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Neuroscience

मेसोस्कोपिक से माइक्रोस्कोपिक तराजू तक न्यूरोनल इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63941
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,4,5, 2,3, 6, 1,2,7
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

Summary

प्रोटोकॉल एक ऊतक समाशोधन विधि, एससीएएलईएसएफ का उपयोग करके मस्तिष्क के टुकड़े में न्यूरोनल इमेजिंग की एक विस्तृत विधि प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में मस्तिष्क ऊतक तैयारी, ऊतक स्पष्टीकरण, साफ स्लाइस की हैंडलिंग और मेसोस्कोपिक से सूक्ष्म स्तर तक न्यूरोनल संरचनाओं की कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग शामिल है।

Abstract

मस्तिष्क के ऊतकों में मेसोस्कोपिक से सूक्ष्म स्तर तक न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। तंत्रिका सर्किट से लेकर उपकोशिकीय न्यूरोनल संरचनाओं तक न्यूरोनल संरचनाओं को एससीएएलईएसएफ के साथ ऑप्टिकल रूप से साफ किए गए माउस मस्तिष्क स्लाइस में देखा जाता है। यह समाशोधन विधि एससीएएलईएस का एक संशोधित संस्करण है और ऊतक स्लाइस के लिए एक हाइड्रोफिलिक ऊतक समाशोधन विधि है जो शक्तिशाली समाशोधन क्षमता के साथ-साथ प्रतिदीप्ति संकेतों और संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण के उच्च स्तर को प्राप्त करती है। एक अनुकूलन तीन आयामी (3 डी) मुद्रित इमेजिंग कक्ष को साफ़ मस्तिष्क के ऊतकों के विश्वसनीय बढ़ते के लिए डिज़ाइन किया गया है। बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन ले जाने वाले एडेनो से जुड़े वायरस वेक्टर के साथ इंजेक्शन माउस दिमाग को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था और एक कंपन ऊतक स्लाइसर के साथ 1 मिमी मोटाई के स्लाइस में काट दिया गया था। मस्तिष्क स्लाइस समाशोधन प्रोटोकॉल का पालन करके साफ कर दिया गया था, जिसमें तीन समाधानों में अनुक्रमिक ऊष्मायन शामिल हैं, अर्थात्, एससीएएलईएस 0 समाधान, फॉस्फेट बफर खारा (-), और एससीएएलईएस 4 समाधान, कुल 10.5-14.5 घंटे के लिए। साफ़ किए गए मस्तिष्क स्लाइस इमेजिंग कक्ष पर लगाए गए थे और एससीएएलईएस 4 डी 25 (0) समाधान में भंग 1.5% एगारोज़ जेल में एम्बेडेड थे। स्लाइस का 3 डी छवि अधिग्रहण एक लंबी कामकाजी दूरी के बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। मेसोस्कोपिक न्यूरोनल इमेजिंग के साथ शुरुआत करते हुए, हम ऑप्टिकल रूप से साफ मस्तिष्क स्लाइस में डेंड्राइटिक स्पाइन और एक्सोनल बाउटन जैसे ठीक उपकोशिकीय न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने में सफल रहे। यह प्रोटोकॉल सर्किट से उपकोशिकीय घटक तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं को समझने की सुविधा प्रदान करेगा।

Introduction

ऊतक समाशोधन विधियों ने प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक और नैदानिक नमूनों की गहराई-स्वतंत्र इमेजिंग में सुधार किया है, जिससे बरकरारऊतकों 1,2 पर संरचनात्मक जानकारी के निष्कर्षण की अनुमति मिलती है। ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक भी संभावित रूप से गति दे सकती है, और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की लागत को कम कर सकती है। वर्तमान में, तीन प्रमुख समाशोधन दृष्टिकोण उपलब्ध हैं: हाइड्रोफिलिक, हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोगेल-आधारित तरीके 1,2। हाइड्रोफिलिक दृष्टिकोण प्रतिदीप्ति संकेतों और ऊतक अखंडता को संरक्षित करने में पार करते हैं और अन्य दोदृष्टिकोण3,4 की तुलना में कम विषाक्त होते हैं।

एक हाइड्रोफिलिक समाशोधन विधि, एससीएएलईएस, संरचनात्मक और आणविक अखंडता के संरक्षण के साथ-साथ शक्तिशाली समाशोधन क्षमता (समाशोधन-संरक्षण स्पेक्ट्रम) के साथ एक विशिष्ट स्थिति रखती है। पिछले अध्ययन में, हमने एससीएएलईएस6 की समाशोधन प्रक्रिया को संशोधित करके ऊतक स्लाइस (~ 1-मिमी मोटाई) के लिए एक तेजी से और आइसोमेट्रिक समाशोधन प्रोटोकॉल, एससीएएलईएसएफ विकसित किया। इस समाशोधन प्रोटोकॉल 10.5-14.5 घंटे के लिए तीन समाधान में मस्तिष्क स्लाइस के अनुक्रमिक ऊष्मायन की आवश्यकता है। विधि को एक उच्च समाशोधन-संरक्षण स्पेक्ट्रम के साथ चित्रित किया गया है, जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण (पूरक चित्रा 1) के साथ भी संगत है, जो सटीक सिग्नल पुनर्निर्माण 6 के साथ बहु-पैमाने पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन तीन आयामी (3 डी) इमेजिंग की अनुमति देताहै। इस प्रकार, एससीएएलईएसएफ विशेष रूप से मस्तिष्क में प्रभावी होना चाहिए, जहां न्यूरोनल कोशिकाएं जबरदस्त लंबाई की विपुल प्रक्रियाओं को विस्तृत करती हैं, और जानकारी प्रसारित करने और प्राप्त करने के लिए विशेष ठीक उपकोशिकीय संरचनाओं की व्यवस्था करती हैं। न्यूरोनल कोशिकाओं पर सर्किट से उपकोशिकीय स्तरों तक तराजू के साथ संरचनात्मक जानकारी निकालना मस्तिष्क कार्यों की बेहतर समझ की दिशा में काफी उपयोगी है।

यहां, हम एससीएएलईएसएफ का उपयोग करके मेसोस्कोपिक /सर्किट से सूक्ष्म /उपकोशिकीय स्तर तक तराजू के साथ न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में ऊतक तैयारी, ऊतक स्पष्टीकरण, साफ ऊतकों की हैंडलिंग, और साफ ऊतकों की कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) इमेजिंग शामिल है। हमारा प्रोटोकॉल सर्किट से उपकोशिकीय घटक तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं से पूछताछ करने पर केंद्रित है। माउस दिमाग में एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर के समाधान और स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन की तैयारी के लिए एक विस्तृतप्रक्रिया के लिए, क्रमशः मियावाकी एट अल।

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Protocol

सभी प्रयोगों को जुंटेंडो विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या 2021245, 2021246) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था और जापान की विज्ञान परिषद (2006) द्वारा पशु प्रयोगों के उचित संचालन के लिए मौलिक दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। यहां, नर सी 57 बीएल / 6 जे चूहों को एएवी वेक्टर के साथ बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) जीन और परवल्ब्यूमिन (पीवी) / मिरिस्टॉयलेशन-ईजीएफपी-कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर सी-टर्मिनल बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) ट्रांसजेनिक चूहों (पीवी-एफजीएल चूहों) 9 का उपयोग किया गया था। पीवी-एफजीएल चूहों को सी 57 बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि में बनाए रखा गया था। इस अध्ययन के संबंध में कोई सेक्स-आधारित मतभेद नहीं पाया गया।

1. ऊतक की तैयारी

  1. छिड़काव निर्धारण
    नोट: पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के संपर्क को सीमित करने के लिए एक धूआं हुड में 1.1.1 के माध्यम से चरण 1.1.1 निष्पादित करें।
    1. सोडियम पेंटोबार्बिटल (200 मिलीग्राम / किग्रा) के ओवरडोज के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा वयस्क नर चूहों (8-16 सप्ताह) को संवेदनाहारी करें। पैर की अंगुली-चुटकी वापसी और आंख-झपकी सजगता की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की पर्याप्तता की पुष्टि करें।
    2. वक्ष गुहा खोलें और सर्जिकल कैंची के साथ सही आलिंद उपांग काट लें। 20 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 23 जी सुई का उपयोग करके 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ चूहों को सुगंधित करें, इसके बाद 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) में 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 4% पीएफए का छिड़काव एक और 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके।
      सावधानी: पीएफए विषाक्त और टेराटोजेनिक है। त्वचा, आंखों और श्लेष्म झिल्ली के साथ साँस लेना या संपर्क से बचें।
    3. चिमटी के साथ खोपड़ी से मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें। मस्तिष्क के ऊतकों को 0.1 एम पीबी में 4% पीएफए युक्त 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, नमूनों को प्रकाश से बचाएं, और धीरे-धीरे 50-100 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रॉक करें।
    4. नोट: कटाई मस्तिष्क के ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 0.02% सोडियम एजाइड (एनएएन3) में कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
      सावधानी: एनएएन3 विषाक्त है। त्वचा, आंखों और श्लेष्म झिल्ली के साथ साँस लेना या संपर्क से बचें। इसे एक धुआं हुड के अंदर संभालें।
  2. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
    1. पीबीएस के 50 एमएल में अगर के 2 ग्राम जोड़कर पीबीएस में 4% अगर तैयार करें। मिश्रण को तब तक माइक्रोवेव करें जब तक कि अगर पूरी तरह से घुल न जाए। समाधान को 40-45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
      नोट: अगर का एक प्रमुख घटक अगरोपेक्टिन द्वारा प्रदान की गई चिपचिपा संपत्ति, ऊतक स्लाइस काटने में आसानी में सुधार करती है।
    2. एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में अगर समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। संदंश का उपयोग कर अगर समाधान में मस्तिष्क के ऊतकों को डुबोएं। अगर को बर्फ पर जमने दें।
    3. कुएं से एम्बेडेड मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें और एक रेजर ब्लेड के साथ अगर ट्रिम करें। सुपरग्लू के साथ वाइब्रेटोम स्नान के तल पर अगर ब्लॉक को सुरक्षित करें और बफर ट्रे में 0.1 एम पीबी डालें।
    4. इथेनॉल में भिगोए गए लिंट-फ्री टिशू पेपर का उपयोग करके एक और रेजर ब्लेड को साफ करें और ब्लेड को कंपन ऊतक स्लाइसर के ब्लेड धारक से संलग्न करें।
    5. 1.4 मिमी आयाम और 75-77 हर्ट्ज की आवृत्ति के साथ सेक्शनिंग गति को 0.14 मिमी / सेकंड पर सेट करें मस्तिष्क के ऊतकों को 1-मिमी-मोटी स्लाइस में काटें और पीबीएस युक्त 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में स्लाइस एकत्र करें।
      नोट: मस्तिष्क स्लाइस 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 0.02% एनएएन3 में कई हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. ऊतक स्पष्टीकरण

नोट: उपयोग किए गए एससीएएलईएस समाधानों की रचनाएं तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। नमूनों को पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। समाशोधन चरणों चित्रा 1 ए में दिखाया गया है।

  1. 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक कुएं में एससीएएलईएस 0 समाधान के 8 एमएल जोड़ें और प्लेट के दूसरे कुएं में एससीएएलईएस 4 समाधान के 8 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें।
  2. मस्तिष्क स्लाइस को एक स्पैटुला के साथ पूर्व-गर्म एससीएएलईएस 0 समाधान में स्थानांतरित करें और 90 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. एक स्पैटुला के साथ एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में पीबीएस (-) के 8 मिलीलीटर में पारगम्य मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरित करें और 40-60 आरपीएम पर कक्षीय शेकर में रखकर 15 मिनट के लिए धो लें। इसे दो बार दोहराएं।
  4. एक स्पैटुला के साथ एससीएएलईएस 4 समाधान के पूर्व-गर्म 8 एमएल में मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-12 घंटे के लिए 90 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करके उन्हें साफ करें। एक साफ मस्तिष्क स्लाइस चित्रा 1 में देखा जा सकता है।

3. मस्तिष्क टुकड़ा बढ़ते

नोट: एक अनुकूलन इमेजिंग कक्ष साफ मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 2) 6 के विश्वसनीय बढ़ते के लिए प्रयोग किया जाता है। कक्ष में कक्ष फ्रेम और नीचे कवरस्लिप होता है। माइक्रोस्कोप चरण एडाप्टर भी सीधे माइक्रोस्कोप चरणों (चित्रा 2 ए, बी) पर इमेजिंग चैंबर माउंट करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। चैंबर फ्रेम और माइक्रोस्कोप स्टेज एडेप्टर इन-हाउस या आउटसोर्स 3 डी-प्रिंटिंग सेवाओं का उपयोग करके 3 डी-मुद्रित किया जा सकता है। इमेजिंग चैंबर के 3 डी कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (सीएडी) डेटा फुरुता एट अल में प्रदान किएजाते हैं।

  1. कक्ष की तैयारी के लिए, एक दबाव-संवेदनशील चिपकने वाला का उपयोग करके चैंबर फ्रेम को कवरस्लिप में संलग्न करें।
  2. एक बोतल में 100 मिलीलीटर घोल में 1.5 ग्राम एगरोज जोड़कर एससीएएलईएस 4 डी 25 (0) समाधान (एससीएएलईएस 4 जेल) में 1.5% एगरोज़ तैयार करें। घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और घोल को तब तक माइक्रोवेव करें जब तक कि एगरोज पूरी तरह से भंग न हो जाए। एक बार हो जाने के बाद, समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  3. एक स्पैटुला के साथ इमेजिंग चैंबर के निचले कवरस्लिप पर साफ़ मस्तिष्क टुकड़ा माउंट करें। एक साफ लिंट-मुक्त टिशू पेपर का उपयोग करके साफ किए गए टुकड़े से अतिरिक्त समाधान को मिटा दें।
  4. इमेजिंग कक्ष को भरने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मस्तिष्क के टुकड़े पर एससीएएलईएस 4 जेल जोड़ें। संदंश के साथ शीर्ष पर एक और कवरस्लिप रखें और इस क्रम में कवरस्लिप पर लिंट-फ्री टिशू पेपर और ग्लास स्लाइड का एक टुकड़ा रखें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर के लिए इमेजिंग कक्ष स्थानांतरण। ग्लास स्लाइड पर धातु वजन रखें और उन्हें 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. इमेजिंग कक्ष से धातु वजन, ग्लास स्लाइड, लिंट-मुक्त टिशू पेपर, और कवरस्लिप निकालें, और अतिरिक्त जेल को मिटा दें (चित्रा 2 ए, बी)।
  7. एक 60 मिमी ग्लास पेट्री डिश में इमेजिंग चैंबर प्लेस और एक पोटीन की तरह दबाव संवेदनशील चिपकने वाला के साथ पकवान के लिए इमेजिंग चैंबर के रिम संलग्न करें। पेट्री डिश के लिए कई बिंदुओं पर कक्ष संलग्न करें।
  8. डिश में एससीएएलईएस 4 समाधान डालो और 40-60 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए धीरे से हिलाएं। ताजा समाधान के साथ स्थानापन्न और धीरे एक 200 μL विंदुक टिप का उपयोग कर सतह स्क्रैपिंग द्वारा जेल की सतह पर हवा के बुलबुले को हटाने। एक माइक्रोस्कोप चरण (चित्रा 2 सी) पर विसर्जित इमेजिंग कक्ष माउंट।

4. सीएलएसएम इमेजिंग

  1. 0.60 संख्यात्मक एपर्चर [एनए], डब्ल्यूडी = 2.5 मिमी) के एक लंबी कामकाजी दूरी (डब्ल्यूडी) के बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस सीएलएसएम का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण करें।
    नोट: उच्च एनए उद्देश्य लेंस उच्च विवर्तन-सीमित रिज़ॉल्यूशन प्रदान कर सकते हैं।
  2. सभी प्रासंगिक इमेजिंग उपकरण (वर्कस्टेशन, माइक्रोस्कोप, स्कैनर, लेजर और पारा लैंप) चालू करें और एक सीएलएसएम इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें।
  3. बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस के सुधार कॉलर को 1.47 पर सेट करें। एससीएएलईएस 4 समाधान में लगभग 1.47 5,7 का अपवर्तक सूचकांक (आरआई) है। आरआई बेमेल प्रेरित विपथन छवि गठन (चित्रा 3) परेशान कर सकते हैं।
  4. समाधान में उद्देश्य लेंस विसर्जित करें, और इसे धीरे-धीरे टुकड़ा तक पहुंचने दें। उद्देश्य लेंस की नोक पर फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। एपिफ्लोरेसेंस का उपयोग करके साफ किए गए ऊतकों में ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का पता लगाएं।
  5. उपयुक्त सेटिंग्स का परीक्षण करके छवि अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें।
    1. छवि अधिग्रहण के लिए बिट गहराई निर्धारित करें। छवि का डेटा आकार बिट गहराई के साथ बढ़ता है।
    2. पता लगाने तरंग दैर्ध्य सेट करें। उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के अनुसार डिटेक्टर के लिए उपयुक्त गेट समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि पता लगाने तरंग दैर्ध्य किसी भी लेजर लाइनों को कवर नहीं करता है।
    3. xy रिज़ॉल्यूशन सेट करें। बड़े प्रारूप बेहतर xy रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं, लेकिन छवियों को इकट्ठा करने में अधिक समय लगता है।
    4. स्कैन की गति सेट करें। एक धीमी स्कैन गति एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करती है। हालांकि, यह पिक्सेल निवास समय और फोटोब्लीचिंग के जोखिम को भी बढ़ाता है। उसी के अनुसार चुनें।
    5. पिनहोल आकार समायोजित करें। पिनहोल आकार ऑप्टिकल अनुभाग मोटाई को नियंत्रित करता है। एक छोटा पिनहोल आकार एक पतला ऑप्टिकल अनुभाग बनाता है, और इस प्रकार बेहतर जेड रिज़ॉल्यूशन बनाता है, लेकिन प्रतिदीप्ति संकेत को कम करता है। पिनहोल आकार को बड़ा बनाना मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत के साथ एक मोटा ऑप्टिकल अनुभाग प्रदान करता है।
    6. लेजर पावर, डिटेक्टर/एम्पलीफायर लाभ, और ऑफसेट सेट करें। धीरे-धीरे लेजर पावर और डिटेक्टर /एम्पलीफायर लाभ बढ़ाएं जब तक कि एक उपयुक्त छवि प्राप्त न हो जाए। एक उच्च लेजर शक्ति फोटोब्लीचिंग के जोखिम को वहन करती है। एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए ऑफसेट (कंट्रास्ट) को उचित रूप से समायोजित करें।
    7. आरओआई के आकार के आधार पर आवश्यक जुताई क्षेत्र निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि आरओआई की पूरी लंबाई और चौड़ाई पर कब्जा कर लिया गया है।
    8. सभी विमानों में साफ ऊतकों नेविगेट करें, और ढेर के प्रारंभ और अंत बिंदु सेट करें। वांछित जेड-रिज़ॉल्यूशन के अनुसार जेड-स्टेप आकार सेट करें।
  6. छवि अधिग्रहण सेटिंग्स से संतुष्ट होने पर छवियों को इकट्ठा करें, और कैप्चर की गई छवियों को रिकॉर्ड करें। एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें।

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Representative Results

1 मिमी मोटाई के एक माउस मस्तिष्क टुकड़ा के ऑप्टिकल समाशोधन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया था। चित्रा 1 बी समाशोधन उपचार से पहले और बाद में माउस मस्तिष्क टुकड़ा की संचरण छवियों का प्रतिनिधित्व करता है। ऊतक समाशोधन विधि ने 1 मिमी मोटी माउस मस्तिष्क टुकड़ा पारदर्शी प्रदान किया। मस्तिष्क स्लाइस के अंतिम आकार में थोड़ा विस्तार 12 घंटे (रैखिक विस्तार: 102.5% ± 1.3%) के लिए समाशोधन समाधान में इनक्यूबेशन के बाद पाया गया था। प्रतिदीप्ति और ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण पीवी-एफजीएल चूहों (चित्रा 1 सी) में प्लाज्मा झिल्ली में लक्षित ईजीएफपी अभिव्यक्ति के साथ मूल्यांकन किया गया था। इन चूहों में, सोमाटोडेन्ड्रिटिक झिल्ली-लक्षित ईजीएफपी पीवी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स9 में व्यक्त किया जाता है। सोमाटोडेंड्रिटिक क्षेत्र में प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित ईजीएफपी अभिव्यक्ति उपचार (चित्रा 1 सी) के बाद बनाए रखा गया था। इसके अतिरिक्त, पिछले ईएम अध्ययन एससीएएलईएसएफ (पूरक चित्रा 1) 6 के साथ मंजूरी दे दी मस्तिष्क के ऊतकों में अच्छी तरह से संरक्षित संरचनात्मक अखंडता से पता चलता है।

आरआई बेमेल प्रेरित विपथन छवि चमक और संकल्प (चित्रा 3) का एक ध्यान देने योग्य नुकसान का कारण बना। पीवी-एफजीएल माउस का एक 1 मिमी मोटा मस्तिष्क टुकड़ा साफ किया गया था और एक लंबे डब्ल्यूडी के बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस सीएलएसएम के तहत इमेज किया गया था पानी की स्थिति (आरआई 1.33) के लिए उद्देश्य लेंस के सुधार कॉलर के समायोजन ने कम चमक और कम विपरीत के कारण 400 μm और 800 μm की गहराई पर स्थित ईजीएफपी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के स्पष्ट दृश्य में बाधा डाली। (चित्रा 3 ए, सी)। इन न्यूरॉन्स को स्पष्ट रूप से एक ही सीएलएसएम के साथ कल्पना की गई थी, जब सुधार कॉलर को एससीएएलईएस 4 समाधान (आरआई 1.47) से मेल खाने के लिए समायोजित किया गया था; चित्रा 3 बी, डी)। एक विसर्जन तरल पदार्थ और उद्देश्य लेंस के बीच आरआई-मिलान ऑप्टिकल रूप से साफ ऊतकों में सटीक 3 डी इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

अंत में, माउस नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स का उपयोग प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। प्राथमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स (एस 1) में एएवी 2/1-सिंटेटऑफ-ईजीएफपी वेक्टर10 के साथ इंजेक्ट किया गया एक माउस मस्तिष्क 0.1 एम पीबी में 4% पीएफए के साथ तय किया गया था। 1 मिमी मोटाई के कोरोनल स्लाइस मस्तिष्क से एक कंपन ऊतक स्लाइसर के साथ तैयार किए गए थे। समाशोधन और इमेजिंग कक्ष पर बढ़ते के बाद, नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स के लिए लक्षित न्यूरोनल इमेजिंग आयोजित किया गया था (चित्रा 4)। 1 मिमी मोटी मस्तिष्क टुकड़ा में ईजीएफपी-लेबल न्यूरॉन्स का एक 3 डी पुनर्निर्माण चित्रा 4 ए में दर्शाया गया है। एक उच्च आवर्धन छवि डेंड्राइटिक रीढ़ (चित्रा 4 बी) के साथ सजाए गए व्यक्तिगत डेंड्राइटिक आर्बर दिखाती है। हमने आगे कॉन्ट्रालेटरल कॉर्टेक्स (चित्रा 4 सी) में एक्सोन टर्मिनल आर्बराइजेशन और एक्सोनल बाउटन दिखाए।

Figure 1
चित्रा 1: 1 मिमी मोटाई के माउस मस्तिष्क स्लाइस के ऑप्टिकल समाशोधन( ए) एससीएएलईएसएफ ऊतक समाशोधन के लिए अनुसूची। (बी) (बाएं) और बाद में (दाएं) 1 मिमी मोटी मस्तिष्क स्लाइस की संचरण छवियां। (सी) ऊतक समाशोधन विधि का उपयोग करके पीवी-एफजीएल माउस के सेरेब्रल कॉर्टेक्स का एक 3 डी वॉल्यूम प्रतिपादन। (डी, ई) 250 μm (D) और 750 μm (E) की गहराई पर (C) में xy छवियाँ। (एफ, जी) (डी) और (ई) में उल्लिखित आयतों का बढ़ा हुआ दृश्य। (सी-जी) में दिखाई देने वाली छवियों को प्रतिपादन प्रक्रिया से पहले विघटित किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पिया = पिया मेटर, डब्ल्यूएम = सफेद पदार्थ। स्केल बार: (बी) में 2 मिमी, (सी) में 500 μm, (डी, ई) में 200 μm, और (F, G) में 40 μm। इस आंकड़े को फुराटा एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक टुकड़ा दृश्य के लिए एक अनुकूलन योग्य 3 डी मुद्रित इमेजिंग कक्ष. (ए, बी) एक स्कीमा ड्राइंग (ए) और एक अनुकूलन योग्य 3 डी मुद्रित इमेजिंग चैंबर की तस्वीर (बी)। इमेजिंग चैंबर एक चैंबर फ्रेम, एक नीचे कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप स्टेज एडाप्टर से बना है। साफ़ ऊतक स्लाइस को नीचे कवरस्लिप पर रखा जाता है और एससीएएलईएस 4 जेल में एम्बेडेड किया जाता है। चैंबर फ्रेम, नीचे कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप चरण एडाप्टर ऊतक स्लाइस के आकार और मोटाई के अनुसार अनुकूलन योग्य हैं। (सी) इमेजिंग चैंबर के साथ एक इमेजिंग सेटअप। इमेजिंग कक्ष एक पेट्री डिश में एससीएएलईएस 4 समाधान में डूबा हुआ है और एक ईमानदार सीएलएसएम के मंच पर घुड़सवार है। इस आंकड़े को फुराटा एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक उद्देश्य लेंस और एससीएलेएस 4 समाधान के बीच एक आरआई बेमेल के कारण समझौता गहरी इमेजिंग ( ए-डी ) 400 μm (ए, बी) और 800 μm (सी, डी) की गहराई पर पीवी-एफजीएल माउस के सेरेब्रल कॉर्टेक्स की एक्सवाई छवियां। एक बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस के कॉलर का सुधार 1.33 इंच (ए, सी) और 1.47 इंच (बी, डी) में समायोजित किया जाता है। उद्देश्य लेंस के आरआई को छोड़कर छवियों को समान मापदंडों के साथ अधिग्रहित किया जाता है। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एससीएएलईएसएफ के साथ साफ़ 1 मिमी मोटी माउस मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरोनल इमेजिंग। (ए) एस 1 में ईजीएफपी-लेबल माउस नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स का 3 डी वॉल्यूम रेंडरिंग। नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स को एएवी 2/1 सिंटेटऑफ-ईजीएफपी वेक्टर के साथ लेबल किया जाता है। (बी) ईजीएफपी-लेबल वाले नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स के डेंड्राइटिक आर्बर। 39 μm से 48 μm की गहराई तक एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (MIP) छवि का प्रतिनिधित्व किया जाता है। एरोहेड्स डेंड्राइटिक स्पाइन का संकेत देते हैं। (सी) कॉन्ट्रालेटरल कॉर्टेक्स में ईजीएफपी-लेबल अक्षतंतु टर्मिनल। 481.5 μm से 513 μm की गहराई से एक MIP छवि का प्रतिनिधित्व किया जाता है। एरोहेड्स एक्सोनल बाउटन को इंगित करते हैं। (बी) और (सी) में दिखाई देने वाली छवियों को विघटित किया जाता है। स्केल सलाखों: (ए) में 300 μm और (C) में 10 μm। (सी) में बार (बी) पर भी लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: मस्तिष्क स्लाइस में अल्ट्रास्ट्रक्चर एससीएएलईएसएफ, क्यूबिक और पीएसीटी के साथ साफ हो गया। (ए-सी) माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स की ट्रांसमिशन ईएम छवियों को एससीएएलईएसएफ (ए), क्यूबिक (बी), और पीएसीटी (सी) के साथ मंजूरी दे दी गई है। माउस दिमाग 4% पीएफए के साथ तय किया जाता है जिसमें 1% ग्लूटाराल्डिहाइड होता है। अल्ट्राथिन अनुभागों को साफ मस्तिष्क स्लाइस से तैयार किया जाता है। क्यूबिक (बी) और पीएसीटी (सी) के साथ साफ किए गए मस्तिष्क स्लाइस में झिल्ली संरचनाएं गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं। एरोहेड्स पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली को इंगित करते हैं। स्केल बार: 500 एनएम। इस आंकड़े को फुराटा एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एससीएएलईएस समाधान के लिए पुनरावृत्ति
एससीएएलईएस 0 समाधान
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
डी-सोर्बिटोल 20% (डब्ल्यू /
ग्लिसरॉल 5% (डब्ल्यू /
मिथाइल-β-साइक्लोडेक्सट्रिन 1 एमएम
γ-साइक्लोडेक्सट्रिन 1 एमएम
डाइमिथाइल सल्फोक्साइड 3% (वी /
10x पीबीएस (–) 1x
एससीएएलईएस 4 समाधान
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
यूरिया 4 एम
डी-सोर्बिटोल 40% (डब्ल्यू /
ग्लिसरॉल 10% (डब्ल्यू /
ट्राइटन एक्स -100 0.2% (डब्ल्यू /
डाइमिथाइल सल्फोक्साइड 25% (v/v)
एससीएएलईएस 4 डी 25 (0) समाधान
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
यूरिया 4 एम
डी-सोर्बिटोल 40% (डब्ल्यू /
ग्लिसरॉल 10% (डब्ल्यू /
डाइमिथाइल सल्फोक्साइड 25% (v/v)

तालिका 1: तीन एससीएएलईएस समाधानों की संरचना। एससीएएलईएस 0, एससीएएलईएस 4, और एससीएएलईएस 4 डी 25 (0) समाधानों की रचनाएं सूचीबद्ध हैं। इन समाधानों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया के लिए, मियावाकी एट अलदेखें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए अत्यंत सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। बड़े पैमाने पर ऊतकों के भीतर 3 डी इमेजिंग के लिए नमूनों का समान निर्धारण अनिवार्य है। उद्देश्य लेंस, नमूना और विसर्जन द्रव में मिलान आरआई होना चाहिए। उनके बीच आरआई-बेमेल साफ़ मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 3) के भीतर ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं की अत्यधिक परेशान इमेजिंग का नेतृत्व करेगा। विसर्जन तरल पदार्थ के उद्देश्य लेंस का सुधार कॉलर समायोजन 3 डी इमेजिंग में सिग्नल, कंट्रास्ट और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को अधिकतम करने के लिए गहराई से प्रेरित गोलाकार विपथन को कम करता है। तैयार समाधानों के आरआई को एक अपवर्तकमापी का उपयोग करके मापा जा सकता है।

तकनीक का समस्या निवारण
समाधानों का लंबा भंडारण समाशोधन क्षमता को प्रभावित कर सकता है, और प्रतिदीप्ति संकेतों और संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण के लिए इसकी क्षमता। ताजा तैयार समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए। इन समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। सटीक संकेत पुनर्निर्माण के साथ प्रभावी और कुशल न्यूरोनल इमेजिंग के लिए आइसोमेट्रिकता महत्वपूर्ण है। यद्यपि नमूना आकार में मामूली विस्तार 12 घंटे (चित्रा 1 बी) के लिए इनक्यूबेशन के बाद मनाया गया था, विस्तार को 8-12 घंटे के बीच इनक्यूबेशन अवधि को कम करके नियंत्रित किया जा सकता है। अधिक सटीक 3 डी गहराई इमेजिंग के लिए, सुधार कॉलर को गहराई से प्रेरित गोलाकार विपथन के कारण किसी दिए गए विमान पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

तकनीक के संशोधन
वर्तमान अध्ययन में, हम प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए माउस मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग किया। फिर भी यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग प्राइमेट्स जैसे बड़े दिमाग वाले जानवरों के लिए भी किया जा सकता है। दरअसल, इस प्रोटोकॉल का उपयोग आम मार्मोसेट (कैलिथ्रिक्स जैकस) मस्तिष्क के ऊतकों में किया गया है, और तंत्रिका सर्किट और इसके कॉर्टिकोस्ट्रियल सर्किट के उपकोशिकीय संरचनाओं के एक साथ दृश्य में सफलरहा है 6. माइक्रोस्कोप चरण एडाप्टर सीधे6 (चित्रा 2 ए, बी) माइक्रोस्कोप चरणों पर इमेजिंग कक्ष माउंट करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। साफ़ ऊतक स्लाइस इमेजिंग कक्ष के निचले कवरस्लिप के माध्यम से एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अवलोकन योग्य हैं। पीबीएस (-) (डीएससीएएलआईएनजी) 5,11 के साथ साफ़ मस्तिष्क के ऊतकों की बहाली के बाद, हम मस्तिष्क के ऊतकों से 20-μm से 50-μm मोटाई के ऊतक वर्गों को तैयार कर सकते हैं जिन्हें एससीएएलईएसएफ (पुन: सेक्शनिंग) 6 के साथ मंजूरी दे दी गई थी। साफ ऊतकों के भीतर कब्जा कर लिया उपकोशिकीय संरचनाओं एक छोटे डब्ल्यूडी के एक उच्च एनए उद्देश्य लेंस के साथ फिर से वर्गों पर इमेज किया जा सकता है. ग्लूटाराल्डिहाइड युक्त फिक्सेटिव के साथ सुगंधित मस्तिष्क स्लाइस का समाशोधन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया है, बेहतर अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण प्रदान करता है6. एससीएएलईएसएफ अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षण का एक उच्च स्तर प्राप्त करता है जो ऑप्टिकल रूप से साफ ऊतकों6 (पूरक चित्रा 1) में ईएम विश्लेषण की अनुमति देता है। इस पद्धति की ईएम संगतता मैक्रोस्कोपिक से नैनोस्कोपिक स्तर तक तराजू के साथ इमेजिंग संरचनाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

तकनीक की सीमाएं
यहां वर्णित प्रोटोकॉल हमें 1 मिमी मोटाई के मस्तिष्क स्लाइस में सर्किट से उपकोशिकीय तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने की अनुमति देता है। हालांकि, प्रोटोकॉल में तीन सीमाएं बनी हुई हैं। पहला समाशोधन प्रोटोकॉल की समाशोधन क्षमता है। एससीएएलईएसएफ मस्तिष्क स्लाइस के लिए एक समाशोधन प्रोटोकॉल है, पूरे मस्तिष्क के लिए नहीं। यद्यपि 1 मिमी मोटाई के मस्तिष्क स्लाइस डेंड्राइटिक और स्थानीय एक्सोनल आर्बर12 का अच्छा ज्ञान प्रदान कर सकते हैं, पूरे मस्तिष्क में फैले एक्सोनल अनुमानों के बारे में जानकारी स्लाइस 13,14,15,16 में खंडित और अधूरी है। दूसरा इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम एक ऑप्टिकल रूप से साफ मस्तिष्क टुकड़ा (चित्रा 4) में डेंड्राइटिक स्पाइन और एक्सोनल बाउटन जैसे उपकोशिकीय न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने में सफल रहे। हालांकि, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य लेंस का संकल्प, 400-750 एनएम का एक्सवाई रिज़ॉल्यूशन, न्यूरोनल कोशिकाओं की अधिक ठीक संरचनाओं को हल करने के लिए पर्याप्त नहीं है। उच्च एनए उद्देश्य लेंस को देखते हुए आमतौर पर तेल-विसर्जन (आरआई 1.52) के लिए डिज़ाइन किया जाता है, समाधान (आरआई 1.47) के साथ आरआई-बेमेल इन उद्देश्य लेंस के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को रोक सकता है। तीसरा न्यूरोनल कोशिकाओं का फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग है। लेबलिंग विधि हमारी इमेजिंग तकनीक के व्यापक अनुप्रयोगों को सीमित करती है। हिस्टोकेमिकल और / या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकें जो ऊतक अखंडता को बनाए रखते हुए बड़े पैमाने पर ऊतकों को लेबल करती हैं, यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल को काफी आगे बढ़ाएंगी।

मौजूदा तरीकों और तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों के संबंध में महत्व
वर्तमान अध्ययन में, हम एससीएएलईएसएफ ऊतक समाशोधन का उपयोग करके मेसोस्कोपिक से सूक्ष्म संरचनाओं तक न्यूरोनल इमेजिंग के लिए एक विस्तार प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष उपकरणों के बिना उचित समय में सर्किट से उपकोशिकीय स्तरों तक न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करना संभव बनाता है, सर्किट से घटक तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं की समझ को सुविधाजनक बनाता है। न्यूरॉन्स जबरदस्त लंबाई की विपुल प्रक्रियाओं को विस्तृत करते हैं और जानकारी प्रसारित करने और प्राप्त करने के लिए विशेष ठीक संरचनाओं की व्यवस्था करते हैं। इस प्रकार, न्यूरोनल इमेजिंग को एक ऊतक समाशोधन विधि की आवश्यकता होती है जो शक्तिशाली समाशोधन क्षमता के साथ-साथ बड़े और छोटे पैमाने पर संरचनाओं दोनों के एक साथ दृश्य के लिए ऊतक संरक्षण के उच्च स्तर को लागू करती है। हालांकि, उच्च समाशोधन क्षमताओं के साथ चित्रित ऊतक समाशोधन विधियां आक्रामक रूप से व्यापक ऊतक स्पष्टीकरण 3,4 के लिए लिपिड और पिगमेंट को हटा देती हैं, ऊतक अखंडता 5,6,17 (पूरक चित्रा 1) से समझौता करती हैं। यह यहां उपयोग किए जाने वाले समाशोधन प्रोटोकॉल के विपरीत है जो संरचना संरक्षण6 (पूरक चित्रा 1) के उच्च स्तर को प्राप्त करता है। इसलिए, एससीएएलईएसएफ ऊतक समाशोधन प्रभावी और कुशल न्यूरोनल इमेजिंग की अनुमति देता है जिसके लिए सटीक सिग्नल पुनर्निर्माण के साथ बहु-पैमाने पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए योको इशिदा (जुंटेंडो विश्वविद्यालय) और तकनीकी सहायता के लिए किसारा होशिनो (जुंटेंडो विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेन्ही (जेपी 20 के 07231 से केवाई) द्वारा समर्थित किया गया था; जेपी 21 एच 03529 से टी.एफ.; जेपी 20के07743 से एम.के.; जेपी 21 एच 02592 से एचएच) और अभिनव क्षेत्र "अनुनाद जैव" (जेपी 18 एच 04743 से एचएच) पर वैज्ञानिक अनुसंधान। इस अध्ययन को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (एएमईडी) (जेपी 21 डीएम0207112 से टीएफ और एचएच), जापान साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी (जेएसटी) (जेपीएमजेएमएस 2024 से एचएच) से मूनशॉट आर एंड डी, जेएसटी से विघटनकारी विज्ञान और प्रौद्योगिकी (वन) के लिए फ्यूजन ओरिएंटेड रिसर्च (जेपीएमजेएफआर 204 डी से एचएच), अनुसंधान संस्थान से अनुदान सहायता द्वारा भी समर्थित किया गया था। एचएच के लिए एक्स 2001), और निजी स्कूल ब्रांडिंग परियोजना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16x multi-immersion objective lens Leica Microsystems HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar Nacalai Tesque 01028-85
Agarose TaKaRa Bio L03
Dimethyl sulfoxide Nacalai Tesque 13407-45
D-Sorbitol Nacalai Tesque 06286-55
γ-cyclodextrin Wako Pure Chemical Industries 037-10643
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Huygens Essential Scientific Volume Imaging ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris Bitplane ver. 9.0.0
Leica Application Suite X Leica Microsystems LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo Chemical Industry M1356
Paraformaldehyde Merck Millipore 1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) Nacalai Tesque 27575-31 10x PBS(–)
Sodium azide Nacalai Tesque 31233-55
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku N/A
TCS SP8 Leica Microsystems N/A
Triton X-100 Nacalai Tesque 35501-15
Urea Nacalai Tesque 35940-65
Vibrating tissue slicer Dosaka EM PRO7N

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
मेसोस्कोपिक से माइक्रोस्कोपिक तराजू तक न्यूरोनल इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि
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Yamauchi, K., Okamoto, S.,… More

Yamauchi, K., Okamoto, S., Takahashi, M., Koike, M., Furuta, T., Hioki, H. A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales. J. Vis. Exp. (183), e63941, doi:10.3791/63941 (2022).

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