Summary
상기 프로토콜은 뇌척수증-허혈성 뇌 조직의 피알 표면에 혈관 측두근 피판의 이식-모야모야 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 혈관신생 증가에 대한 접근법의 효능은 마우스에서 일시적인 중뇌 동맥 폐색 모델을 사용하여 평가됩니다.
Abstract
허혈성 뇌졸중으로 고통받는 대부분의 환자에게 효과적인 치료법이 없기 때문에 새로운 치료법 개발이 필수적입니다. 허혈성 뇌졸중 후 뇌의자가 치유 능력은 영향을받는 부위의 부적절한 혈액 공급으로 인해 제한됩니다. 뇌척근유혈관증(EMS)은 모야모야병 환자에서 혈관신생을 달성하는 신경외과 절차입니다. 그것은 허혈성 뇌 표면에 혈관 측두근 이식편을 배치하는 개두술을 포함합니다. EMS는 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 환경에서 연구 된 적이 없습니다. 이 연구를 주도하는 가설은 EMS가 근육 이식편을 둘러싼 피질 표면에서 뇌 혈관 신생을 향상 시킨다는 것입니다. 여기에 표시된 프로토콜은 절차를 설명하고 EMS 접근 방식의 타당성과 효율성을 뒷받침하는 초기 데이터를 제공합니다. 이 프로토콜에서, 60분의 일과성 중뇌 동맥 폐색 (MCAo) 후, 마우스를 MCAo 또는 MCAo+ EMS 치료로 무작위 배정하였다. EMS는 폐색 후 3-4 시간 후에 수행되었습니다. 마우스를 MCAo 또는 MCAo+ EMS 처리 후 7일 또는 21일에 희생시켰다. 측두엽 이식편 생존율은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원-테트라졸륨 환원효소 분석을 사용하여 측정하였다. 마우스 혈관신생 어레이는 혈관신생 및 신경조절 단백질 발현을 정량화하였다. 면역 조직 화학은 뇌 피질과의 이식 결합 및 혈관 밀도의 변화를 시각화하는 데 사용되었습니다. 여기의 예비 데이터는 이식 된 근육이 EMS 후 21 일 동안 생존 할 수 있음을 시사합니다. 면역염색은 성공적인 이식편 이식 및 근육 이식편 근처의 혈관 밀도 증가를 나타내어 혈관신생 증가를 나타냅니다. 데이터에 따르면 EMS는 뇌졸중 후 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)를 증가시키고 오스테오폰틴 수치를 감소시킵니다. 또한 뇌졸중 후 EMS는 사망률을 증가시키지 않아 프로토콜이 안전하고 신뢰할 수 있음을 시사합니다. 이 새로운 절차는 효과적이고 내약성이 좋으며 급성 허혈성 뇌졸중 후 향상된 혈관 신생을위한 새로운 중재에 대한 정보를 제공 할 가능성이 있습니다.
Introduction
허혈성 뇌졸중은 치명적인 만성 후유증을 동반한 급성 신경혈관 손상입니다. 미국에서 연간 650,000명인 뇌졸중 생존자의 대부분은 영구적인 기능 장애로 고통받고있습니다1. 사용 가능한 치료법 중 어느 것도 허혈성 뇌졸중의 급성기 이후에 신경 보호 및 기능 회복을 부여하지 않습니다. 급성 허혈성 뇌졸중 후 직접 및 부수적 혈액 공급이 모두 감소하여 뇌 세포와 네트워크의 기능 장애를 유발하여 갑작스러운 신경 학적 결손을 초래합니다 2,3. 허혈성 부위로의 혈액 공급 회복은 뇌졸중 치료의 최우선 목표입니다. 따라서, 허혈성 영역에서의 혈액 공급을 촉진하기 위해 혈관 신생을 향상시키는 것은 유망한 치료 접근법이다; 그러나, 에리스로포이에틴, 스타틴 및 성장 인자를 포함하는 뇌졸중 후 혈관신생을 촉진하기 위해 이전에 연구된 방법은 허용할 수 없는 수준의 독성 또는번역가능성에 의해 제한되었다4.
뇌척근유막증(EMS)은 종종 뇌졸중으로 이어지는 좁아진 두개골 동맥의 상태인 모야모야병을 앓고 있는 인간의 뇌 혈관 신생을 향상시키는 수술 절차입니다. EMS는 두개골에서 환자의 측두근의 혈관 부분을 부분적으로 분리 한 다음 개두술과 근육을 영향을받는 피질에 이식하는 것을 포함합니다. 이 절차는 내약성이 뛰어나고 뇌 혈관 신생을 유도하여 모야 모야 질환 환자의 허혈성 뇌졸중 위험을 줄입니다 5,6. 따라서이 절차는 이러한 환자에게 주로 예방 역할을합니다. 이 절차에 의해 야기 된 혈관 신생은 또한 허혈성 뇌졸중의 설정에서 신경 혈관 보호 및 회복을 촉진하는 역할을 할 수 있습니다. 이 보고서는 EMS로 인한 혈관 신생이 뇌 허혈에 대한 이해와 치료 옵션을 확장 할 가능성이 있다는 가설을지지합니다.
EMS 외에도 혈관 신생을 개선하기위한 몇 가지 약리학 적 및 외과 적 접근법이 있지만 몇 가지 한계가 있습니다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 투여와 같은 약리학 적 접근법은 종양 조직 7,8에서 발견되는 것과 유사하고 임상 시험9에서 유익한 효과가 없는 혼란스럽고 무질서하며 누출되고 원시 혈관 신경총의 형성을 포함하여 몇 가지 한계로 인해 불충분하거나 심지어 해로운 것으로 밝혀졌습니다.
외과적 접근법은 표재성 측두동맥-중대뇌 동맥 문합과 같은 직접 문합, 뇌-듀로 동맥-유혈관증(EDAS)과 같은 간접 문합, 뇌척근유막증(EMS), 및 직접 및 간접 문합(10)의 조합을 포함한다. 이 모든 절차는 EMS를 제외하고 작은 동물에서 기술적으로 매우 어렵고 까다 롭습니다. 다른 절차에는 복잡한 혈관 문합이 필요하지만 EMS에는 비교적 간단한 근육 이식이 필요합니다. 또한, 측두근과 피질의 근접성은 이식에 더 먼 근육이 사용되는 경우 필요한 것처럼 혈액 공급에서 완전히 절제되거나 분리 될 필요가 없기 때문에 이식을위한 자연스러운 선택입니다.
EMS는 쥐 7,11의 만성 대뇌 저관류 모델에서 연구되었습니다. 그러나, 측두근 이식편을 이용한 EMS는 설치류의 급성 허혈성 뇌졸중에서 연구된 적이 없다. 여기에서는 중뇌 동맥 폐색 모델 (MCAo)을 통한 허혈성 뇌졸중 후 마우스에서 EMS의 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 원고는 MCAo 이후 마우스에서 EMS에 대한이 새로운 접근법에 대한 방법 및 초기 데이터에 대한 설명으로 사용됩니다.
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Protocol
모든 실험은 UConn Health의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 미국 지침에 따라 수행되었습니다. 다음 프로토콜은 설치류의 모든 종 또는 균주에서 작동해야합니다. 여기에서, 8 내지 12주령, 연령 및 체중 매칭 C57BL/6 야생형 수컷 마우스를 사용하였다. 마우스는 표준 차우 식단 과 물을 먹였습니다. 표준 하우징 조건은 72.3 시간 명암 주기로 30 ° F 및 70 % -12 % 상대 습도로 유지되었습니다.
1. 수술 전 준비
- 수술 전에 오토클레이빙으로 모든 기구를 소독하십시오. 작동 표면을 70 % 에탄올로 살균하고 전기 가열 패드로 작동 표면을 37 ° C로 따뜻하게합니다.
- 유도 챔버를 사용하여 유도를 위해 4%-5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 수술이 끝날 때까지 유지 보수를 위해 코 콘을 통해 1.5 % -2.0 % 이소 플루 란을 전달합니다. 수술 전에 단단한 뒷발 꼬집음에 대한 반응의 부족과 자세 반응의 상실 및 올바른 반사를 평가하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오.
- 마우스를 작동 표면의 왼쪽에 놓고 눈 연고를 바르면 두 눈을 보호합니다.
- 전기 클리퍼로 수술 부위(즉, 눈과 귀 사이의 오른쪽 측면 두개골) 위로 머리카락을 면도합니다. 수술 부위 중앙에서 바깥쪽으로 동심원으로 수술 부위를 청소하고 70 % 에탄올과 포비돈 용액을 사용하여이 단계를 2 배 반복하십시오.
참고: 수술 부위가 눈에 가깝기 때문에 수술 부위 주변 부위를 150% 제거하면 눈에 대한 자극이나 우발적인 부상을 피할 수 없습니다. - 수술 부위에 수술 전 진통제로 0.25 % 부피 바카 인 (최대 8mg / kg 체중)을 피하 주사로 1 회 투여하십시오.
- 수술용 현미경을 4배 배율로 설정합니다. 현미경은 모든 수술 단계에 사용됩니다.
2. 수술 절차
참고: 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜을 위해, 3마리의 마우스를 가짜 그룹에, 3마리의 마우스를 EMS 단독으로, 12마리의 마우스를 MCAo에 대해, 및 23마리의 마우스를 MCAo+ EMS 그룹에 할당하였다.
- MCAo 수술
참고 : MCAo는 우리와 다른 사람들12,13,14에 의해 설명 된 바와 같이 설치류에서 허혈성 뇌졸중의 잘 특성화 된 모델입니다. 수술 단계는 여기에 간략하게 설명되어 있습니다. 국소 일과성 뇌 허혈은 이소플루란 마취 하에 60분 우측 MCAo에 의해 유도되었고, 이어서 7일 또는 21일 동안 재관류되었다.- 외경동맥 그루터기를 통해 내경동맥 분기점에서 10-11mm 길이의 6.0mm 실리콘 고무 코팅 모노필라멘트를 전진시켜 정중선 복부 경부 절개 후 편측적 오른쪽 MCAo를 만듭니다. 가짜 마우스에서는 봉합사가 내 경동맥으로 전진하는 것을 제외하고는 동일한 수술을 수행하십시오.
- 온도 제어 시스템을 사용하여 직장 온도를 측정하고 자동 가열 패드로 수술 중 온도를 ~ 37 ° C로 유지합니다.
- 레이저 도플러 유량 측정을 사용하여 봉합사 삽입 전에 도플러 프로브를 측면 두개골(MCA 영역에 해당)에 대고 값8을 기록하여 뇌 혈류를 측정합니다. 기준 뇌 혈류의 15 %까지 폐색 감소를 확인하려면 봉합이 진행된 후 동일한 절차를 사용하십시오. 재관류를 확인하려면 봉합사를 제거한 후 동일한 절차를 사용하십시오.
- 동물은 뇌졸중 후 양육 결핍이 있으므로 만성 종점에 대한 적절한 영양을 보장하기 위해 희생 될 때까지 및 / 또는 수술 후 1 주일까지 모든 동물에게 젖은 매쉬를 먹이십시오.
- 응급의료외과
- MCAo의 60분 후, 마우스를 MCAo 전용 또는 MCAo + EMS 그룹으로 무작위 배정한다. MCAo (MCAo + EMS 그룹) 후 EMS 4 시간 또는 일부 실험 (EMS 전용 그룹)에 대한 가짜 수술을 수행합니다. 수술 전에 새로운 멸균 수술 장갑으로 교체하십시오.
참고: 마우스는 MCAo 60분 후에 마취에서 회복되었고 EMS 수술 전에 다시 마취되었습니다. - EMS (MCAo + EMS 또는 EMS 전용 그룹)를받는 그룹의 경우 가위로 10-15mm 피부 절개를하여 1-2mm 주둥이에서 오른쪽 귀까지 1-2mm 꼬리까지 연장합니다.
알림: 아래의 측두근에 우발적 인 손상을 방지하기 위해 멸균 가위를 사용했습니다. - 클램프를 사용하여 피부 플랩을 수축시키고 측두근과 두개골을 시각적으로 식별합니다.
- 퍼짐 기술로 가위를 사용하여 두개골에서 측두근을 무뚝뚝하게 해부하십시오. 복부 반사를 촉진하기 위해 근육의 꼬리 경계를 따라 복부로 향하는 2-3mm 근절개술을 수행하십시오.
- 마이크로 드릴을 사용하여 반사된 측두근 아래의 두개골에서 직경 ~5mm의 개두술을 시행합니다.
- 핀셋으로 경막을 제거하여 뇌의 표면이 노출됩니다. 우발적 인 뇌 손상을 방지하기 위해 각별히주의하십시오.
- 측두근의 등쪽 경계를 6-0 개의 모노 크릴 필라멘트로 등쪽 피부 플랩의 피하 조직에 봉합하여 노출 된 대뇌 피질과 같은 높이로 만듭니다.
- 6-0 모노 필라멘트 봉합사로 피부 절개를 닫습니다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 마우스를 하우징 시설로 되돌립니다.
- MCAo의 60분 후, 마우스를 MCAo 전용 또는 MCAo + EMS 그룹으로 무작위 배정한다. MCAo (MCAo + EMS 그룹) 후 EMS 4 시간 또는 일부 실험 (EMS 전용 그룹)에 대한 가짜 수술을 수행합니다. 수술 전에 새로운 멸균 수술 장갑으로 교체하십시오.
3. 수술 후 고려 사항
- 마우스의 질병 및 수술 부위의 감염 여부를 매일 모니터링하십시오. 수분 공급을 지원하기 위해 매일 피하 생리식염수(체중 기준 1% 부피)를 투여하십시오.
- 수술 후 7 일까지 심한 탈수 (체중 감소 >20 %)를 모니터링하십시오. 체중 감소의 경우 체중에 대해 1 부피% 부피%의 피하 정상 생리 식염수를 추가로 투여>.
- 특별한 고려 사항 없이 주사, 생리학적 모니터링 및 기타 검사를 진행하십시오.
참고: 이 절차에서는 사내 기관 동물 관리 및 사용 위원회15,16,17,18과 협의하여 뇌졸중 결과 또는 경색 크기에 대한 이러한 약제의 알려진 영향으로 인해 수술 후 치료를 위한 아편유사제 또는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)의 사용을 피했습니다. 그러나 수술 후 진통제의 사용은 다른 모델과의 EMS 수술에 적극 권장됩니다. 이에 대해서는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 문의하십시오.
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Representative Results
총 41마리의 마우스를 본 연구에 사용하였다. MCAo에서 1마리, MCAo+EMS에서 2마리, 총 38마리의 마우스가 사망한 후 나타낸 결과를 얻기 위해 사용되었습니다.
통계
각 실험의 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유의성은 두 그룹을 비교하기 위해 짝을 이루지 않은 학생의 t-검정 또는 두 개 이상의 그룹에 대한 일원 분산 분석을 사용하여 결정되었으며, 다중 비교를 수정하기 위한 Newman-Keuls 사후 검정을 사용했습니다.
니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (환원) - 테트라 졸륨 환원 효소 (NADH-TR) 염색
이 염색은 Turoczi et al.19에서와 같이 이식 된 근육의 장기적인 생존 가능성을 평가하기 위해 수행되었습니다. 간략하게, 희생시에, 이식 된 근육 플랩을 조심스럽게 절제하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 30 분 동안 고정하고, -80 °C의 최적 절단 온도 (OCT) 배지에서 동결 보존했다. 측두근 조직의 여러 12μm 두께의 냉동 절개를 NADH-TR 효소-조직화학 반응에 대해 염색했습니다. 슬라이드를 0.05M 트리스 완충액(pH 7.6) 중 니트로블루 테트라졸륨(1.8mg/dL) 및 NADH(15mg/dL) 용액에서 37°C에서 30분 동안 배양하였다. 미사용 테트라졸륨 시약은 아세톤의 농도를 증가시킨 후 감소시키는 것을 사용하여 제거하였다. NADH- 테트라 졸륨 염색 근육의 정량적 평가는 40x 배율로 촬영 한 근육 이미지에서 수행되었습니다.
면역 염색 연구
면역 염색은 근육과 피질20,21의 교차점에서 피질 및 혈관 밀도와의 근육 이식 결합을 시각화하는 데 사용되었습니다. 뇌 조직과의 근육 결합을 시각화하기 위해 EMS 수술을받은 마우스를 여기에 사용했습니다. 각각의 시점이 끝날 때, 마우스를 아베르틴 주사 (50 mg / kg 체중)로 마취 한 후, 5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유하는 1x PBS로 관류하고 4 % 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 두개골은 뇌 피질에서 측두근 (TM) 이식편이 우발적으로 분리되는 것을 방지하기 위해 조심스럽게 절단되었습니다. 그런 다음 뇌 피질 위의 TM 이식편을 나머지 측두근에서 분리했습니다. 뇌를 조심스럽게 제거하고 밤새 4% 파라포름알데히드로 사후 고정했습니다. 그런 다음 고정 된 뇌를 1x PBS에서 30 % 슈크로스로 탈수시켜 뇌가 바이알의 바닥으로 가라 앉을 때까지 (약 1-3 일) 탈수시켰다. 30 μm 크기의 조직 절편을 동결 마이크로톰으로 절단하고 슬라이드에 장착하였다.
동측 뇌 피질에서 혈관의 면역염색을 위해, MCAo 및 MCAo+ EMS 마우스를 위와 같이 희생, 관류, 고정 및 처리하였다. 30 μm 크기의 뇌 조각을 동결 마이크로톰에서 절단하고 유리면에 장착했습니다. 항원 검색은 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 수행하고, 절편을 차단 완충액으로 인큐베이션한 후, 1차 항체, 항-알파 골격근 액틴 1:200 및 Lectin-Dy59421,22로 밤새 인큐베이션하였다. 마우스 당 3 개의 관상 뇌 절편 (n = 5 마우스 / 그룹, 총 = 15 개 절편)을 브레그마로부터 0.45mm에서 0.98mm 사이에서 채취하고, 염색하고, 허혈성 코어와 반음 영역의 교차점에서 20x 배율로 정량화하기 위해 시각화했다. 맹검 관찰자는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 뇌 실질에서 렉틴 양성 혈관 밀도를 정량화했습니다.
근육 이식편은 EMS 후 21 일에 생존 할 수 있습니다.
이 수술의 성공을위한 한 가지 전제 조건은 이식 된 측두근의 장기적인 생존 가능성입니다. TM 이식편은 이식된 근육 대 대조군 근육에서 수술 후 7일에 근육 세포의 일시적인 손상을 보였다(71.32% 근육 세포 생존율 ± 16.64% 대 97.19% ± 3.81%). 그러나 이식 된 근육과 대조 근육의 차이는 사라지고 수술 후 21 일 동안 근육이 완전히 회복되었습니다 (98.22 % ± 3.965 대 96.87 % ± 2.27 %; 그림 2A).
근육 이식편은 뇌 조직과 느슨한 결합을 만듭니다.
측두근을 뇌 피질 표면에 성공적으로 이식하는 것이이 모델의 성공을위한 가장 중요한 요구 사항입니다. EMS + MCAo 및 EMS 전용 모델 모두에서 측두근 이식편은 EMS 후 21 일 동안 피질 표면에 부착되어 성공적인 수술, 이식 이식 및 접합을 시사합니다 (그림 1B 및 그림 2B).
EMS 후 주변 피질의 혈관 밀도 증가
급성 뇌졸중은 뇌 혈류의 급성 감소, 측부 혈관의 모집 장애, 비정상적인 혈관 발아 및 기능 장애 혈관 신생으로 이어져 뇌졸중 결과를 악화시킵니다23. EMS는 뇌졸중 후 주변 피질의 혈관 표면적과 통합 밀도를 크게 증가시킵니다 (p < 0.05 대 MCAo 전용; 그림 3).
혈관신생 및 신경조절 단백질 분석
마우스 혈관신생 어레이를 사용하여 제조자의 지시 24에 따라 MCAo-단독 대 MCAo+ EMS 마우스에서 MCAo 후 7일 및21일 후에 혈관신생 및 신경조절 단백질의 발현을 비교하였다. ImageJ 소프트웨어는 단백질 도트 블롯의 각 데이터 포인트에 대한 픽셀 밀도를 정량화하는 데 사용되었습니다. 데이터는 각 블롯에 대한 표준물질의 평균 밀도에 대한 분석된 각 단백질의 밀도의 비율로서 기록되었다.
섬유아세포 성장 인자(FGF)-산성은 상향 조절되고 오스테오폰틴은 EMS 후 하향 조절됩니다.
단백질 어레이 결과는 강력한 혈관신생 인자인 FGF 산성(0.677 ± 0.007 대 0.585 ± 0.014, p=0.045)의 단백질 수준이 유의하게 증가하고, 뇌졸중 후 21일 후 MCAo+ EMS 그룹에서 염증 상태(0.692 ± 0.007 대 0.758 ± 0.014, p=0.048)에서 발현되는 다기능 분자인 오스테오폰틴 수치의 감소를 보여 혈관신생 및 신경보호가 개선되었음을 시사합니다(그림 4A).
뇌졸중 후 EMS의 사망률 결과
MCAo와 EMS는 모두 마우스에서 일부 사망률을 유발할 수있는 침습적 수술 기술입니다. 이 실험에서, MCAo 수술 후 21일 후에 마우스에서 10%-11%의 사망률이 있었는데, 이는 MCAo14의 60분을 투여받은 마우스에 대해 허용된 사망률이다. MCAo 후 마우스에서 EMS를 수행해도 사망률이 증가하지 않았으며 (그림 4B) MCAo 후에도 EMS 수술의 내성을 시사합니다.
그림 1. 중뇌동맥폐색(MCAo) 후 단계적 EMS 절차: (A) 1단계. 오른쪽 중뇌 동맥 부위에 피부 절개가 이루어집니다. 피부와 피하 조직이 반사되어 두개골과 측두근이 노출됩니다. 2 단계. 측두근은 두개골에서 해부되어 복부로 반사됩니다. 3 단계. 개두술이 시행되고 (4-5 mm) 경막이 부드럽게 제거됩니다. 4 단계. 측두근은 노출 된 피질을 덮기 위해 뇌 표면에 직접 배치됩니다. 5 단계. 측두근의 등쪽 가장자리는 뇌 표면과 같은 높이의 등 피부 플랩의 피하 조직에 봉합됩니다. 6 단계. 절개가 닫히고 마우스가 마취에서 제거되어 케이지로 돌아갑니다. 그림의이 부분은25에서 수정되었습니다. (B) MCAo 유발 뇌졸중의 뇌척근유강증(EMS) 치료에 대한 개념적 개략도. 약어 : FGF = 섬유 아세포 성장 인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 면역 염색 연구. (A) 측두근 이식편은 생존력을 유지합니다. 허혈성 피질 조직의 측두근 이식편 (EMS)은 높은 생존력을 유지합니다. (왼쪽) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(환원)-테트라졸륨 환원효소-대조군(반대쪽 순진한 근육) 및 이식된 근육에서 염색된 근육 조직 세포의 대표 이미지(중뇌 동맥 폐색(MCAo) + 뇌척근유혈관증(EMS) 수술 후 7일째. 검은색 화살표()는 손상된 세포를 나타냅니다. (오른쪽) 살아있는 / 죽은 근육 세포의 정량화. EMS 후 7 일에 근육 세포는 21 일에 완전히 회복 된 약간의 경미한 손상 (p < 0.1, t- 테스트)을 보여줍니다. (n = 5 마우스/시점 = 이 그룹의 총 10 마우스) 데이터는 평균 ± S.D. 스케일 바 = 20 μm입니다. (B) EMS 수술 후 21 일 동안 이식 된 측두근과 뇌 피질의 결합. EMS 조직은 항-알파 골격근 액틴 (녹색) 및 Lectin-Dy594 (적색; 혈관 마커) 항체 (n=3 마우스)로 염색되었다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌척근유막증(EMS) 수술은 뇌졸중 후 21일 후에 허혈성 병변의 혈관 밀도를 증가시킵니다. (A) (왼쪽) 중뇌동맥폐색(MCAo) 또는 (오른쪽) MCAo+ EMS를 시행하고 내피세포의 기저막에 있는 당단백질에 결합하는 L. esculentum (토마토) Lectin-Dy594로 염색한 마우스의 관상 뇌 절편의 대표 이미지. 그래프는 정량화 된 영역입니다. MCAo+ EMS 마우스는 파라미터, 즉 혈관 분획 면적 (B) 및 통합 밀도 (C)를 사용하여 더 높은 내피 네트워크를 나타내었다. **p < 0.01(비쌍체 t-검정)인 반면, MCAo 단독 마우스는 허혈성 병변(점선)에 가까운 손상을 보였다. N = 5 마우스 / 그룹 = 총 10 마우스. 데이터는 평균± S.D. 스케일 바 = 100 μm입니다. 약어: 콘트라 = 반대쪽; 입시 = 동측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뇌척근유혈관증은 뇌졸중 후 혈관신생 단백질을 조절합니다. (A) 마우스 혈관신생 어레이(ARY015)를 사용하여 중뇌동맥폐색 후 53개의 마우스 혈관신생 관련 단백질(MCAo) 및 MCAo+ EMS(MCAo 후 21일차)의 상대적 수준을 동시에 평가했습니다. 정량 분석에 따르면 EMS 수술은 뇌졸중 후 오스테오폰틴을 유의하게 감소시키고 섬유아세포 성장 인자(FGF)-산성 단백질(*p < 0.05 또는 **p < 0.01)을 동측 MCAo로 증가시켰습니다. 데이터는 S.D.± 평균입니다. n = 3 마우스 / 그룹 / 시점 = 총 15 마우스. (B) EMS는 뇌졸중 후 사망률을 증가시키지 않았다 (MCAo). 카플란 마이어 생존 곡선은 EMS + MCAO가 MCAO 단독에 비해 뇌졸중 후 사망률을 변화시키지 않았 음을 보여줍니다 (p = 0.54). EMS의 경우 n = 3; MCAo n = 11의 경우; MCAo + EMS n = 21의 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 MCAo-유도 뇌졸중의 마우스 모델에서 성공적인 EMS 절차를 설명한다. 데이터는 이식 된 조직이 생존 가능하고 EMS 수술 후에도 오랫동안 뇌 피질과 결합을 형성 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 발견은 뇌졸중 부위에서 풍부한 혈관 영양 환경을 점진적으로 개발하기 위해 대뇌 근육 이식편을 사용하는 근거를 뒷받침합니다. EMS는 동일한 환경에서 경색 된 뇌 조직을 잠재적으로 복구하기위한 유망한 치료법입니다.
프로토콜의 중요한 단계에는 2.2.4단계가 포함됩니다: 이 단계는 TM에 피할 수 없는 외상을 유발하여 피질과 결합하고 영양 인자를 방출하는 능력을 감소시킬 수 있습니다. 초월명상 외상을 가능한 한 제한하도록 주의하십시오. 조직 외상을 줄이기위한 대안적인 전략은 등쪽 경계에서만 두개골에서 TM을 무뚝뚝하게 해부하고 근절개술을 포기하는 것입니다. 이 경우 TM은 (완전히 반사되지 않고) 두개골에서 들어 올려지고 근육 아래의 개두술 드릴로 개두술이 수행됩니다. 이것은 이 단계를 수행하는 데 사용할 수 있는 공간의 양을 줄이지만 다시 초월명상 외상을 줄일 수 있습니다. 또한, 2.2.5 단계와 2.2.6 단계에서 개두술 및 경막 조작 중 기저 뇌 피질의 손상을 방지하기 위해 극도의주의와 연습이 필요합니다.
이 EMS 모델은 잘 정립 된 MCAo 모델의 자연스러운 부속물입니다. MCAo 모델은 인간 환자에서 흔히 볼 수 있는 허혈 및 혈관 네트워크 손상의 병태생리학을 면밀히 시뮬레이션하기 때문에, MCAo+ EMS 모델은 인간에 대한 높은 수준의 번역성을 가질 가능성이 높다. 여기에 제시된 EMS 모델은자가 조직에만 의존하는 전임상 환경에서 허혈성 뇌졸중에 대해 연구 된 최초의 치료 적 개입입니다. 더욱이, 초월명상 이식편은 유기적이고 자가 이식편이기 때문에, 다양한 시점에서 영양 인자의 방출을 최적 수준으로 조절하는 역할을 하는 인접한 손상된 뇌와의 파라크린 신호 상호작용을 나타낼 수 있다.
뇌졸중은 전 혈관 신생 환경을 조성하고 혈관 신생 자체를 자극하는 반면26, 내재적 뇌졸중 후 반응은 혈관 신생 인자의 임계 이하 수준으로 인해 손상된 부위의 혈관 공급을 개선하기에 충분하지 않습니다. 여기서 EMS는 뇌졸중 단독 동물에 비해 FGF 산성 단백질 발현을 더욱 향상시켰습니다. 이 단백질은 다른 성장 인자와 함께 신생 혈관을 간접적으로 조절합니다. FGF 산성은 또한 신경 영양 인자로 작용하여 신경 보호 및 신경 발생을 촉진합니다27,28. FGF- 산성의 신경 보호 효과 중 일부는 AKT 및 MAPK / EPK 경로29의 활성화에 의해 매개된다. FGF 이외에, 단백질 오스테오폰틴의 발현도 감소하였다. Osteopontin은 다른 기능 중에서도 여러 신경 병리학 및 조직 리모델링 과정에서 그 역할로 점점 더 인식되고 있는 전염증성, 다방성 사이토카인입니다. 뇌졸중에서 오스테오폰틴의 역할은 여전히 불확실합니다30. 그러나 인간을 대상으로 한 최근 연구에서는 오스테오폰틴을 뇌졸중 후 좋지 않은 예후 인자로 지적합니다. 뇌졸중 후 혈청 오스테오폰틴 수치의 감소는 뇌졸중31이 있는 인간 환자에서 유리한 결과(수정된 Rankin 척도 점수 < 90일에 2)를 예측하는 것으로 나타났습니다. 또 다른 연구에서는 뇌졸중32 후 인간 환자의 더 높은 수준의 혈장 오스테오폰틴과 사망 및 장애 결과 사이에 용량 의존적 관계를 보여주었습니다. 이러한 임상 연구에 따라 여기의 데이터는 EMS 후 오스테오폰틴 감소가 항염증 환경을 촉진하여 신혈관 형성을 증가시킬 수 있음을 시사합니다. 전반적으로, FGF 산성 및 오스테오폰틴의 차별적 발현은 이 마우스 모델에서 EMS에 따른 혈관신생을 조절하는 메카니즘을 가리키며, 혈관신생 이외에 신경보호 및 신경재생을 가져올 수 있는 시술의 가능성을 증가시킨다.
이 절차에는 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 레이저 도플러 또는 레이저 스페클 유량계의 일반적으로 사용되는 절차는 피질 표면의 실제 혈액 측정을 방해하는 피질 상단의 측두근의 존재에 의해 영향을 받기 때문에 혈관 밀도 증가로 인한 뇌 흐름을 측정하는 것은 이 절차에서 어렵습니다. 따라서이 절차는 실시간 유량 측정이 필요한 경우 더 정교하지만 거의 사용할 수없는 작은 설치류 MRI 스캔이 필요할 수 있습니다. 그러나 혈관 밀도 측정의 사용은 데이터에 의해 제안 된대로 혈관 신생을 개선하는 EMS 절차의 성공을 간접적으로 지원합니다. 또 다른 한계는 MCAo 상단에 EMS 개입의 침습적 특성이며, 그 자체가 침습적 절차입니다. 이 연구에서 MCAo에 비해 EMS로 인한 사망률은 증가하지 않았지만 반 두개 절제술에 대한 요구 사항은 모든 유형의 뇌졸중에 대한 향후 번역 가능성을 제한 할 수 있습니다. 그러나 임상 실습에서 큰 허혈성 뇌졸중 환자의 >10 %는 증가 된 두개 내압을 관리하기 위해 반 두개 절제술이 필요합니다23,이 EMS 모델은 특히이 뇌졸중 환자의이 하위 그룹에 대해 번역 값을 가질 수 있습니다. 마지막으로, EMS의 수행을위한 MCAo 후 4 시간의 시점은 대부분의 인간 환자에 대한 rT-PA의 표준 치료 창 내에 속하도록 선택되었지만, 향후 연구에서는 EMS에 대한 치료 창을 평가하기 위해 이후 시점을 사용할 것입니다.
전반적으로, EMS 모델은 허혈성 뇌졸중 후 혈관신생을 유도하기 위한 내약성이 우수한 옵션을 제공하며, 잠재적인 임상 번역 외에도 뇌졸중 및 혈관신생의 병태생리학을 조사하는 향후 연구에 사용될 수 있다.
여기에 설명 된 EMS 모델은 전임상 연구를위한 뇌 혈관 신생을 달성하는 안전한 방법을 제공하여 종종 원치 않는 부작용이나 통제되지 않은 혈관 신생을 유발하는 약리학 적 개입의 필요성을 제거합니다. 큰 허혈성 뇌졸중을 앓고있는 많은 환자들은 증가하는 두개 내압을 관리하기 위해 임상 과정에서 반 두개 절제술이 필요합니다. 근육 이식을 위한 마우스의 반두개 절제술도 포함하는 이 EMS 절차는 허혈성 뇌졸중에서 EMS의 번역 적용을 위한 전임상 개념 증명을 제공할 수 있습니다. 따라서 이 모델은 허혈성 뇌졸중 후 신경혈관 회복에 대한 지식을 확장하고 뇌졸중 생존자를 위한 치료제에서 시급히 필요한 혁신의 개발을 촉진할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Research Excellence Program-UConn Health (Ketan R Bulsara 및 Rajkumar Verma)와 UConn Health start-up (Rajkumar Verma)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
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