ratones corran en "chorros" interrumpidos. Esto se debe a que se requiere que el mouse tire de la carga hacia la parte superior de la rueda (gravedad opuesta) durante la primera mitad de la revolución, solo para "costar" o "rueda libre" cuando la carga cae hacia la parte inferior con gravedad durante la segunda mitad de la revolución.
Después de 9 semanas de entrenamiento, el músculo sóleo de ratones HLWR mostró un aumento del 21,4% en la masa muscular, pero ninguna diferencia en la fibra CSA. Mientras que el músculo plantar de ratones HLWR no reveló un aumento significativo en la masa muscular, la proporción de fibras con CSA más grande pareció aumentar. Konhilas et al. y Soffe et al. no observaron diferencias en el crecimiento muscular entre la rueda de baja resistencia y la alta resistencia19,23; sin embargo, en el estudio actual, la masa de sóleo aumentó en ~ 10% y ~ 20% en los grupos LWR y HLWR, respectivamente. Parece probable que la hipertrofia muscular en respuesta al nuevo modelo de entrenamiento de resistencia HLWR pueda ser específica del músculo y el tipo de fibra; Sin embargo, se necesita más investigación para confirmar esta noción. La prueba de función muscular in situ se realizó como una sola sesión aguda, solo en la extremidad derecha del ratón al final del protocolo de 9 semanas, inmediatamente antes de la eutanasia y la recolección de tejido. La masa muscular (masa húmeda normalizada a masa corporal) reportada aquí es solo de la extremidad izquierda del ratón, ya que hay hinchazón / edema significativo del procedimiento quirúrgico que podría alterar la masa húmeda en los músculos de la extremidad derecha.
La importancia de este novedoso modelo HLWR es que demuestra que los ratones continuarán funcionando con cargas relativamente altas aplicadas a la rueda. La carga de la rueda en relación con la masa corporal media (% BM) de los ratones C57BL/6 se basa en la masa corporal media de los ratones utilizados en este proyecto (~26 g). La masa corporal promedio del ratón variará dependiendo de la cepa, la edad y el sexo. Las cargas más altas de 10-12.5 g en el modelo HLWR (equivalente a ~ 40% -50% de la masa corporal del ratón) son considerablemente más altas que las del modelo PoWeR (máximo = 6 g), o aproximadamente el doble de la resistencia de la rueda. Aunque no es estadísticamente significativo, parece haber una marcada disminución en la distancia de carrera a medida que la carga de la rueda progresó más allá de 7.5 g en la semana 6 y más allá del modelo HLWR, mientras que LWR mantuvo una distancia promedio constante durante el resto del protocolo de 9 semanas. El fracaso de las altas cargas de rueda en el modelo HLWR para atenuar significativamente la distancia de carrera es una limitación de estos hallazgos; sin embargo, esto puede mitigarse con tamaños de cohorte más grandes, ya que hubo una variabilidad muy alta en el rendimiento de carrera dentro de los grupos.
Puede ser difícil evaluar la inclinación de un ratón a correr constantemente dentro de la primera semana de aclimatación a la carrera de ruedas. Dado que algunos ratones simplemente no corren lo suficiente como para inducir adaptaciones musculares, se recomienda la implementación de un umbral mínimo de corte para la inclusión continua de cualquier ratón en particular en los grupos de carrera de ruedas. El umbral mínimo de corte debe ser una distancia media de carrera de al menos 1 km/día durante la primera semana de aclimatación. Si un ratón no corre al menos 1 km/día en promedio durante la primera semana, es poco probable que el ratón aumente sustancialmente la distancia de carrera durante el resto del protocolo de 9 semanas para proporcionar un estímulo sustancial para que se produzcan adaptaciones. En este caso, si algún ratón en particular no alcanza el umbral mínimo de 1 km/día después de la primera semana de aclimatación, bloquee la rueda y reasigne ese ratón al grupo sedentario. La implementación de este umbral mínimo de corte disminuirá la variabilidad en las estadísticas de ejecución y garantizará que los ratones adquieran un estímulo de entrenamiento adecuado durante el protocolo de 9 semanas. Esto está en el espíritu de las tres "R" de la investigación con animales, específicamente la reducción. En segundo lugar, es importante tener un plan de contingencia incorporado si un mouse no puede correr una cierta distancia cuando se aplican altas cargas de rueda. Para garantizar que los ratones continúen haciendo ejercicio durante todo el protocolo de 9 semanas, la carga debe reducirse a la de la semana anterior si la distancia de carrera cae por debajo de 0,25 km / día durante 3 días consecutivos. En este caso, si algún ratón en particular no corre un promedio de al menos 0,25 km durante 3 días consecutivos después de agregar carga, puede ser necesario reducir la carga de la rueda a la carga anterior para garantizar que el ratón continúe entrenando durante el resto del protocolo de 9 semanas. En este estudio, se observó que la mayoría de los ratones pudieron continuar corriendo distancias > 0,25 km / día, incluso con las cargas más altas (12,5 g) en el protocolo HLWR (Figura 5A). Sin embargo, este plan de contingencia se implementó para tres de los siete ratones en el grupo HLWR, por lo que la carga debía reducirse a 10 g o 7,5 g en un momento durante el protocolo de entrenamiento de 9 semanas. Sería desafortunado que un ratón se ejecutara con éxito durante la mayor parte del protocolo solo para ser eliminado del estudio porque no podría alcanzar la siguiente etapa con cargas de rueda muy altas. Reducir ligeramente la carga para garantizar la carrera continua maximiza el uso de un animal individual sin comprometer el bienestar. Por último, también es importante realizar un seguimiento del consumo diario (o al menos semanal) de alimentos para asegurarse de que los ratones consuman suficiente comida para compensar el aumento de la actividad física. Esto es relativamente simple cuando los ratones están alojados individualmente. Espere un aumento en la ingesta de alimentos de ~ 20% en comparación con los ratones sedentarios31.
Es difícil comparar directamente estos resultados (por ejemplo, distancias de carrera) con los publicados originalmente para el modelo PoWeR. Dungan et al. informaron distancias de carrera de ~ 10-12 km por día17, mientras que los ratones en el protocolo actual que realizó el protocolo LWR corrieron ~ 5-6 km por día. La marcada discrepancia podría atribuirse a los ratones machos utilizados en el protocolo actual, en comparación con los ratones hembra utilizados por Dungan et al., ya que se ha observado que los ratones hembra corren ~ 20% -40% más lejos10,32. Además, Dungan et al. utilizaron ruedas de metal con una superficie de rodadura de varilla de metal, lo que puede conducir a un mejor rendimiento de carrera en comparación con las ruedas de plástico utilizadas en el protocolo actual. Se ha informado previamente que los ratones hembra jóvenes C57BL / 6 corrieron en promedio 8-10 km / día en la misma configuración de rueda de plástico33. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que se realicen pruebas piloto para entornos de laboratorio individuales para determinar el rendimiento de carrera de los ratones debido a factores como la tensión, el sexo, el tipo de rueda y la variación individual.
La principal ventaja del modelo de funcionamiento de rueda de alta resistencia a la carga descrito aquí es que es mucho más rentable que otros modelos que requieren equipos especializados costosos. El equipo para esta configuración de rueda de rodadura cuesta una fracción de los aparatos especializados de rueda de rodadura disponibles de proveedores comerciales. Finalmente, los modelos de carrera de ruedas cargadas cumplen con otra de las tres "R" del refinamiento de la investigación con animales. Como la carrera de la rueda es un estímulo totalmente voluntario, estos modelos no son invasivos y significativamente menos estresantes para los ratones en comparación con otros modelos de hipertrofia, específicamente la ablación sinérgica u otros modelos que requieren días o semanas de condicionamiento operante. Los estudios futuros deberían confirmar que el modelo HLWR proporciona un mayor estímulo hipertrófico en comparación con el estímulo combinado de resistencia/resistencia del modelo LWR. En conclusión, si se realiza correctamente, la aplicación potencial de este novedoso modelo progresivo de carrera de rueda de alta resistencia de carga es una intervención de ejercicio de resistencia simple pero económica, de alto rendimiento y bajo estrés para ratones.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Asociación de Gobierno de Estudiantes de Posgrado, la Oficina de Investigación Estudiantil y el Departamento de Salud y Ciencias del Ejercicio de la Universidad Estatal de los Apalaches por proporcionar fondos para apoyar este proyecto. Además, nos gustaría agradecer a Monique Eckerd y Therin Williams-Frey por supervisar las operaciones diarias de las instalaciones de investigación animal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
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