Summary
הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.
Abstract
פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לדמיין מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות ברקמות המוח. מבנים עצביים הנעים בין מעגלים עצביים למבנים עצביים תת-תאיים מוצגים באופן חזותי בפרוסות מוח של עכברים המנוקות אופטית באמצעות ScaleSF. שיטת ניקוי זו היא גרסה שונה של ScaleS והיא שיטה הידרופילית לניקוי רקמות עבור פרוסות רקמה שמשיגה יכולת ניקוי חזקה כמו גם רמה גבוהה של שימור אותות פלואורסצנטיים ושלמות מבנית. תא הדמיה תלת-ממדי (תלת-ממדי) הניתן להתאמה אישית (3D) מתוכנן להרכבה אמינה של רקמות מוח מנוקות. מוחות עכברים שהוזרקו להם וקטור נגיף הקשור לאדנו הנושא גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר תוקנו עם 4% פרפורמלדהיד ונחתכו לפרוסות בעובי של 1 מ"מ עם פרוסת רקמה רוטטת. פרוסות המוח נוקו על ידי ביצוע פרוטוקול הסליקה, הכולל דגירות עוקבות בשלוש תמיסות, כלומר, תמיסת ScaleS0, מלח חיץ פוספט (–) ותמיסת ScaleS4, בסך הכל 10.5–14.5 שעות. פרוסות המוח המנוקות הותקנו על תא ההדמיה והוטמעו בג'ל אגרוז של 1.5% שהומס בתמיסת ScaleS4D25(0). רכישת התמונה התלת-ממדית של הפרוסות בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך. החל מהדמיה עצבית מזוסקופית, הצלחנו לדמיין מבנים עצביים תת-תאיים עדינים, כגון עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים, בפרוסות המוח המנוקות אופטית. פרוטוקול זה יקל על הבנת המבנים העצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים.
Introduction
שיטות ניקוי רקמות שיפרו הדמיה בלתי תלוית עומק של דגימות ביולוגיות וקליניות באמצעות מיקרוסקופיה קלה, ואפשרו מיצוי של מידע מבני על רקמות שלמות 1,2. טכניקות ניקוי אופטיות עשויות גם להאיץ, ולהפחית את העלות עבור ניתוח היסטולוגי. נכון לעכשיו, קיימות שלוש גישות סליקה עיקריות: שיטות הידרופיליות, הידרופוביות ומבוססות הידרוג'ל 1,2. הגישות ההידרופיליות עולות בשמירה על אותות פלואורסצנטיים ושלמות הרקמות והן פחות רעילות בהשוואה לשתי הגישות האחרות 3,4.
שיטת סליקה הידרופילית, ScaleS, מחזיקה בעמדה ייחודית עם שימור השלמות המבנית והמולקולרית שלה, כמו גם יכולת הסליקה החזקה (ספקטרום ניקוי-שימור)5. במחקר קודם פיתחנו פרוטוקול סליקה מהיר ואיזומטרי, ScaleSF, לפרוסות רקמה (בעובי של כ-1 מ"מ) על ידי שינוי הליך הסליקה של ScaleS6. פרוטוקול סליקה זה דורש דגירות עוקבות של פרוסות מוח בשלושה פתרונות למשך 10.5-14.5 שעות. השיטה מוצגת עם ספקטרום גבוה של ניקוי-שימור, התואם אפילו לניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) (איור משלים 1), המאפשר הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) רב-ממדית ברזולוציה גבוהה (3D) עם שחזור אותות מדויק6. לפיכך, ScaleSF צריך להיות יעיל במיוחד במוח, שבו תאי עצב מפרטים תהליכים שופעים באורך עצום, ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים להעברת וקבלת מידע. חילוץ מידע מבני עם קשקשים מרמות מעגליות לתת-תאיות על תאים עצביים הוא די שימושי להבנה טובה יותר של תפקודי המוח.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להדמיית מבנים עצביים עם קשקשים מהרמה המזוסקופית/מעגלית לרמה המיקרוסקופית/תת-תאית באמצעות ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות, הבהרת רקמות, טיפול ברקמות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) של רקמות מנוקות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בחקירת מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים. לקבלת הליך מפורט להכנת הפתרונות והזרקה סטריאוטקסית של וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) למוחם של עכברים, עיין ב- Miyawaki et al. 20167 ו- Okamoto et al. 20218, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונטנדו (אישור מס '2021245, 2021246) ובוצעו בהתאם להנחיות היסוד לביצוע נכון של ניסויים בבעלי חיים על ידי המועצה המדעית של יפן (2006). כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים שהוזרקו להם וקטור AAV הנושאים גן משופר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ועכברים מהונדסים (PV)/myristoylation (PV)/myristoylation-EGFP-קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה C-terminal בקטריאלי כרומוזום מלאכותי (BAC) עכברים מהונדסים (PV-FGL)9 . עכברי PV-FGL נשמרו ברקע C57BL/6J. לא נמצאו הבדלים בין המינים ביחס למחקר זה.
1. הכנת רקמות
- קיבוע פרפוזיה
הערה: בצע את שלבים 1.1.1 עד 1.1.3 במכסה אדים כדי להגביל את החשיפה לפרפורמלדהיד (PFA).- מרדימים עכברים זכרים בוגרים (בני 8-16 שבועות) על ידי הזרקה תוך-צפקית של מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (200 מ"ג/ק"ג). אשרו את הלימות ההרדמה על ידי היעדר נסיגה מכווצת בוהן ורפלקסים של מצמוץ עיניים.
- פותחים את חלל בית החזה וחותכים את תוספתן הפרוזדורים הימני עם מספריים כירורגיים. מחדירים לעכברים 20 מ"ל של מלח חיץ פוספט קר כקרח (PBS) באמצעות מחט של 23 גרם המחוברת למזרק של 20 מ"ל, ולאחר מכן זלוף של 20 מ"ל של 4% PFA קר כקרח ב-0.1 M מאגר פוספט (PB) באמצעות מזרק נוסף של 20 מ"ל.
אזהרה: PFA הוא רעיל וטרטוגני. יש להימנע משאיפה או ממגע עם העור, העיניים והממברנה הרירית. - הסר רקמות מוח מהגולגולת באמצעות פינצטה. מעבירים את רקמות המוח לצינור של 15 מ"ל המכיל 4% PFA ב-0.1 M PB, מגנים על הדגימות מפני אור, ומתנדנדים בעדינות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר ב-50-100 סל"ד.
- הערה: ניתן לאחסן את רקמות המוח שנקטפו במשך מספר שבועות ב-0.02% נתרן אזיד (NaN3) ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
אזהרה: NaN3 הוא רעיל. יש להימנע משאיפה או ממגע עם העור, העיניים והממברנה הרירית. טפלו בו בתוך מכסה אדים.
- הכנת פרוסת מוח
- הכן 4% אגר ב- PBS על ידי הוספת 2 גרם של אגר ל-50 מ"ל של PBS. מחממים את התערובת עד שהאגר מומס במלואו. תנו לפתרון להתקרר ל-40-45 מעלות צלזיוס.
הערה: התכונה הצמיגית המסופקת על ידי אגרופקטין, מרכיב עיקרי של אגר, משפרת את קלות החיתוך של פרוסות טישו. - הוסיפו 10 מ"ל של תמיסת האגר לצלחת תרבית של 6 בארות. להטביע את רקמת המוח בתמיסת האגר באמצעות מלקחיים. תנו לאגר להתמצק על הקרח.
- הסר את רקמת המוח המוטבעת מהבאר וגזוז את האגר באמצעות סכין גילוח. הצמידו את גוש האגר לתחתית אמבט הוויברטום בעזרת superglue ושפכו 0.1 M PB למגש החיץ.
- נקו סכין גילוח נוסף באמצעות נייר טישו נטול מוך ספוג באתנול והצמידו את הלהב למחזיק הלהב של פרוסת הרקמות הרוטטות.
- הגדר את מהירות החתך ל-0.14 מ"מ לשנייה עם משרעת של 1.4 מ"מ והתדר ל-75-77 הרץ. חתך את רקמת המוח לפרוסות בעובי 1 מ"מ ואסוף את הפרוסות בלוח תרבית תאים בן 6 בארות המכיל PBS.
הערה: ניתן לאחסן את פרוסות המוח במשך מספר שבועות ב-0.02% NaN3 ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הכן 4% אגר ב- PBS על ידי הוספת 2 גרם של אגר ל-50 מ"ל של PBS. מחממים את התערובת עד שהאגר מומס במלואו. תנו לפתרון להתקרר ל-40-45 מעלות צלזיוס.
2. הבהרת רקמות
הערה: ההרכבים של פתרונות ScaleS המשמשים מפורטים בטבלה 1. דגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור על ידי כיסוי בנייר כסף. שלבי הסליקה מוצגים באיור 1A.
- הוסיפו 8 מ"ל של תמיסת ScaleS0 לבאר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות והוסיפו 8 מ"ל של תמיסת ScaleS4 לבאר אחרת של הצלחת וחום מראש ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
- מעבירים את פרוסות המוח לתמיסת ScaleS0 שחוממה מראש עם מרית ואינקובציה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-90 סל"ד.
- מעבירים את פרוסות המוח החודרות ב-8 מ"ל של PBS(–) בצלחת תרבית תאים של 6 בארות עם מרית ושוטפים במשך 15 דקות על ידי שמירה על שייקר מסלולי ב-40-60 סל"ד. חזור על כך פעמיים.
- מעבירים את פרוסות המוח ב-8 מ"ל המחוממים מראש של תמיסת ScaleS4 עם מרית ומנקים אותן על ידי דגירה באינקובטור רועד ב-90 סל"ד למשך 8-12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ניתן לראות פרוסות מוח מנוקות באיור 1.
3. הרכבה של פרוסת המוח
הערה: תא הדמיה הניתן להתאמה אישית משמש להרכבה אמינה של פרוסות מוח מנוקות (איור 2)6. התא מורכב ממסגרת התא והכיסוי התחתון. מתאמי שלב המיקרוסקופ מתוכננים גם להרכיב את תא ההדמיה על שלבי המיקרוסקופ ישירות (איור 2A,B). ניתן להדפיס בתלת-ממד את מתאמי שלב מסגרת התא והמיקרוסקופ באמצעות שירותי הדפסה תלת-ממדית פנימיים או במיקור חוץ. נתוני תכנון תלת-ממדי בעזרת מחשב (CAD) של תא ההדמיה מסופקים ב- Furuta et al. 20226.
- להכנת התא, חברו את מסגרת התא לכיסוי באמצעות דבק רגיש ללחץ.
- הכן 1.5% אגרוז בתמיסת ScaleS4D25(0) (ג'ל ScaleS4) על ידי הוספת 1.5 גרם אגרוז ל-100 מ"ל של התמיסה בבקבוק. מערבבים היטב את התמיסה על ידי ערבוב ומיקרוגל של התמיסה עד שהאגרוז מומס במלואו. לאחר שתסיים, אפשרו לפתרון להתקרר ל-37 מעלות צלזיוס.
- הרכיבו את פרוסת המוח המנוקה על הכיסוי התחתון של תא ההדמיה בעזרת מרית. נגבו את התמיסה העודפת מהפרוסה שפונה באמצעות נייר טישו נקי ללא מוך.
- הוסיפו את הג'ל ScaleS4 על פרוסת המוח באמצעות מיקרופיפט כדי למלא את תא ההדמיה. מניחים כיסוי נוסף על גבי מלקחיים ומניחים פיסת נייר טישו נטולת מוך ומגלשת זכוכית על הכיסוי בסדר זה.
- העבירו את תא ההדמיה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מניחים משקולות מתכת על מגלשת הזכוכית ומשאירים אותן למשך 30 דקות.
- הסר את משקולות המתכת, החלקת הזכוכית, נייר טישו נטול מוך וכיסויים מתא ההדמיה, וניגב את הג'ל העודף (איור 2A,B).
- מניחים את תא ההדמיה בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ ומחברים את שפת תא ההדמיה לצלחת עם דבק רגיש ללחץ דמוי מרק. חברו את החדר במספר נקודות לצלחת הפטרי.
- יוצקים תמיסת ScaleS4 בצלחת ומנערים בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-40-60 סל"ד. החליפו בתמיסה טרייה והסירו בועות אוויר על משטח הג'ל על ידי גירוד עדין של המשטח באמצעות קצה פיפטה של 200 μL. הרכיבו את תא ההדמיה השקוע על במת מיקרוסקופ (איור 2C).
4. הדמיית CLSM
- השג תמונות באמצעות CLSM המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך (WD) (16x/0.60 מפתח צמצם מספרי [NA], WD = 2.5 מ"מ).
הערה: עדשות אובייקטיביות בעלות NA גבוהה יכולות לספק רזולוציה מוגבלת עקיפה גבוהה. - הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי (תחנת עבודה, מיקרוסקופ, סורק, לייזרים ומנורת כספית) והפעל תוכנת הדמיה CLSM.
- הגדר את צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית מרובת הטבילות ל- 1.47. לתמיסת ScaleS4 יש מקדם שבירה (RI) של כ-1.47 5,7. סטיות הנגרמות על-ידי אי-התאמה של RI עלולות להפריע להיווצרות התמונה (איור 3).
- לטבול את העדשה האובייקטיבית בתמיסה, ולתת לה להתקרב לפרוסה לאט. הסר את בועות האוויר הכלואות בקצה העדשה האובייקטיבית. מצא אזורי עניין (ROIs) ברקמות המנוקות באמצעות אפיפלואורסצנציה.
- הגדר פרמטרים של רכישת תמונה על-ידי בדיקת הגדרות מתאימות.
- קבע את עומק הסיביות עבור רכישת תמונה. גודל הנתונים של התמונה גדל עם עומק הסיביות.
- הגדר את אורך הגל של הגילוי. התאם את השער המתאים לגלאי בהתאם לספקטרום הפליטה. ודא שאורך הגל של הגילוי אינו מכסה קווי לייזר כלשהם.
- הגדר את רזולוציית xy . פורמטים גדולים יותר מספקים רזולוציות xy טובות יותר, אך לוקח זמן רב יותר לאסוף את התמונות.
- הגדר את מהירות הסריקה. מהירות סריקה איטית יותר מספקת יחס אות לרעש גבוה. עם זאת, הוא גם מגדיל את זמן השהייה של הפיקסלים ואת הסיכון להלבנת תמונות. בחר בהתאם.
- התאם את גודל חור הסיכה. גודל חור הפין שולט בעובי המקטע האופטי. גודל חור סיכה קטן יותר יוצר מקטע אופטי דק יותר, ולכן רזולוציית z טובה יותר, אך מקטין את האות הפלואורסצנטי. הגדלת גודל חור הפין מספקת מקטע אופטי עבה יותר עם אות פלואורסצנטי חזק יותר.
- הגדר את עוצמת הלייזר, את רווח הגלאי/מגבר והסט. הגדל בהדרגה את כוח הלייזר ואת רווח הגלאי/מגבר עד לקבלת תמונה מתאימה. עוצמת לייזר גבוהה נושאת את הסיכון של הלבנת תמונות. התאם את ההיסט (ניגודיות) כראוי כדי לקבל יחס אות לרעש גבוה.
- קבע את שטח העיבוד הדרוש בהתבסס על גודל ההחזר על ההשקעה. ודא שכל האורך והרוחב של ההחזר על ההשקעה נלכדים.
- נווטו ברקמות המנוקות בכל המישורים, והגדירו את נקודות ההתחלה והסיום של הערימה. הגדר את גודל הצעד z בהתאם לרזולוציית z הרצויה.
- אסוף תמונות כאשר הן מרוצות מהגדרות רכישת התמונות, והקליט תמונות שצולמו. לעבד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניקוי אופטי של פרוסת מוח של עכבר בעובי 1 מ"מ הושג באמצעות פרוטוקול זה. איור 1B מייצג תמונות שידור של פרוסת מוח של עכבר לפני ואחרי הטיפול בפינוי. שיטת ניקוי הרקמות הפכה פרוסת מוח עכברית בעובי 1 מ"מ לשקופה. הרחבה קלה בגדלים הסופיים של פרוסות המוח נמצאה לאחר הדגירה בתמיסת הסליקה במשך 12 שעות (הרחבה ליניארית: 102.5% ± 1.3%). השימור של פלואורסצנציה ושלמות המבנית של הרקמות הוערך באמצעות ביטוי EGFP ממוקד בקרום הפלזמה בעכברי PV-FGL (איור 1C). בעכברים אלה, EGFP ממוקד קרום סומטודנדריטי מתבטא בתאי עצב חיוביים ל-PV9. ביטוי EGFP הממוקד בקרום הפלזמה באזור הסומטודנדריטי נשמר לאחר הטיפול (איור 1C). בנוסף, מחקר EM הקודם הראה שלמות מבנית שמורה היטב ברקמות המוח שנוקו באמצעות ScaleSF (איור משלים 1)6.
סטיות הנגרמות על-ידי אי-התאמה של RI גרמו לאובדן ניכר של בהירות ורזולוציה של התמונה (איור 3). פרוסת מוח בעובי 1 מ"מ של עכבר PV-FGL נוקתה והודגמה תחת CLSM המצוידת בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של WD ארוך. התאמת צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית למצב המים (RI 1.33) פגעה בהדמיה ברורה של נוירונים חיוביים ל-EGFP הממוקמים בעומקים של 400 מיקרומטר ו-800 מיקרומטר עקב בהירות נמוכה וניגודיות נמוכה. (איור 3A,C). נוירונים אלה הודגשו בבירור עם אותו CLSM, כאשר צווארון התיקון הותאם כך שיתאים לתמיסת ScaleS4 (RI 1.47; איור 3B,D). התאמת RI בין נוזל טבילה לעדשה אובייקטיבית היא קריטית להדמיה תלת-ממדית מדויקת ברקמות המנוקות אופטית.
לבסוף, נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים שימשו כדי להדגים את ההיתכנות של הפרוטוקול. מוח עכבר שהוזרק לו AAV2/1-SynTetOff-EGFP וקטור10 בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1) תוקן עם 4% PFA ב-0.1 M PB. פרוסות קורונל בעובי 1 מ"מ הוכנו מהמוח עם פרוסת רקמה רוטטת. לאחר הניקוי וההרכבה על תא ההדמיה, נערכה הדמיה עצבית המכוונת לנוירונים ניאו-קורטיקליים (איור 4). שחזור תלת-ממדי של תאי עצב המסומנים ב-EGFP בפרוסת המוח בעובי 1 מ"מ מיוצג באיור 4A. תמונת הגדלה גבוהה יותר מראה ארבורים דנדריטיים בודדים המעוטרים בקוצים דנדריטיים (איור 4B). בנוסף, הראינו ארבוריזציות של טרמינל אקסון ובוטונים אקסונאליים בקליפת המוח הקונטרה-צדדית (איור 4C).
איור 1: ניקוי אופטי של פרוסות מוח של עכבר בעובי של 1 מ"מ. (A) לוח הזמנים לפינוי רקמות ScaleSF. (B) שידור תמונות של פרוסות מוח בעובי 1 מ"מ לפני (משמאל) ואחרי (מימין) טיפול. (C) עיבוד נפח תלת-ממדי של קליפת המוח של עכבר PV-FGL שפונה בשיטת ניקוי הרקמה. (ד,ה) xy תמונות ב-(C) בעומקים של 250 מיקרומטר (D) ו-750 מיקרומטר (E). (ו,ז) תצוגה מוגדלת של המלבנים המתוארים ב- (D) ו- (E). תמונות המופיעות ב- (C-G) נמחקות לפני תהליך העיבוד. קיצורים: pia = pia mater, WM = חומר לבן. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ אינץ' (B), 500 מיקרומטר אינץ' (C), 200 מיקרומטר אינץ' (D,E) ו-40 מיקרומטר אינץ' (F,G). נתון זה שונה מ- Furata et al. 20226. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תא הדמיה שהודפס בתלת-ממד הניתן להתאמה אישית לצורך הדמיה של פרוסות רקמות. (A,B) ציור סכימה (A) ותמונה (B) של תא הדמיה שהודפס בתלת-ממד הניתן להתאמה אישית. תא ההדמיה מורכב ממסגרת תא, כיסוי תחתון ומתאמים לבמה מיקרוסקופית. פרוסות טישו מנוקות מונחות על הכיסוי התחתון ומוטמעות בג'ל ScaleS4. מסגרת התא, הכיסוי התחתון ומתאמי שלב המיקרוסקופ ניתנים להתאמה אישית בהתאם לגודל ולעובי של פרוסות הרקמה. (C) מערך הדמיה עם תא ההדמיה. תא ההדמיה שקוע בתמיסת ScaleS4 בצלחת פטרי ומותקן על במה של CLSM זקוף. נתון זה שונה מ- Furata et al. 20226. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הדמיה עמוקה נפגעת הנגרמת על-ידי חוסר התאמה של RI בין עדשה אובייקטיבית לביןתמיסת Sc aleS4. (A-D) xy תמונות של קליפת המוח של קליפת המוח של עכבר PV-FGL בעומקים של 400 מיקרומטר (A,B) ו-800 מיקרומטר (C,D). תיקון הצווארון של עדשה אובייקטיבית מרובת טבילות מותאם ל-1.33 אינץ' (A,C) ו-1.47 אינץ' (B,D). התמונות נרכשות באותם פרמטרים למעט RIs של העדשה האובייקטיבית. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הדמיה עצבית בפרוסת מוח עכבר בעובי 1 מ"מ שפונה באמצעות ScaleSF. (A) עיבוד נפח תלת-ממדי של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים המסומנים ב-EGFP ב-S1. נוירונים ניאו-קורטיקליים מסומנים עם וקטור AAV2/1 SynTetOff-EGFP. (B) ארבורים דנדריטיים של נוירונים ניאו-קורטיקליים המסומנים ב-EGFP. תמונת הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) מעומק של 39 מיקרומטר עד 48 מיקרומטר מיוצגת. ראשי חץ מצביעים על קוצים דנדריטיים. (C) מסופי אקסון המסומנים ב-EGFP בקליפת המוח הקונטרה-צדדית. תמונת MIP מעומק של 481.5 מיקרומטר עד 513 מיקרומטר מיוצגת. ראשי חץ מציינים בוטונים אקסונאליים. תמונות המופיעות ב-(B) וב-(C) נמחקות. סרגלי קנה מידה: 300 מיקרומטר ב- (A) ו- 10 מיקרומטר ב- (C). הסרגל ב-(C) חל גם על (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: מבנה-על בפרוסות המוח שפונה עם ScaleSF, CUBIC ו-PACT. (A-C) העברת תמונות EM של קליפת המוח של עכברים עם ScaleSF (A), CUBIC (B) ו-PACT (C). מוחות של עכברים מקובעים עם 4% PFA המכילים 1% גלוטארלדהיד. מקטעי אולטרה-ת'ין מוכנים מפרוסות מוח מנוקות. מבני ממברנות נפגעים קשות בפרוסות מוח המנוקות באמצעות CUBIC (B) ו-PACT (C). ראשי חץ מציינים ממברנות פוסט-סינפטיות. סרגל קנה מידה: 500 ננומטר. נתון זה שונה מ- Furata et al. 20226. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| Recipies עבור פתרונות ScaleS | |
| ScaleS0 solution | |
| מגיב | ריכוז סופי |
| D-sorbitol | 20% (w/v) |
| גליצרול | 5% (w/v) |
| מתיל-β-ציקלודקסטרין | 1 מ"מ |
| γ-ציקלודקסטרין | 1 מ"מ |
| דימתיל סולפוקסיד | 3% (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4 solution | |
| מגיב | ריכוז סופי |
| אוריאה | 4 מ' |
| D-sorbitol | 40% (w/v) |
| גליצרול | 10% (w/v) |
| טריטון X-100 | 0.2% (w/v) |
| דימתיל סולפוקסיד | 25% (v/v) |
| פתרון ScaleS4D25(0) | |
| מגיב | ריכוז סופי |
| אוריאה | 4 מ' |
| D-sorbitol | 40% (w/v) |
| גליצרול | 10% (w/v) |
| דימתיל סולפוקסיד | 25% (v/v) |
טבלה 1: הרכב שלושת פתרונות ScaleS. ההרכבים של פתרונות ScaleS0, ScaleS4 ו- ScaleS4D25(0) מפורטים. להליך מפורט להכנת פתרונות אלה, עיין Miyawaki et al. 20167.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בזהירות מרבית כדי להשיג תוצאות משמעותיות. קיבוע אחיד של דגימות הוא הכרחי להדמיה תלת-ממדית בתוך רקמות בקנה מידה גדול. העדשה האובייקטיבית, המדגם ונוזל הטבילה צריכים להיות בעלי RI תואם. אי-התאמה של RI ביניהם תוביל להדמיה מופרעת מאוד של תאים המבטאים EGFP בתוך פרוסות המוח המנוקות (איור 3). התאמת צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית לנוזל הטבילה ממזערת סטיות כדוריות המושרות בעומק כדי למקסם את האות, הניגודיות והרזולוציה המרחבית בהדמיה תלת-ממדית. ניתן למדוד את ה- RIs של הפתרונות המוכנים באמצעות מד שבירה.
פתרון בעיות של הטכניקה
אחסון ארוך יותר של הפתרונות יכול להשפיע על יכולת הסליקה, ועל יכולת השמירה שלו על אותות פלואורסצנטיים ושלמות מבנית. יש להשתמש בפתרונות מוכנים טריים. ניתן לאחסן פתרונות אלה עד חודש אחד בטמפרטורה של 4 °C (66 °F). איזומטריה היא קריטית להדמיה עצבית יעילה ויעילה עם שחזור אותות מדויק. למרות שנצפתה התפשטות קלה בגודל המדגם לאחר הדגירה במשך 12 שעות (איור 1B), ניתן לשלוט בהתפשטות על ידי הקטנת תקופת הדגירה בין 8-12 שעות. להדמיית עומק תלת-ממדית מדויקת יותר, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את צווארון התיקון במישור נתון עקב סטייה כדורית המושרה בעומק.
שינויים בטכניקה
במחקר הנוכחי השתמשנו ברקמות מוח של עכברים כדי להדגים את ההיתכנות של הפרוטוקול. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם עבור בעלי חיים בעלי מוח גדול, כגון פרימטים. ואכן, פרוטוקול זה שימש ברקמות מוח נפוצות של מרמוסט (Callithrix jacchus), והצליח בהדמיה סימולטנית של מעגלים עצביים ומבנים תת-תאיים של מעגלי הקורטיקוסטריאטים שלו6. מתאמי שלב המיקרוסקופ מתוכננים להרכיב את תא ההדמיה על שלבי המיקרוסקופ ישירות6 (איור 2A,B). ניתן להבחין בפרוסות רקמה מנוקות באמצעות מיקרוסקופ הפוך דרך הכיסוי התחתון של תא ההדמיה. לאחר שחזור של רקמות מוח מנוקות עם PBS(-) (deScaling)5,11, אנו יכולים להכין מקטעי רקמה בעובי של 20 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר מרקמות המוח שנוקו באמצעות ScaleSF (חתך מחדש)6. ניתן לדמות שוב מבנים תת-תאיים שנלכדו בתוך רקמות מנוקות בחתכים חוזרים עם עדשת NA אובייקטיבית גבוהה של WD קצרה. ניקוי של פרוסות מוח עם מקבעים המכילים גלוטארלדהיד הושג באמצעות פרוטוקול זה, המספק שימור אולטרה-מבנה מעולה6. ScaleSF משיג רמה גבוהה של שימור מבנה-על המאפשר ניתוח EM ברקמות מנוקות אופטית6 (איור משלים 1). תאימות EM של שיטה זו שימושית במיוחד עבור מבני הדמיה עם קני מידה מרמה מקרוסקופית לרמה ננוסקופית.
מגבלות הטכניקה
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לדמיין מבנים עצביים ממעגל לקנה מידה תת-תאי בפרוסות מוח בעובי 1 מ"מ. עם זאת, שלוש מגבלות נותרו בפרוטוקול. הראשון הוא יכולת הסליקה של פרוטוקול הסליקה. ScaleSF הוא פרוטוקול ניקוי לפרוסות מוח, לא לכל המוח. אף על פי שפרוסות מוח בעובי של 1 מ"מ יכולות לספק ידע טוב על ארבורים דנדריטיים ואקסונאליים מקומיים12, מידע על הקרנות אקסונאליות המשתרעות על פני המוח כולו הוא מקוטע ולא שלם בפרוסות 13,14,15,16. השנייה היא רזולוציית ההדמיה. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, הצלחנו לדמיין מבנים עצביים תת-תאיים, כגון עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים, בפרוסת מוח מנוקה אופטית (איור 4). עם זאת, הרזולוציה של העדשה האובייקטיבית המשמשת במחקר זה, רזולוציית xy של 400-750 ננומטר, אינה מספיקה כדי לפתור מבנים עדינים יותר של תאים עצביים. בהינתן שעדשות אובייקטיביות NA גבוהות מיועדות בדרך כלל לטבילת שמן (RI 1.52), חוסר התאמה של RI עם הפתרונות (RI 1.47) עשוי למנוע הדמיה ברזולוציה גבוהה עם עדשות אובייקטיביות אלה. השלישי הוא תיוג חלבונים פלואורסצנטיים של תאי עצב. שיטת התיוג מגבילה יישומים רחבים של טכניקת ההדמיה שלנו. טכניקות היסטוכימיות ו/או אימונוהיסטוכימיות המסמנות רקמות בקנה מידה גדול תוך שמירה על שלמות הרקמה יקדמו באופן משמעותי את הפרוטוקול המסופק כאן.
משמעות ביחס לשיטות הקיימות וליישומים עתידיים של הטכניקה
במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להדמיה עצבית ממבנים מזוסקופיים למיקרוסקופיים באמצעות ניקוי רקמות ScaleSF. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לדמיין מבנים עצביים מרמות מעגלים לתת-תאיים בפרק זמן סביר ללא ציוד מיוחד, מה שמקל על ההבנה של מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים. תאי עצב מפרטים תהליכים שופעים באורך עצום ומסדרים מבנים עדינים מיוחדים להעברת וקבלת מידע. לפיכך, הדמיה עצבית דורשת שיטת ניקוי רקמות המפעילה יכולת ניקוי חזקה, כמו גם רמה גבוהה של שימור רקמות להדמיה סימולטנית של מבנים בקנה מידה גדול וקטן כאחד. עם זאת, שיטות ניקוי רקמות המופיעות עם יכולות ניקוי גבוהות מסירות באגרסיביות שומנים ופיגמנטים להבהרת רקמות נרחבת 3,4, תוך פגיעה בשלמות הרקמה 5,6,17 (איור משלים 1). זאת בניגוד מוחלט לפרוטוקול הסליקה שבו נעשה שימוש כאן, שמשיג רמה גבוהה של שימור מבנים6 (איור משלים 1). לפיכך, ניקוי רקמות ScaleSF מאפשר הדמיה עצבית יעילה ויעילה הדורשת הדמיה תלת-ממדית רב-ממדית ברזולוציה גבוהה עם שחזור אותות מדויק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ליוקו אישידה (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על ייצור וקטור AAV ולקיסארה הושינו (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI (JP20K07231 עד K.Y.; JP21H03529 עד T.F.; JP20K07743 עד M.K.; JP21H02592 עד H.H.) ומחקר מדעי על אזור חדשני "תהודה ביו" (JP18H04743 עד H.H.). מחקר זה נתמך גם על ידי הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) (JP21dm0207112 ל- T.F. ו- H.H.), מו"פ Moonshot מסוכנות המדע והטכנולוגיה של יפן (JST) (JPMJMS2024 עד H.H.), מחקר מונחה היתוך למדע וטכנולוגיה משבשים (יער) מ- JST (JPMJFR204D עד H.H.), מענקים בסיוע ממכון המחקר למחלות זקנה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונטנדו (X2016 עד K.Y.; X2001 ל-H.H.), ופרויקט מיתוג בתי הספר הפרטיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
