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Neuroscience

Un modèle pour le traitement de l’encéphalomyosynangiose après un accident vasculaire cérébral induit par l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne chez la souris

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Le protocole vise à fournir des méthodes pour l’encéphalomyosynangiose - greffe d’un lambeau musculaire temporalis vasculaire sur la surface piale du tissu cérébral ischémique - pour le traitement de l’AVC ischémique aigu non-moyamoya. L’efficacité de l’approche dans l’augmentation de l’angiogenèse est évaluée à l’aide d’un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris.

Abstract

Il n’existe aucun traitement efficace pour la plupart des patients souffrant d’AVC ischémique, ce qui rend impératif le développement de nouvelles thérapies. La capacité du cerveau à s’auto-guérir après un AVC ischémique est limitée par un apport sanguin insuffisant dans la zone touchée. L’encéphalomyosynangiose (EMS) est une procédure neurochirurgicale qui réalise l’angiogenèse chez les patients atteints de la maladie de moyamoya. Il s’agit d’une craniotomie avec placement d’une greffe musculaire vasculaire temporale sur la surface du cerveau ischémique. EMS n’a jamais été étudié dans le cadre d’un AVC ischémique aigu chez la souris. L’hypothèse à l’origine de cette étude est que l’EMS améliore l’angiogenèse cérébrale à la surface corticale entourant la greffe musculaire. Le protocole présenté ici décrit la procédure et fournit des données initiales à l’appui de la faisabilité et de l’efficacité de l’approche EMS. Dans ce protocole, après 60 minutes d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (MCAo), les souris ont été randomisées pour un traitement MCAo ou MCAo + EMS. L’EMS a été effectué 3-4 h après l’occlusion. Les souris ont été sacrifiées 7 ou 21 jours après le traitement MCAo ou MCAo + EMS. La viabilité du greffon temporalis a été mesurée à l’aide du test nicotinamide adénine dinucléotide réduit tétrazolium réductase. Un réseau d’angiogenèse de souris a quantifié l’expression des protéines angiogéniques et neuromodulatrices. L’immunohistochimie a été utilisée pour visualiser la liaison du greffon avec le cortex cérébral et le changement de densité des vaisseaux. Les données préliminaires ici suggèrent que le muscle greffé est resté viable 21 jours après EMS. L’immunomarquage a montré une implantation réussie du greffon et une augmentation de la densité des vaisseaux près de la greffe musculaire, indiquant une augmentation de l’angiogenèse. Les données montrent que l’EMS augmente le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et diminue les niveaux d’ostéopontine après un AVC. De plus, les SMU après un AVC n’ont pas augmenté la mortalité, ce qui suggère que le protocole est sûr et fiable. Cette nouvelle procédure est efficace et bien tolérée et a le potentiel de fournir des informations sur de nouvelles interventions pour l’angiogenèse améliorée après un AVC ischémique aigu.

Introduction

L’AVC ischémique est une lésion neurovasculaire aiguë avec des séquelles chroniques dévastatrices. La plupart des survivants d’un AVC, 650 000 par an, aux États-Unis souffrent d’une incapacité fonctionnelle permanente1. Aucun des traitements disponibles ne confère de neuroprotection et de récupération fonctionnelle après la phase aiguë de l’AVC ischémique. Après un AVC ischémique aigu, les apports sanguins directs et collatéraux sont diminués, ce qui entraîne un dysfonctionnement des cellules et des réseaux cérébraux, entraînant des déficits neurologiques soudains 2,3. La restauration de l’apport sanguin à la région ischémique demeure l’objectif principal du traitement de l’AVC. Ainsi, l’amélioration de l’angiogenèse pour favoriser l’apport sanguin dans le territoire ischémique est une approche thérapeutique prometteuse; Cependant, les méthodes précédemment étudiées pour favoriser l’angiogenèse post-AVC, y compris l’érythropoïétine, les statines et les facteurs de croissance, ont été limitées par des niveaux inacceptables de toxicité ou de translatabilité4.

L’encéphalomyosynangiose (EMS) est une intervention chirurgicale qui améliore l’angiogenèse cérébrale chez les humains atteints de la maladie de moyamoya, une affection des artères crâniennes rétrécies qui conduit souvent à un accident vasculaire cérébral. EMS implique le détachement partiel d’une section vasculaire du muscle temporalis du patient du crâne, suivi d’une craniotomie et d’une greffe du muscle sur le cortex affecté. Cette procédure est bien tolérée et induit une angiogenèse cérébrale, réduisant le risque d’accident vasculaire cérébral ischémique chez les patients atteints de la maladie de moyamoya 5,6. Ainsi, la procédure joue un rôle largement préventif chez ces patients. L’angiogenèse provoquée par cette procédure peut également jouer un rôle dans la promotion de la protection neurovasculaire et de la récupération dans le cadre d’un AVC ischémique. Ce rapport soutient l’hypothèse selon laquelle l’angiogenèse provoquée par EMS a le potentiel d’élargir la compréhension et les options thérapeutiques pour l’ischémie cérébrale.

Outre l’EMS, il existe plusieurs approches pharmacologiques et chirurgicales pour améliorer l’angiogenèse, mais elles ont plusieurs limites. Les approches pharmacologiques telles que l’administration de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) se sont révélées insuffisantes ou même préjudiciables en raison de plusieurs limitations, notamment la formation de plexus vasculaires chaotiques, désorganisés, perméables et primitifs, qui ressemblent à ceux trouvés dans les tissus tumoraux 7,8 et n’ont aucun effet bénéfique dans les essais cliniques9.

Les approches chirurgicales comprennent l’anastomose directe telle que l’anastomose superficielle de l’artère temporale et de l’artère cérébrale moyenne, l’anastomose indirecte telle que l’encéphalo-duro artério-synangiose (EDAS), l’encéphalomyosynangiose (EMS) et les combinaisons d’anastomose directe et indirecte10. Toutes ces procédures sont très difficiles et exigeantes sur le plan technique chez les petits animaux, à l’exception des SME. Alors que les autres procédures nécessitent une anastomose vasculaire complexe, EMS nécessite une greffe musculaire relativement simple. De plus, la proximité du muscle temporel avec le cortex en fait un choix naturel pour la greffe, car il n’a pas besoin d’être complètement excisé ou déconnecté de son approvisionnement en sang, comme cela serait nécessaire si un muscle plus éloigné était utilisé pour la greffe.

EMS a été étudié dans des modèles d’hypoperfusion cérébrale chronique chez le rat 7,11. Cependant, l’EMS utilisant une greffe musculaire temporale n’a jamais été étudié dans l’AVC ischémique aigu chez les rongeurs. Ici, nous décrivons un nouveau protocole d’EMS chez la souris après un AVC ischémique via un modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo). Ce manuscrit sert de description des méthodes et des premières données pour cette nouvelle approche de l’EMS chez la souris après MCAo.

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Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de UConn Health et menées conformément aux directives américaines. Le protocole suivant devrait fonctionner dans n’importe quelle espèce ou souche de rongeur. Ici, des souris mâles de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines, appariées selon l’âge et le poids, ont été utilisées. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire standard et de l’eau ad libitum. Les conditions de logement standard ont été maintenues à 72,3 ° F et 30% à 70% d’humidité relative avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures.

1. Préparation préopératoire

  1. Stérilisez tous les instruments par autoclavage avant la chirurgie. Désinfectez la surface de fonctionnement avec de l’éthanol à 70 % et réchauffez la surface de travail à 37 °C avec un coussin chauffant électrique.
  2. Utilisez une chambre d’induction pour anesthésier la souris avec 4% -5% d’isoflurane pour l’induction. Administrer de l’isoflurane de 1,5 % à 2,0 % par cône nasal pour l’entretien jusqu’à la fin de la chirurgie. Avant la chirurgie, assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en évaluant l’absence de réponse à un pincement ferme du pied postérieur et à la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement.
  3. Placez la souris sur son côté gauche sur la surface d’opération et appliquez une pommade pour les yeux pour protéger les deux yeux.
  4. Rasez les poils sur le champ chirurgical (c.-à-d. le crâne latéral droit entre l’œil et l’oreille) avec des tondeuses électriques. Nettoyez le champ chirurgical en cercles concentriques vers l’extérieur à partir du milieu du site chirurgical, avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution de povidone, et répétez ces étapes 2x.
    REMARQUE: En raison de la proximité du site de chirurgie de l’œil, l’ablation de 150% de la zone entourant un site chirurgical peut ne pas être possible pour éviter une irritation ou une blessure accidentelle à l’œil.
  5. Administrer une dose unique de bupivacaïne à 0,25 % (jusqu’à 8 mg/kg de poids corporel) par injection sous-cutanée comme analgésie préopératoire au site de la chirurgie.
  6. Installez un microscope chirurgical à un grossissement de 4x. Le microscope est utilisé pour toutes les étapes chirurgicales.

2. Procédure chirurgicale

REMARQUE : Les étapes de la chirurgie sont présentées à la figure 1. Pour ce protocole, trois souris ont été assignées au groupe placebo, trois souris pour EMS seul, 12 souris pour MCAo et 23 souris pour le groupe MCAo + EMS.

  1. Chirurgie MCAo
    NOTE: MCAo est un modèle bien caractérisé d’AVC ischémique chez les rongeurs, tel que décrit par nous et d’autres12,13,14. Les étapes de la chirurgie sont brièvement décrites ici. L’ischémie cérébrale transitoire focale a été induite par un MCAo droit de 60 min sous anesthésie à l’isoflurane suivi d’une reperfusion pendant 7 ou 21 jours.
    1. Faire une incision médiane du cou ventrale suivie d’un MCAo droit unilatéral en avançant un monofilament recouvert de caoutchouc de silicone de 10 à 11 mm de long de 6,0 à partir de la bifurcation de l’artère carotide interne via un moignon de l’artère carotide externe. Chez les souris simulées, effectuer des chirurgies identiques, à l’exception de l’avancement de la suture dans l’artère carotide interne.
    2. Mesurez la température rectale à l’aide d’un système de contrôle de la température, en maintenant la température à ~37 °C pendant la chirurgie avec un coussin chauffant automatique.
    3. Utilisez la débitmétrie Doppler laser pour mesurer le débit sanguin cérébral avant l’insertion de la suture en plaçant la sonde Doppler contre le crâne latéral (correspondant au territoire MCA) et en enregistrant la valeur8. Pour confirmer la réduction de l’occlusion à 15% du débit sanguin cérébral de base, utilisez la même procédure après l’avancement de la suture. Pour confirmer la reperfusion, utilisez la même procédure après le retrait de la suture.
    4. Nourrir tous les animaux avec de la purée humide jusqu’au sacrifice et / ou 1 semaine après la chirurgie pour assurer une nutrition adéquate pour les paramètres chroniques, car les animaux ont des déficits d’élevage après un AVC.
  2. Chirurgie EMS
    1. Après 60 min de MCAo, randomiser les souris en groupes MCAo seul ou MCAo + EMS. Effectuer EMS 4 h après MCAo (groupe MCAo + EMS) ou une chirurgie simulée pour certaines expériences (groupe EMS uniquement). Adoptez une nouvelle paire de gants chirurgicaux stériles avant la chirurgie.
      REMARQUE: Les souris se sont rétablies de l’anesthésie après 60 minutes de MCAo et ont été réanesthésiées avant la chirurgie EMS.
    2. Pour les groupes qui reçoivent EMS (MCAo + EMS ou EMS uniquement), faites une incision cutanée de 10-15 mm avec des ciseaux, s’étendant de 1-2 mm rostral à l’oreille droite à 1-2 mm caudale à l’œil droit.
      REMARQUE: Des ciseaux stériles ont été utilisés pour prévenir les dommages accidentels aux muscles temporalis en dessous.
    3. Rétractez les lambeaux cutanés à l’aide de pinces et identifiez visuellement le muscle temporalis et le crâne.
    4. Disséquez carrément le muscle temporel loin du crâne à l’aide de ciseaux avec une technique d’étalement. Effectuer une myotomie de 2-3 mm dirigée ventralement le long du bord caudale du muscle pour faciliter la réflexion ventrale.
    5. Effectuer une craniotomie ~ 5 mm de diamètre au niveau du crâne sous le muscle temporalis réfléchi à l’aide d’une micro-perceuse.
    6. Retirez la dure-mère avec une pince à épiler pour exposer la surface piale du cerveau. Faites preuve d’une extrême prudence pour éviter les blessures accidentelles au cerveau.
    7. Suturer le bord dorsal du muscle temporal au tissu sous-cutané du lambeau de peau dorsale avec des filaments monocryliques 6-0, le faisant affleurer le cortex cérébral exposé.
    8. Fermez l’incision cutanée avec une suture monofilament 6-0. Replacez la souris dans sa cage et surveillez jusqu’à ce qu’elle se rétablisse de l’anesthésie. Remettez la souris dans son logement.

3. Considérations postopératoires

  1. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter la maladie et le site chirurgical pour détecter l’infection. Administrer quotidiennement une solution saline sous-cutanée normale (1 % du volume en poids corporel) pour favoriser l’hydratation.
  2. Surveillez la déshydratation sévère (perte de poids corporel >20%) jusqu’à 7 jours après la chirurgie. Administrer un bolus supplémentaire de solution saline sous-cutanée normale à 1% du volume par poids corporel si >20% de perte de poids.
  3. Procéder aux injections, à la surveillance physiologique et à d’autres tests sans considérations particulières.
    REMARQUE : Dans cette procédure, l’utilisation d’opioïdes ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) pour traiter la chirurgie a été évitée en raison des effets connus de ces agents sur l’issue de l’AVC ou la taille de l’infarctus en consultation avec le comité interne de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement15,16,17,18. Cependant, l’utilisation de l’analgésie postopératoire est fortement encouragée pour la chirurgie EMS avec d’autres modèles. Veuillez consulter le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour cela.

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Representative Results

Au total, 41 souris ont été utilisées pour cette étude. Après trois mortalités, une dans MCAo et deux dans MCAo + EMS, un total de 38 souris ont été utilisées pour obtenir les résultats montrés.

Statistiques
Les données de chaque expérience sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (S.D.). La signification a été déterminée à l’aide du test t de l’étudiant non apparié pour comparer deux groupes ou de l’ANOVA unidirectionnelle pour plus de deux groupes, avec un test post-hoc de Newman-Keuls pour corriger les comparaisons multiples.

Coloration à la nicotinamide adénine dinucléotide (réduite)-tétrazolium réductase (NADH-TR)
Cette coloration a été faite pour évaluer la viabilité à long terme du muscle greffé comme dans Turoczi et al.19. Brièvement, au moment du sacrifice, le lambeau musculaire greffé a été soigneusement excisé, fixé avec 4% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes et cryoconservé dans un milieu à température de coupe optimale (OCT) à -80 ° C. Plusieurs cryosections de tissu musculaire temporalis de 12 μm d’épaisseur ont été colorées pour la réaction enzymatique-histochimique NADH-TR. Les lames ont été incubées pendant 30 min à 37 °C dans une solution de tétrazolium nitrobleu (1,8 mg/dL) et de NADH (15 mg/dL) dans un tampon Tris 0,05 M (pH 7,6). Le réactif de tétrazolium inutilisé a été éliminé en utilisant des concentrations croissantes puis décroissantes d’acétone. Une évaluation quantitative du muscle coloré au NADH-tétrazolium a été réalisée sur des images musculaires prises à un grossissement de 40x.

Études d’immunomarquage
L’immunomarquage a été utilisé pour visualiser la liaison de la greffe musculaire avec le cortex et la densité des vaisseaux sanguins à la jonction du muscle et du cortex20,21. Pour la visualisation de la liaison musculaire avec le tissu cérébral, des souris qui avaient subi une chirurgie EMS ont été utilisées ici. À la fin de chaque point temporel respectif, les souris ont été anesthésiées avec une injection d’avertin (50 mg / kg de poids corporel), suivie d’une perfusion avec 1x PBS contenant 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et d’une fixation avec 4% de paraformaldéhyde. Le crâne a été soigneusement coupé pour éviter le détachement accidentel de la greffe de muscle temporalis (TM) du cortex cérébral. La greffe de MT au-dessus du cortex cérébral a ensuite été séparée du muscle temporalis restant. Le cerveau a été soigneusement retiré et post-fixé dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit. Le cerveau fixe a ensuite été déshydraté avec 30% de saccharose dans 1x PBS jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du flacon (environ 1-3 jours). Des coupes de tissus de 30 μm ont été découpées avec un microtome de congélation et montées sur des lames.

Pour l’immunomarquage des vaisseaux sanguins dans le cortex cérébral ipsilatéral, les souris MCAo et MCAo + EMS ont été sacrifiées, perfusées, fixées et traitées comme ci-dessus. Des tranches de cerveau de 30 μm ont été sectionnées sur un microtome de congélation et montées sur un côté en verre. Le prélèvement d’antigènes a été effectué à l’aide d’un tampon de citrate (pH 6,0) et les sections ont été incubées avec un tampon de blocage suivie d’une incubation pendant la nuit avec des anticorps primaires, de l’actine musculaire squelettique anti-alpha 1:200 et de la lectine-Dy59421,22. Trois coupes de cerveau coronal par souris (n = 5 souris/groupe; total = 15 sections) ont été prélevées entre 0,45 mm et 0,98 mm du bregma, colorées et visualisées pour quantification à un grossissement de 20x à la jonction du noyau ischémique et de la pénombre. Un observateur en aveugle a quantifié la densité des vaisseaux positifs de lectine dans le parenchyme cérébral à l’aide du logiciel ImageJ.

La greffe musculaire reste viable 21 jours après l’EMS
Une condition préalable au succès de cette chirurgie est la viabilité à long terme du muscle temporalis greffé. La greffe de MT a montré des dommages transitoires des cellules musculaires 7 jours après la chirurgie dans le muscle greffé par rapport au muscle témoin (71,32% de survie des cellules musculaires ± 16,64% contre 97,19% ± 3,81%). Cependant, cette différence entre le muscle greffé et le muscle témoin a disparu, et les muscles se sont complètement rétablis 21 jours après la chirurgie (98,22 % ± 3,965 contre 96,87 % ± 2,27 %; Figure 2A).

Les greffes musculaires créent des liens lâches avec le tissu cérébral
Une greffe réussie du muscle temporel sur la surface du cortex cérébral est une condition primordiale pour le succès de ce modèle. Dans le modèle EMS + MCAo et EMS uniquement, les greffes musculaires temporales ont adhéré à la surface corticale 21 jours après l’EMS, suggérant une chirurgie, une implantation de greffe et une liaison réussies (Figure 1B et Figure 2B).

La densité des vaisseaux sanguins augmente dans le cortex périlésionnel après EMS
L’AVC aigu entraîne une réduction aiguë du flux sanguin cérébral, entrave le recrutement des vaisseaux collatéraux, une germination vasculaire anormale et une angiogenèse dysfonctionnelle, qui contribuent à de mauvais résultats de l’AVC23. EMS augmente significativement la surface des vaisseaux sanguins et la densité intégrée dans le cortex périlésionnel après un AVC (p < 0,05 vs MCAo seul; Graphique 3).

Analyse des protéines angiogéniques et neuromodulatrices
Un réseau d’angiogenèse de souris a été utilisé pour comparer l’expression des protéines angiogéniques et neuromodulatrices 7 jours et 21 jours après MCAo chez les souris MCAo seul par rapport aux souris MCAo + EMS conformément aux instructions du fabricant24. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour quantifier la densité de pixels pour chaque point de données du transfert de points de protéines. Les données ont été enregistrées sous forme de rapport entre la densité de chaque protéine analysée et la densité moyenne des étalons pour chaque transfert.

Le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) acide est régulé à la hausse et l’ostéopontine est régulée à la baisse après EMS
Les résultats de la matrice de protéines ont montré une augmentation significative des niveaux de protéines de FGF-acide (0,677 ± 0,007 vs 0,585 ± 0,014, p = 0,045), un facteur angiogénique puissant, et une diminution des niveaux d’ostéopontine, une molécule multifonctionnelle exprimée dans des conditions inflammatoires (0,692 ± 0,007 vs 0,758 ± 0,014, p = 0,048) dans le groupe MCAo + EMS 21 jours après l’AVC, suggérant une amélioration de l’angiogenèse et de la neuroprotection (Figure 4A).

Résultats de la mortalité pour EMS après un AVC
MCAo et EMS sont des techniques chirurgicales invasives qui peuvent causer une certaine mortalité chez la souris. Dans cette expérience, il y avait entre 10% et 11% de mortalité chez les souris 21 jours après la chirurgie MCAo, ce qui est un taux de mortalité accepté pour les souris soumises à 60 minutes deMCAo 14. La réalisation d’EMS sur des souris après MCAo n’a pas augmenté la mortalité (Figure 4B), suggérant une tolérance à la chirurgie EMS même après MCAo.

Figure 1
Graphique 1. Procédure EMS par étapes après occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo): (A) Étape 1. Une incision cutanée est pratiquée sur le territoire droit de l’artère cérébrale moyenne. La peau et les tissus sous-cutanés sont réfléchis, exposant le crâne et le muscle temporal. Étape 2. Le muscle temporel est disséqué loin du crâne et réfléchi ventralement. Étape 3. Une craniotomie est réalisée (4-5 mm) et la dure-mère est délicatement retirée. Étape 4. Le muscle temporalis est placé directement sur la surface du cerveau pour couvrir le cortex exposé. Étape 5. Le bord dorsal du muscle temporalis est suturé au tissu sous-cutané du lambeau de peau dorsale, au ras de la surface du cerveau. Étape 6. L’incision est fermée et la souris est retirée de l’anesthésie et renvoyée dans sa cage. Cette partie de la figure a été modifiée par rapport à25. (B) Schéma conceptuel pour le traitement de l’encéphalomyosynangiose (EMS) de l’AVC induit par MCAo. Abréviations : FGF = Facteur de croissance des fibroblastes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Études d’immunomarquage. (A) Les greffes musculaires temporales maintiennent la viabilité. Les greffes musculaires temporales (EMS) sur le tissu du cortex ischémique maintiennent une viabilité élevée. (Gauche) Image représentative des cellules du tissu musculaire colorées à la nicotinamide adénine dinucléotide (réduite)-tétrazolium réductase du groupe témoin (muscle naïf du côté controlatéral) et du muscle greffé 7 jours après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) + chirurgie de l’encéphalomyosynangiose (EMS). La flèche noire () indique les cellules endommagées. (À droite) Quantification des cellules musculaires vivantes / mortes. Les cellules musculaires à 7 jours après EMS montrent des dommages légers (p < 0,1; test t) qui se sont complètement rétablis à 21 jours. (n = 5 souris/points temporels = total 10 souris dans ce groupe) Les données sont moyennes ± S.D. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Liaison du muscle temporal greffé avec le cortex cérébral 21 jours après la chirurgie EMS. Tissus EMS colorés avec de l’actine musculaire squelettique anti-alpha (vert) et des anticorps Lectin-Dy594 (rouge; marqueur des vaisseaux sanguins) (n = 3 souris). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La chirurgie de l’encéphalomyosynangiose (EMS) augmente la densité des vaisseaux sanguins dans les lésions ischémiques 21 jours après l’AVC. (A) Images représentatives de coupes de cerveau coronal de souris soumises à une occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) (à gauche) ou à un MCAo + EMS (à droite) et colorées avec L. esculentum (Tomato) Lectin-Dy594, qui se lie aux glycoprotéines de la membrane basale des cellules endothéliales. Les graphiques sont des zones quantifiées. Les souris MCAo + EMS ont montré un réseau endothélium plus élevé en utilisant des paramètres tels que la zone de fraction vasculaire (B) et la densité intégrée (C). **p < 0,01 (test t non apparié), tandis que les souris MCAo seul ont montré des dommages proches de la lésion ischémique (ligne pointillée). N = 5 souris/groupe = 10 souris au total. Les données sont moyennes ± S.D. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : Contra = côté controlatéral; Ipsi = côté ipsilatéral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : L’encéphalomyosynangiose module les protéines angiogéniques après un AVC. (A) Un réseau d’angiogenèse de souris (ARY015) a été utilisé pour évaluer simultanément les niveaux relatifs de 53 protéines liées à l’angiogenèse de souris après occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) et MCAo + EMS (jour 21 après MCAo) dans les lysats de tissus cérébraux du cortex périlésionnel. L’analyse quantitative montre que la chirurgie EMS a significativement réduit l’ostéopontine et augmenté le facteur de croissance des fibroblastes (FGF)-protéine acide après un AVC (*p < 0,05 ou **p < 0,01) par rapport au MCAo ipsilatéral. Les données sont moyennes ± S.D.; n = 3 souris/groupe/point temporel = total 15 souris. (B) EMS n’a pas augmenté la mortalité après un AVC (MCAo). La courbe de survie de Kaplan Meier montre que EMS + MCAO n’a pas changé la mortalité post-AVC par rapport au MCAO seul (p = 0,54). Pour EMS n = 3; pour MCAo n = 11; et pour MCAo + EMS n = 21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit une procédure EMS réussie dans un modèle murin d’AVC induit par MCAo. Les données montrent que le tissu greffé reste viable et peut former des liaisons avec le cortex cérébral longtemps après la chirurgie EMS. Ces résultats soutiennent la justification de l’utilisation d’une greffe musculaire cérébrale pour développer progressivement un environnement trophique richement vasculaire au site de l’AVC. EMS est une thérapie prometteuse pour potentiellement réparer le tissu cérébral infarctus dans le même environnement.

Les étapes critiques du protocole comprennent l’étape 2.2.4 : cette étape provoque un traumatisme inévitable pour la MT, ce qui peut réduire sa capacité à se lier au cortex et à libérer des facteurs trophiques. Prenez soin de limiter les traumatismes de MT dans la mesure du possible. Une stratégie alternative pour réduire les traumatismes tissulaires consiste à disséquer carrément la MT du crâne uniquement à son bord dorsal et à renoncer à la myotomie. Dans ce cas, la MT serait soulevée loin du crâne (plutôt que complètement réfléchie), et la craniotomie serait effectuée avec la perceuse de craniotomie sous le muscle. Cela réduit la quantité d’espace disponible pour effectuer cette étape, mais encore une fois peut réduire le traumatisme de la MT. En outre, un soin et une pratique extrêmes sont nécessaires aux étapes 2.2.5 et 2.2.6, pour prévenir les lésions du cortex cérébral sous-jacent pendant la craniotomie et la manipulation de la dure-mère.

Ce modèle EMS est un complément naturel au modèle MCAo bien établi. Parce que le modèle MCAo simule étroitement la physiopathologie de l’ischémie et des lésions du réseau vasculaire, ce qui est courant chez les patients humains, le modèle MCAo + EMS est susceptible d’avoir un niveau élevé de translatabilité pour les humains. Le modèle EMS présenté ici est la première intervention thérapeutique qui a été étudiée pour l’AVC ischémique dans le cadre préclinique qui repose uniquement sur le tissu autologue. De plus, comme la greffe de MT est organique et autologue, elle peut démontrer des interactions de signalisation paracrine avec le cerveau blessé adjacent qui servent à réguler la libération des facteurs trophiques à des niveaux optimaux à différents moments.

Bien que l’AVC crée un environnement proangiogénique et stimule l’angiogenèse elle-même26, la réponse intrinsèque post-AVC n’est pas suffisante pour améliorer l’approvisionnement vasculaire dans la région endommagée en raison des niveaux inférieurs au seuil des facteurs angiogéniques. Ici, EMS a encore amélioré l’expression de la protéine FGF-acide par rapport aux animaux victimes d’AVC seuls. Cette protéine contrôle indirectement la néovascularisation de concert avec d’autres facteurs de croissance. FGF-acide fonctionne également comme un facteur neurotrophique, favorisant la neuroprotection et la neurogenèse27,28. Certains des effets neuroprotecteurs du FGF-acide sont médiés par l’activation des voies AKT et MAPK/EPK29. En plus de FGF, il y avait aussi une expression réduite de la protéine ostéopontine. L’ostéopontine est une cytokine pléotropique pro-inflammatoire qui est de plus en plus reconnue pour son rôle dans de multiples neuropathologies et processus de remodelage tissulaire, entre autres fonctions. Le rôle de l’ostéopontine dans l’AVC est encore incertain30. Cependant, des études récentes chez l’homme indiquent que l’ostéopontine est un facteur pronostique sombre après un AVC. Une étude a montré qu’une diminution des taux sériques d’ostéopontine après un AVC permettait de prédire des résultats favorables (score modifié sur l’échelle de Rankin < 2 à 90 jours) chez les patients humains victimes d’un AVC31. Une autre étude a montré une relation dose-dépendante entre des niveaux plus élevés d’ostéopontine plasmatique et les résultats de décès et d’invalidité chez les patients humains après un AVC32. Conformément à ces études cliniques, les données ici suggèrent qu’une réduction de l’ostéopontine après EMS peut favoriser un environnement anti-inflammatoire pour augmenter la formation de néo-vaisseaux. Dans l’ensemble, l’expression différentielle de l’acide FGF et de l’ostéopontine indique des mécanismes régissant l’angiogenèse après EMS dans ce modèle murin et augmente la probabilité que la procédure puisse également entraîner une neuroprotection et une neuro-régénération en plus de l’angiogenèse.

Il existe certaines limites potentielles de cette procédure. La mesure du flux cérébral due à l’augmentation de la densité des vaisseaux sanguins est difficile dans cette procédure, car les procédures couramment utilisées de Doppler laser ou de débitmètre à moucheture laser sont affectées par la présence de muscle temporalis sur le dessus du cortex qui empêchent la vraie mesure du sang sur la surface corticale. Ainsi, cette procédure peut nécessiter une IRM de petits rongeurs plus sophistiquée, mais rarement disponible, si une mesure du débit en temps réel est nécessaire. Cependant, l’utilisation de la mesure de la densité des vaisseaux sanguins soutient indirectement le succès de la procédure EMS dans l’amélioration de l’angiogenèse, comme le suggèrent nos données. Une autre limite est la nature invasive des interventions EMS sur le dessus de MCAo, qui est elle-même une procédure invasive. Bien qu’il n’y ait pas eu d’augmentation de la mortalité avec EMS dans cette étude par rapport à MCAo seul, la nécessité d’une hémicraniectomie pourrait limiter sa transposabilité future pour tous les types d’AVC. Cependant, en pratique clinique, >10% des patients ayant subi un AVC ischémique important nécessitent une hémicraniectomie pour gérer une augmentation de la pression intracrânienne23, et ce modèle EMS peut avoir une valeur translationnelle pour ce sous-groupe de patients victimes d’un AVC en particulier. Enfin, le point temporel de 4 h post-MCAo pour la performance de l’EMS a été choisi pour se situer dans la fenêtre de traitement standard du rT-PA pour la plupart des patients humains, bien que les études futures utiliseront des points temporels ultérieurs pour évaluer la fenêtre thérapeutique de l’EMS.

Dans l’ensemble, le modèle EMS fournit une option bien tolérée pour induire l’angiogenèse après un AVC ischémique et, en plus de sa traduction clinique potentielle, peut être utilisé dans de futures études examinant la physiopathologie de l’AVC et de l’angiogenèse.

Le modèle EMS décrit ici offre une méthode sûre pour réaliser l’angiogenèse cérébrale pour l’étude préclinique, évitant ainsi le besoin d’interventions pharmacologiques, qui conduisent souvent à des effets secondaires indésirables ou à une angiogenèse incontrôlée. De nombreux patients ayant subi un AVC ischémique important nécessitent une hémicraniectomie au cours de leur cours clinique pour gérer l’augmentation de la pression intracrânienne. Cette procédure EMS, qui comprend également une hémicraniectomie chez la souris pour la greffe musculaire, peut fournir une preuve de concept préclinique pour l’application translationnelle de l’EMS dans l’AVC ischémique. Par conséquent, ce modèle a le potentiel d’élargir les connaissances sur la récupération neurovasculaire après un AVC ischémique et de faciliter le développement de l’innovation, qui sont le besoin de l’heure, en thérapeutique pour les survivants d’un AVC.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par Research Excellence Program-UConn Health (à Ketan R Bulsara et Rajkumar Verma) et UConn Health start-up (à Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

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References

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Neurosciences numéro 184
Un modèle pour le traitement de l’encéphalomyosynangiose après un accident vasculaire cérébral induit par l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne chez la souris
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Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

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