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Neuroscience

Un modello per il trattamento dell'encefalomiosinangiosi dopo ictus indotto da occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Il protocollo mira a fornire metodi per l'encefalomiosinangiosi - innesto di un lembo muscolare temporale vascolare sulla superficie piale del tessuto cerebrale ischemico - per il trattamento dell'ictus ischemico acuto non moyamoya. L'efficacia dell'approccio nell'aumentare l'angiogenesi viene valutata utilizzando un modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi.

Abstract

Non esiste un trattamento efficace disponibile per la maggior parte dei pazienti affetti da ictus ischemico, rendendo imperativo lo sviluppo di nuove terapie. La capacità del cervello di auto-guarire dopo l'ictus ischemico è limitata da un inadeguato apporto di sangue nell'area colpita. L'encefalomiosinangiosi (EMS) è una procedura neurochirurgica che raggiunge l'angiogenesi nei pazienti con malattia di moyamoya. Si tratta di craniotomia con posizionamento di un innesto muscolare temporale vascolare sulla superficie ischemica del cervello. L'EMS non è mai stato studiato nel contesto dell'ictus ischemico acuto nei topi. L'ipotesi alla base di questo studio è che l'EMS migliora l'angiogenesi cerebrale sulla superficie corticale che circonda l'innesto muscolare. Il protocollo qui illustrato descrive la procedura e fornisce i dati iniziali a supporto della fattibilità e dell'efficacia dell'approccio EMS. In questo protocollo, dopo 60 minuti di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (MCAo), i topi sono stati randomizzati al trattamento MCAo o MCAo + EMS. L'EMS è stato eseguito 3-4 ore dopo l'occlusione. I topi sono stati sacrificati 7 o 21 giorni dopo il trattamento MCAo o MCAo + EMS. La vitalità dell'innesto temporale è stata misurata utilizzando il saggio della nicotinammide adenina dinucleotide ridotto-tetrazolium reduttasi. Un array di angiogenesi murina ha quantificato l'espressione proteica angiogenica e neuromodulante. L'immunoistochimica è stata utilizzata per visualizzare il legame del trapianto con la corteccia cerebrale e il cambiamento nella densità dei vasi. I dati preliminari qui suggeriscono che il muscolo innestato è rimasto vitale 21 giorni dopo l'EMS. L'immunocolorazione ha mostrato un impianto di innesto riuscito e un aumento della densità dei vasi vicino all'innesto muscolare, indicando un aumento dell'angiogenesi. I dati mostrano che l'EMS aumenta il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) e diminuisce i livelli di osteopontina dopo l'ictus. Inoltre, l'EMS dopo l'ictus non ha aumentato la mortalità, suggerendo che il protocollo è sicuro e affidabile. Questa nuova procedura è efficace e ben tollerata e ha il potenziale per fornire informazioni su nuovi interventi per migliorare l'angiogenesi dopo ictus ischemico acuto.

Introduction

L'ictus ischemico è una lesione neurovascolare acuta con sequele croniche devastanti. La maggior parte dei sopravvissuti all'ictus, 650.000 all'anno, negli Stati Uniti soffre di disabilità funzionale permanente1. Nessuno dei trattamenti disponibili conferisce neuroprotezione e recupero funzionale dopo la fase acuta dell'ictus ischemico. Dopo un ictus ischemico acuto, sia l'apporto di sangue diretto che quello collaterale sono diminuiti, il che porta alla disfunzione delle cellule e delle reti cerebrali, con conseguenti improvvisi deficit neurologici 2,3. Il ripristino dell'afflusso di sangue alla regione ischemica rimane l'obiettivo principale della terapia dell'ictus. Pertanto, migliorare l'angiogenesi per promuovere l'afflusso di sangue nel territorio ischemico è un approccio terapeutico promettente; Tuttavia, i metodi precedentemente studiati per promuovere l'angiogenesi post-ictus, tra cui eritropoietina, statine e fattori di crescita, sono stati limitati da livelli inaccettabili di tossicità o traducibilità4.

L'encefalomiosinangiosi (EMS) è una procedura chirurgica che migliora l'angiogenesi cerebrale negli esseri umani con malattia di moyamoya, una condizione delle arterie craniche ristrette che spesso porta all'ictus. L'EMS comporta il distacco parziale di una sezione vascolare del muscolo temporale del paziente dal cranio, seguito da craniotomia e innesto del muscolo sulla corteccia interessata. Questa procedura è ben tollerata e induce l'angiogenesi cerebrale, riducendo il rischio di ictus ischemico nei pazienti con malattia di moyamoya 5,6. Pertanto, la procedura svolge in gran parte un ruolo preventivo in questi pazienti. L'angiogenesi causata da questa procedura può anche avere un ruolo nel promuovere la protezione neurovascolare e il recupero nel contesto dell'ictus ischemico. Questo rapporto supporta l'ipotesi che l'angiogenesi causata dall'EMS abbia il potenziale per espandere la comprensione e le opzioni terapeutiche per l'ischemia cerebrale.

Oltre all'EMS, ci sono diversi approcci farmacologici e chirurgici per migliorare l'angiogenesi, ma hanno diversi limiti. Approcci farmacologici come la somministrazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sono risultati insufficienti o addirittura dannosi a causa di diverse limitazioni, tra cui la formazione di plessi vascolari caotici, disorganizzati, permeabili e primitivi, che assomigliano a quelli trovati nei tessuti tumorali 7,8 e non hanno effetti benefici negli studi clinici9.

Gli approcci chirurgici comprendono l'anastomosi diretta come l'anastomosi superficiale dell'arteria temporale-media cerebrale, l'anastomosi indiretta come l'encefalo-duro arterio-sinangiosi (EDAS), l'encefalomiosinangiosi (EMS) e combinazioni di anastomosi diretta e indiretta10. Tutte queste procedure sono molto impegnative dal punto di vista tecnico e impegnative nei piccoli animali, ad eccezione dell'EMS. Mentre le altre procedure richiedono anastomosi vascolare complessa, EMS richiede un innesto muscolare relativamente semplice. Inoltre, la vicinanza del muscolo temporale alla corteccia lo rende una scelta naturale per l'innesto, in quanto non ha bisogno di essere completamente asportato o scollegato dal suo apporto di sangue, come sarebbe necessario se un muscolo più distante fosse utilizzato per l'innesto.

L'EMS è stato studiato in modelli di ipoperfusione cerebrale cronica nei ratti 7,11. Tuttavia, l'EMS che utilizza un innesto muscolare temporale non è mai stato studiato nell'ictus ischemico acuto nei roditori. Qui, descriviamo un nuovo protocollo di EMS nei topi dopo un ictus ischemico tramite il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo). Questo manoscritto serve come descrizione dei metodi e dei primi dati per questo nuovo approccio di EMS nei topi dopo MCAo.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee di UConn Health e condotti in conformità con le linee guida statunitensi. Il seguente protocollo dovrebbe funzionare in qualsiasi specie o ceppo di roditore. Qui, sono stati utilizzati topi maschi selvatici C57BL / 6 di età e peso corrispondenti. I topi sono stati nutriti con dieta standard di chow e acqua ad libitum. Le condizioni abitative standard sono state mantenute a 72,3 ° F e 30% -70% di umidità relativa con un ciclo luce / buio di 12 ore.

1. Preparazione pre-operatoria

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti mediante autoclave prima dell'intervento chirurgico. Sanificare la superficie operativa con etanolo al 70% e riscaldare la superficie operativa a 37 °C con una piastra riscaldante elettrica.
  2. Utilizzare una camera di induzione per anestetizzare il topo con isoflurano al 4% -5% per l'induzione. Fornire isoflurano all'1,5%-2,0% attraverso il cono del naso per il mantenimento fino alla fine dell'intervento chirurgico. Assicurarsi prima dell'intervento chirurgico che il topo sia adeguatamente anestetizzato valutando la mancanza di una risposta a un fermo pizzicamento del piede posteriore e la perdita della reazione posturale e del riflesso raddrizzante.
  3. Posizionare il mouse sul lato sinistro sulla superficie operatoria e applicare un unguento per gli occhi per proteggere entrambi gli occhi.
  4. Rasare i peli sul campo chirurgico (cioè il cranio laterale destro tra occhio e orecchio) con tagliacapelli elettrici. Pulire il campo chirurgico in cerchi concentrici verso l'esterno dal centro del sito chirurgico, con etanolo al 70% seguito da una soluzione di povidone, e ripetere questi passaggi 2x.
    NOTA: A causa del fatto che il sito chirurgico è vicino all'occhio, la rimozione del 150% dell'area circostante un sito chirurgico potrebbe non essere possibile per evitare irritazioni o lesioni accidentali all'occhio.
  5. Somministrare una singola dose di bupivacaina allo 0,25% (fino a 8 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezione sottocutanea come analgesia preoperatoria nel sito dell'intervento.
  6. Installare un microscopio chirurgico con ingrandimento 4x. Il microscopio viene utilizzato per tutte le fasi chirurgiche.

2. Procedura chirurgica

NOTA: le fasi dell'intervento chirurgico sono presentate nella Figura 1. Per questo protocollo, tre topi sono stati assegnati al gruppo sham, tre topi per EMS da solo, 12 topi per MCAo e 23 topi per MCAo + gruppo EMS.

  1. Chirurgia MCAo
    NOTA: MCAo è un modello ben caratterizzato di ictus ischemico nei roditori, come descritto da noi e altri12,13,14. Le fasi dell'intervento chirurgico sono descritte in breve qui. L'ischemia cerebrale transitoria focale è stata indotta da un MCAo destro di 60 minuti in anestesia isoflurana seguita da riperfusione per 7 o 21 giorni.
    1. Effettuare un'incisione del collo ventrale della linea mediana seguita da MCAo destro unilaterale facendo avanzare un monofilamento rivestito di gomma siliconica 6,0 lungo 10-11 mm dalla biforcazione interna dell'arteria carotide attraverso un moncone esterno dell'arteria carotide. Nei topi fittizi, eseguire interventi chirurgici identici ad eccezione dell'avanzamento della sutura nell'arteria carotide interna.
    2. Misurare le temperature rettali utilizzando un sistema di controllo della temperatura, mantenendo la temperatura a ~ 37 ° C durante l'intervento chirurgico con una piastra riscaldante automatica.
    3. Utilizzare la flussimetria laser Doppler per misurare il flusso sanguigno cerebrale prima dell'inserimento della sutura posizionando la sonda Doppler contro il cranio laterale (corrispondente al territorio MCA) e registrando il valore8. Per confermare la riduzione dell'occlusione al 15% del flusso sanguigno cerebrale basale, utilizzare la stessa procedura dopo l'avanzamento della sutura. Per confermare la riperfusione, utilizzare la stessa procedura dopo aver rimosso la sutura.
    4. Nutrire tutti gli animali con poltiglia umida fino al sacrificio e/o 1 settimana dopo l'intervento chirurgico per garantire un'alimentazione adeguata per gli endpoint cronici, poiché gli animali hanno deficit di allevamento dopo l'ictus.
  2. Chirurgia EMS
    1. Dopo 60 minuti di MCAo, randomizzare i topi in gruppi solo MCAo o MCAo + EMS. Eseguire EMS 4 ore dopo MCAo (gruppo MCAo + EMS) o chirurgia fittizia per esperimenti selezionati (gruppo solo EMS). Passare a un nuovo paio di guanti chirurgici sterili prima dell'intervento.
      NOTA: I topi si sono ripresi dall'anestesia dopo 60 minuti di MCAo e sono stati nuovamente anestetizzati prima dell'intervento chirurgico EMS.
    2. Per i gruppi che ricevono EMS (MCAo + EMS o gruppi solo EMS), eseguire un'incisione cutanea di 10-15 mm con le forbici, che si estende da 1-2 mm rostrale all'orecchio destro a 1-2 mm caudale all'occhio destro.
      NOTA: Le forbici sterili sono state utilizzate per prevenire danni accidentali ai muscoli temporali sottostanti.
    3. Ritrarre i lembi cutanei usando morsetti e identificare visivamente il muscolo temporale e il cranio.
    4. Sezionare senza mezzi termini il muscolo temporale lontano dal cranio usando le forbici con una tecnica di diffusione. Eseguire una miotomia di 2-3 mm diretta ventralmente lungo il bordo caudale del muscolo per facilitare la riflessione ventrale.
    5. Eseguire una craniotomia ~ 5 mm di diametro al cranio sotto il muscolo temporale riflesso utilizzando un micro trapano.
    6. Rimuovere la dura madre con una pinzetta per esporre la superficie piale del cervello. Prestare estrema attenzione per evitare lesioni accidentali al cervello.
    7. Suturare il bordo dorsale del muscolo temporale al tessuto sottocutaneo del lembo cutaneo dorsale con 6-0 filamenti monocrilici, rendendolo a filo della corteccia cerebrale esposta.
    8. Chiudere l'incisione cutanea con sutura monofilamento 6-0. Rimettere il mouse nella sua gabbia e monitorare fino al recupero dall'anestesia. Riportare il mouse nella sua struttura abitativa.

3. Considerazioni post-operatorie

  1. Monitorare quotidianamente i topi per la malattia e il sito chirurgico per l'infezione. Somministrare soluzione salina normale per via sottocutanea (1% del volume corporeo) ogni giorno per sostenere l'idratazione.
  2. Monitorare la disidratazione grave (perdita di peso corporeo >20%) fino a 7 giorni dopo l'intervento. Somministrare un ulteriore bolo di soluzione salina normale sottocutanea 1% volume in base al peso corporeo se >20% di perdita di peso.
  3. Procedere con iniezioni, monitoraggio fisiologico e altri test senza particolari considerazioni.
    NOTA: In questa procedura, l'uso di oppioidi o farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) per il trattamento post-operatorio è stato evitato a causa degli effetti noti di questi agenti sull'esito dell'ictus o sulle dimensioni dell'infarto in consultazione con il comitato istituzionale interno per la cura e l'uso degli animali15,16,17,18. Tuttavia, l'uso dell'analgesia post-operatoria è altamente incoraggiato per la chirurgia EMS con altri modelli. Si prega di consultare il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per questo.

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Representative Results

Un totale di 41 topi sono stati utilizzati per questo studio. Dopo tre mortalità, una in MCAo e due in MCAo + EMS, un totale di 38 topi sono stati utilizzati per ottenere i risultati mostrati.

Statistica
I dati di ciascun esperimento sono presentati come media ± deviazione standard (S.D.). La significatività è stata determinata utilizzando il test t dello studente spaiato per confrontare due gruppi o ANOVA unidirezionale per più di due gruppi, con un test post-hoc di Newman-Keuls per correggere più confronti.

Colorazione nicotinammide adenina dinucleotide (ridotta)-tetrazolium reduttasi (NADH-TR)
Questa colorazione è stata fatta per valutare la vitalità a lungo termine del muscolo innestato come in Turoczi et al.19. In breve, al momento del sacrificio, il lembo muscolare innestato è stato accuratamente asportato, fissato con paraformaldeide al 4% per 30 minuti e crioconservato in mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) a -80 °C. Diverse criosezioni spesse 12 μm di tessuto muscolare temporale sono state colorate per la reazione enzima-istochimica NADH-TR. I vetrini sono stati incubati per 30 minuti a 37 °C in una soluzione di tetrazolio nitroblu (1,8 mg/dL) e NADH (15 mg/dL) in tampone Tris 0,05 M (pH 7,6). Il reagente tetrazolio non utilizzato è stato rimosso utilizzando concentrazioni crescenti seguite da concentrazioni decrescenti di acetone. La valutazione quantitativa del muscolo colorato con NADH-tetrazolio è stata eseguita su immagini muscolari prese con ingrandimento 40x.

Studi di immunocolorazione
L'immunocolorazione è stata utilizzata per visualizzare il legame dell'innesto muscolare con la corteccia e la densità dei vasi sanguigni alla giunzione di muscolo e corteccia20,21. Per la visualizzazione del legame muscolare con il tessuto cerebrale, sono stati utilizzati topi sottoposti a chirurgia EMS. Alla fine di ogni rispettivo punto temporale, i topi sono stati anestetizzati con un'iniezione di avestina (50 mg / kg di peso corporeo), seguita da perfusione con 1x PBS contenente 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e fissazione con paraformaldeide al 4%. Il cranio è stato accuratamente tagliato per prevenire il distacco accidentale dell'innesto muscolare temporale (TM) dalla corteccia cerebrale. L'innesto di TM sopra la corteccia cerebrale è stato quindi separato dal muscolo temporale rimanente. Il cervello è stato accuratamente rimosso e post-fissato in paraformaldeide al 4% durante la notte. Il cervello fisso è stato quindi disidratato con il 30% di saccarosio in 1x PBS fino a quando il cervello è affondato sul fondo della fiala (circa 1-3 giorni). Sezioni di tessuto di dimensioni 30 μm sono state tagliate con microtomo congelante e montate su vetrini.

Per l'immunocolorazione dei vasi sanguigni nella corteccia cerebrale omolaterale, i topi MCAo e MCAo + EMS sono stati sacrificati, perfusi, fissati ed elaborati come sopra. Fette di cervello di dimensioni 30 μm sono state sezionate su un microtomo congelante e montate su un lato di vetro. Il recupero dell'antigene è stato effettuato utilizzando tampone citrato (pH 6,0) e le sezioni sono state incubate con tampone bloccante seguito da incubazione durante la notte con anticorpi primari, actina del muscolo scheletrico anti-alfa 1:200 e Lectin-Dy59421,22. Tre sezioni del cervello coronale per topo (n = 5 topi / gruppo; totale = 15 sezioni) sono state prese tra 0,45 mm e 0,98 mm dal bregma, colorate e visualizzate per la quantificazione con un ingrandimento 20x alla giunzione del nucleo ischemico e delle regioni della penombra. Un osservatore in cieco ha quantificato la densità dei vasi positivi alla lectina nel parenchima cerebrale utilizzando il software ImageJ.

L'innesto muscolare rimane vitale a 21 giorni dopo l'EMS
Un prerequisito per il successo di questo intervento chirurgico è la vitalità a lungo termine del muscolo temporale innestato. L'innesto di Meditazione Trascendentale ha mostrato danni transitori delle cellule muscolari a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico nel muscolo innestato rispetto al muscolo di controllo (71,32% di sopravvivenza delle cellule muscolari ± 16,64% vs 97,19% ± 3,81%). Tuttavia, questa differenza tra il muscolo innestato e quello di controllo è svanita e i muscoli si sono ripresi completamente 21 giorni dopo l'intervento chirurgico (98,22% ± 3,965 contro 96,87% ± 2,27%; Figura 2A).

Gli innesti muscolari allentano i legami con il tessuto cerebrale
L'innesto riuscito del muscolo temporale sulla superficie della corteccia cerebrale è un requisito fondamentale per il successo di questo modello. In entrambi i modelli EMS + MCAo e EMS-only, gli innesti muscolari temporali hanno aderito alla superficie corticale 21 giorni dopo EMS, suggerendo un intervento chirurgico di successo, l'impianto dell'innesto e il legame (Figura 1B e Figura 2B).

La densità dei vasi sanguigni aumenta nella corteccia perilesionale dopo EMS
L'ictus acuto porta a una riduzione acuta del flusso sanguigno cerebrale, al reclutamento impedito di vasi collaterali, alla germinazione vascolare anormale e all'angiogenesi disfunzionale, che contribuiscono a scarsi esiti di ictus23. L'EMS aumenta significativamente la superficie dei vasi sanguigni e la densità integrata nella corteccia perilesionale dopo ictus (p < 0,05 rispetto al solo MCAo; Figura 3).

Analisi di proteine angiogeniche e neuromodulanti
Un array di angiogenesi di topo è stato utilizzato per confrontare l'espressione di proteine angiogeniche e neuromodulanti 7 giorni e 21 giorni dopo MCAo in topi solo MCAo vs MCAo + EMS secondo le istruzioni del produttore24. Il software ImageJ è stato utilizzato per quantificare la densità di pixel per ciascun punto dati della macchia di punti proteici. I dati sono stati registrati come rapporto tra la densità di ciascuna proteina analizzata e la densità media degli standard per ogni macchia.

Il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)-acido è sovraregolato e l'osteopontina è sottoregolata dopo EMS
I risultati dell'array proteico hanno mostrato un aumento significativo dei livelli proteici di FGF-acido (0,677 ± 0,007 vs 0,585 ± 0,014, p = 0,045), un potente fattore angiogenico, e diminuzione dei livelli di osteopontina, una molecola multifunzionale espressa in condizioni infiammatorie (0,692 ± 0,007 vs 0,758 ± 0,014, p = 0,048) nel gruppo MCAo + EMS 21 giorni dopo l'ictus, suggerendo un miglioramento dell'angiogenesi e della neuroprotezione (Figura 4A).

Esiti di mortalità per EMS dopo ictus
Sia MCAo che EMS sono tecniche chirurgiche invasive che possono causare una certa mortalità nei topi. In questo esperimento, c'era tra il 10% e l'11% di mortalità nei topi 21 giorni dopo l'intervento chirurgico MCAo, che è un tasso di mortalità accettato per i topi sottoposti a 60 minuti di MCAo14. L'esecuzione di EMS sui topi dopo MCAo non ha aumentato la mortalità (Figura 4B) suggerendo la tolleranza della chirurgia EMS anche dopo MCAo.

Figure 1
Figura 1. Procedura EMS graduale dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo): (A) Fase 1. Un'incisione cutanea viene eseguita sul territorio dell'arteria cerebrale media destra. La pelle e i tessuti sottocutanei vengono riflessi, esponendo il cranio e il muscolo temporale. Passo 2. Il muscolo temporale viene sezionato lontano dal cranio e riflesso ventralmente. Passo 3. Viene eseguita una craniotomia (4-5 mm) e la dura viene delicatamente rimossa. Passo 4. Il muscolo temporale è posizionato direttamente sulla superficie del cervello per coprire la corteccia esposta. Passo 5. Il bordo dorsale del muscolo temporale viene suturato al tessuto sottocutaneo del lembo cutaneo dorsale, a filo con la superficie cerebrale. Passo 6. L'incisione è chiusa e il topo viene rimosso dall'anestesia e restituito alla sua gabbia. Questa parte della figura è stata modificata da25. (B) Schema concettuale per il trattamento dell'encefalomiosinangiosi (EMS) dell'ictus indotto da MCAo. Abbreviazioni: FGF = Fattore di crescita dei fibroblasti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Studi di immunocolorazione. (A) Gli innesti muscolari temporali mantengono la vitalità. Gli innesti muscolari temporali (EMS) sul tessuto della corteccia ischemica mantengono un'elevata vitalità. (Sinistra) Immagine rappresentativa delle cellule del tessuto muscolare colorate con nicotinammide adenina dinucleotide (ridotta)-tetrazolium reduttasi-colorate dal controllo (muscolo naïve dal lato controlaterale) e muscolo innestato a 7 giorni dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) + chirurgia encefalomiosinangiosi (EMS). La freccia nera () mostra le celle danneggiate. (Destra) Quantificazione delle cellule muscolari vive/morte. Le cellule muscolari a 7 giorni dopo l'EMS mostrano un lieve danno (p < 0,1; t-test) che ha recuperato completamente a 21 giorni. (n = 5 topi / punti temporali = totale 10 topi in questo gruppo) I dati sono medi ± S.D. Barra della scala = 20 μm. (B) Legame del muscolo temporale innestato con la corteccia cerebrale 21 giorni dopo l'intervento chirurgico EMS. Tessuti EMS colorati con actina anti-alfa del muscolo scheletrico (verde) e anticorpo Lectin-Dy594 (rosso; marcatore dei vasi sanguigni) (n = 3 topi). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La chirurgia dell'encefalomiosinangiosi (EMS) aumenta la densità dei vasi sanguigni nelle lesioni ischemiche 21 giorni dopo l'ictus . (A) Immagini rappresentative di sezioni cerebrali coronali di topi sottoposti a occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) o MCAo + EMS (destra) e colorate con L. esculentum (Tomato) Lectin-Dy594, che si lega alle glicoproteine nella membrana basale delle cellule endoteliali. I grafici sono aree quantificate. I topi MCAo + EMS hanno mostrato una rete di endotelio più elevata utilizzando parametri vale a dire area della frazione vascolare ( B) e densità integrata (C). **p < 0,01 (test t spaiato), mentre i topi solo MCAo hanno mostrato danni vicino alla lesione ischemica (linea tratteggiata). N = 5 topi / gruppo = 10 topi in totale. I dati sono medi ± S.D. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: Contra = lato controlaterale; Ipsi =lato omolaterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: L'encefalomiosinangiosi modula le proteine angiogeniche dopo l'ictus . (A) Un array di angiogenesi murina (ARY015) è stato utilizzato per valutare simultaneamente i livelli relativi di 53 proteine correlate all'angiogenesi di topo dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) e MCAo + EMS (giorno 21 dopo MCAo) nei lisati del tessuto cerebrale dalla corteccia perilesionale. L'analisi quantitativa mostra che la chirurgia EMS ha ridotto significativamente l'osteopontina e aumentato la proteina acida del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) dopo ictus (*p < 0,05 o **p < 0,01) rispetto all'MCAo omolaterale. I dati sono medi ± S.D.; n = 3 topi / gruppo / punto temporale = totale 15 topi. (B) L'EMS non ha aumentato la mortalità dopo ictus (MCAo). La curva di sopravvivenza di Kaplan Meier mostra che EMS + MCAO non ha modificato la mortalità post-ictus rispetto al solo MCAO (p = 0,54). Per EMS n = 3; per MCAo n = 11; e per MCAo + EMS n = 21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive una procedura EMS di successo in un modello murino di ictus indotto da MCAo. I dati mostrano che il tessuto innestato rimane vitale e può formare legami con la corteccia cerebrale molto tempo dopo l'intervento chirurgico EMS. Questi risultati supportano il razionale per l'utilizzo di un innesto muscolare cerebrale per sviluppare gradualmente un ambiente trofico riccamente vascolare nel sito dell'ictus. L'EMS è una terapia promettente per riparare potenzialmente il tessuto cerebrale infartuato nello stesso ambiente.

I passaggi critici del protocollo includono il passo 2.2.4: questo passaggio causa traumi inevitabili alla Meditazione Trascendentale che può ridurre la sua capacità di legarsi con la corteccia e rilasciare fattori trofici. Fare attenzione a limitare il trauma della Meditazione Trascendentale nella misura del possibile. Una strategia alternativa per ridurre il trauma tissutale è quella di sezionare senza mezzi termini la Meditazione Trascendentale dal cranio solo al suo bordo dorsale e rinunciare alla miotomia. In questo caso, la Meditazione Trascendentale verrebbe sollevata dal cranio (piuttosto che completamente riflessa) e la craniotomia verrebbe eseguita con il trapano craniotomico sotto il muscolo. Questo riduce la quantità di spazio disponibile per eseguire questo passaggio, ma ancora una volta può ridurre il trauma della Meditazione Trascendentale . Inoltre, estrema cura e pratica sono necessarie nelle fasi 2.2.5 e 2.2.6, per prevenire lesioni alla corteccia cerebrale sottostante durante la craniotomia e la manipolazione della dura.

Questo modello EMS è un'aggiunta naturale al consolidato modello MCAo. Poiché il modello MCAo simula da vicino la fisiopatologia dell'ischemia e del danno della rete vascolare, che è comune nei pazienti umani, è probabile che il modello MCAo + EMS abbia un alto livello di traducibilità nell'uomo. Il modello EMS qui presentato è il primo intervento terapeutico che è stato studiato per l'ictus ischemico in ambito preclinico che si basa solo sul tessuto autologo. Inoltre, poiché l'innesto di Meditazione Trascendentale è organico e autologo, può dimostrare interazioni di segnalazione paracrina con il cervello danneggiato adiacente che servono a regolare il rilascio di fattori trofici a livelli ottimali in vari punti temporali.

Mentre l'ictus crea un ambiente proangiogenico e stimola l'angiogenesi stessa26, la risposta intrinseca post-ictus non è sufficiente a migliorare l'apporto vascolare nella regione danneggiata a causa dei livelli sottosoglia dei fattori angiogenici. Qui, EMS ha ulteriormente migliorato l'espressione proteica FGF-acida rispetto agli animali solo ictus. Questa proteina controlla indirettamente la neovascolarizzazione di concerto con altri fattori di crescita. FGF-acido funziona anche come fattore neurotrofico, promuovendo la neuroprotezione e la neurogenesi27,28. Alcuni degli effetti neuroprotettivi dell'acido FGF sono mediati dall'attivazione delle vie AKT e MAPK/EPK29. Oltre alla FGF, c'era anche una ridotta espressione della proteina osteopontina. L'osteopontina è una citochina pleotropica pro-infiammatoria che viene sempre più riconosciuta per il suo ruolo in molteplici neuropatologie e processi di rimodellamento tissutale, tra le altre funzioni. Il ruolo dell'osteopontina nell'ictus è ancora incerto30. Tuttavia, studi recenti sull'uomo indicano l'osteopontina come un fattore prognostico sfavorevole dopo l'ictus. Una diminuzione dei livelli sierici di osteopontina dopo ictus è stata dimostrata in uno studio per prevedere esiti favorevoli (punteggio della scala Rankin modificato < 2 a 90 giorni) in pazienti umani con ictus31. Un altro studio ha mostrato una relazione dose-dipendente tra livelli più elevati di osteopontina plasmatica e esiti di morte e disabilità nei pazienti umani dopo l'ictus32. In linea con questi studi clinici, i dati qui suggeriscono che l'osteopontina ridotta dopo EMS può promuovere un ambiente antinfiammatorio per aumentare la formazione di neo-vasi. Nel complesso, l'espressione differenziale di FGF-acida e osteopontina punta verso i meccanismi che governano l'angiogenesi dopo EMS in questo modello murino e aumenta la probabilità che la procedura che può anche portare neuroprotezione e neuro-rigenerazione oltre all'angiogenesi.

Esistono alcune potenziali limitazioni di questa procedura. La misurazione del flusso cerebrale a causa dell'aumento della densità dei vasi sanguigni è impegnativa in questa procedura, poiché le procedure comunemente utilizzate di laser Doppler o misuratore di portata laser speckle sono influenzate dalla presenza di muscoli temporali sulla parte superiore della corteccia che impediscono la vera misurazione del sangue sulla superficie corticale. Pertanto, questa procedura potrebbe richiedere una scansione MRI di piccoli roditori più sofisticata, ma raramente disponibile, se è richiesta la misurazione del flusso in tempo reale. Tuttavia, l'uso della misurazione della densità dei vasi sanguigni supporta indirettamente il successo della procedura EMS nel migliorare l'angiogenesi, come suggerito dai nostri dati. Un'altra limitazione è la natura invasiva degli interventi EMS sulla parte superiore di MCAo, che a sua volta è una procedura invasiva. Sebbene non vi sia stato alcun aumento della mortalità con EMS in questo studio rispetto al solo MCAo, il requisito per l'emicraniectomia può limitare la sua traducibilità futura per tutti i tipi di ictus. Tuttavia, nella pratica clinica, il >10% dei pazienti con ictus ischemico di grandi dimensioni richiede emicraniectomia per gestire l'aumento della pressione intracranica23, e questo modello EMS può avere valore traslazionale per questo sottogruppo di pazienti con ictus in particolare. Infine, il punto temporale di 4 ore post-MCAo per le prestazioni di EMS è stato scelto per rientrare nella finestra di trattamento standard di rT-PA per la maggior parte dei pazienti umani, anche se studi futuri utilizzeranno punti temporali successivi per valutare la finestra terapeutica per EMS.

Nel complesso, il modello EMS fornisce un'opzione ben tollerata per indurre l'angiogenesi dopo ictus ischemico e, oltre alla sua potenziale traduzione clinica, può essere utilizzato in studi futuri che esaminano la fisiopatologia dell'ictus e dell'angiogenesi.

Il modello EMS qui descritto offre un metodo sicuro per ottenere l'angiogenesi cerebrale per lo studio preclinico, ovviando alla necessità di interventi farmacologici, che spesso portano a effetti collaterali indesiderati o angiogenesi incontrollata. Molti pazienti con ictus ischemico di grandi dimensioni richiedono un'emicraniectomia durante il loro decorso clinico per gestire l'aumento della pressione intracranica. Questa procedura EMS, che include anche l'emicraniectomia nei topi per l'innesto muscolare, può fornire una prova preclinica del concetto per l'applicazione traslazionale dell'EMS nell'ictus ischemico. Pertanto, questo modello ha il potenziale per espandere la conoscenza del recupero neurovascolare dopo un ictus ischemico e per facilitare lo sviluppo dell'innovazione, che è la necessità del momento, nelle terapie per i sopravvissuti all'ictus.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da Research Excellence Program-UConn Health (a Ketan R Bulsara e Rajkumar Verma) e UConn Health start-up (a Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

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References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

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Neuroscienze Numero 184
Un modello per il trattamento dell'encefalomiosinangiosi dopo ictus indotto da occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi
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Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

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