Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En modell for encefalomyosynangiose behandling etter Middle Cerebral Artery okklusjon-indusert hjerneslag hos mus

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen tar sikte på å gi metoder for encefalomyosynangiose-podning av en vaskulær temporalis muskelklaff på den piale overflaten av iskemisk hjernevev - for behandling av ikke-moyamoya akutt iskemisk slag. Tilnærmingens effekt ved økende angiogenese evalueres ved hjelp av en forbigående okklusjonsmodell for cerebri cerebralt stadium hos mus.

Abstract

Det er ingen effektiv behandling tilgjengelig for de fleste pasienter som lider av iskemisk hjerneslag, noe som gjør utvikling av nye terapier avgjørende. Hjernens evne til å helbrede seg selv etter iskemisk slag er begrenset av utilstrekkelig blodtilførsel i det berørte området. Encephalomyosynangiosis (EMS) er en nevrokirurgisk prosedyre som oppnår angiogenese hos pasienter med moyamoya sykdom. Det innebærer kraniotomi med plassering av et vaskulært temporalis muskeltransplantat på den iskemiske hjerneoverflaten. EMS har aldri blitt studert i forbindelse med akutt iskemisk slag hos mus. Hypotesen som driver denne studien er at EMS forbedrer cerebral angiogenese på den kortikale overflaten som omgir muskeltransplantatet. Protokollen vist her beskriver prosedyren og gir innledende data som støtter gjennomførbarheten og effekten av EMS-tilnærmingen. I denne protokollen, etter 60 minutter med forbigående okklusjon av cerebrifer i midten (MCAo), ble mus randomisert til enten MCAo- eller MCAo + EMS-behandling. EMS ble utført 3-4 timer etter okklusjon. Musene ble ofret 7 eller 21 dager etter MCAo eller MCAo + EMS-behandling. Temporalis graft levedyktighet ble målt ved bruk av nikotinamid adenin dinukleotid redusert-tetrazolium reduktase analyse. En museangiogenesegruppe kvantifiserte angiogent og nevromodulerende proteinuttrykk. Immunhistokjemi ble brukt til å visualisere transplantatbinding med hjernebarken og endring i fartøyets tetthet. De foreløpige dataene her tyder på at podet muskel forble levedyktig 21 dager etter EMS. Immunfarging viste vellykket transplantatimplantasjon og økning i kartetthet nær muskeltransplantatet, noe som indikerer økt angiogenese. Data viser at EMS øker fibroblastvekstfaktoren (FGF) og reduserer osteopontinnivået etter hjerneslag. I tillegg økte EMS etter hjerneslag ikke dødeligheten, noe som tyder på at protokollen er trygg og pålitelig. Denne nye prosedyren er effektiv og godt tolerert og har potensial til å gi informasjon om nye tiltak for forbedret angiogenese etter akutt iskemisk hjerneslag.

Introduction

Iskemisk hjerneslag er en akutt nevrovaskulær skade med ødeleggende kroniske sekveler. De fleste av slagoverlevende, 650 000 per år, i USA lider av permanent funksjonshemning1. Ingen av de tilgjengelige behandlingene gir nevrobeskyttelse og funksjonell gjenoppretting etter den akutte fasen av iskemisk hjerneslag. Etter et akutt iskemisk slag reduseres både direkte og sikkerhetsblodforsyninger, noe som fører til dysfunksjon av hjerneceller og nettverk, noe som resulterer i plutselige nevrologiske underskudd 2,3. Restaurering av blodtilførsel til iskemisk region er fortsatt det fremste målet for slagbehandling. Dermed er forbedring av angiogenese for å fremme blodtilførselen i det iskemiske territoriet en lovende terapeutisk tilnærming; Tidligere studerte metoder for å fremme angiogenese etter hjerneslag, inkludert erytropoietin, statiner og vekstfaktorer, har imidlertid vært begrenset av uakseptable nivåer av toksisitet eller oversettbarhet4.

Encephalomyosynangiosis (EMS) er en kirurgisk prosedyre som forbedrer cerebral angiogenese hos mennesker med moyamoya sykdom, en tilstand av trange kraniale arterier som ofte fører til hjerneslag. EMS innebærer delvis løsrivelse av en vaskulær del av pasientens temporalismuskel fra skallen, etterfulgt av kraniotomi og podning av muskelen på den berørte cortex. Denne prosedyren tolereres godt og induserer cerebral angiogenese, noe som reduserer risikoen for iskemisk slag hos pasienter med moyamoya sykdom 5,6. Dermed tjener prosedyren i stor grad en forebyggende rolle hos disse pasientene. Angiogenesen forårsaket av denne prosedyren kan også ha en rolle i å fremme nevrovaskulær beskyttelse og gjenoppretting i innstillingen av iskemisk slag. Denne rapporten støtter hypotesen om at angiogenese forårsaket av EMS har potensial til å utvide forståelsen av og terapeutiske muligheter for cerebral iskemi.

Ved siden av EMS er det flere farmakologiske og kirurgiske tilnærminger for å forbedre angiogenesen, men de har flere begrensninger. Farmakologiske tilnærminger som administrasjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) har vist seg å være utilstrekkelig eller til og med skadelig på grunn av flere begrensninger, inkludert dannelse av kaotiske, uorganiserte, lekkende og primitive vaskulære plexuser, som ligner de som finnes i tumorvevet 7,8 og har ingen gunstige effekter i kliniske studier9.

Kirurgiske tilnærminger inkluderer direkte anastomose som overfladisk temporal arterie-midtre cerebral arterie anastomose, indirekte anastomose som encephalo-duro arterio-synangiosis (EDAS), encefalomyosynangiose (EMS) og kombinasjoner av direkte og indirekte anastomose10. Alle disse prosedyrene er svært teknisk utfordrende og krevende hos små dyr, bortsett fra EMS. Mens de andre prosedyrene krever kompleks vaskulær anastomose, krever EMS et relativt enkelt muskeltransplantat. Videre gjør nærheten til temporalismuskelen til cortex det til et naturlig valg for podning, da det ikke trenger å bli fullstendig skåret ut eller koblet fra blodtilførselen, som det ville være nødvendig hvis en fjernere muskel ble brukt til podning.

EMS har blitt studert i kroniske cerebrale hypoperfusjonsmodeller hos rotter 7,11. Imidlertid har EMS ved hjelp av et temporalis muskeltransplantat aldri blitt studert ved akutt iskemisk slag hos gnagere. Her beskriver vi en ny protokoll av EMS hos mus etter et iskemisk slag via midtre cerebral arterie okklusjonsmodell (MCAo). Dette manuskriptet fungerer som en beskrivelse av metoder og tidlige data for denne nye tilnærmingen til EMS hos mus etter MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of UConn Health og utført i samsvar med amerikanske retningslinjer. Følgende protokoll skal fungere i alle arter eller stammer av gnagere. Her ble 8- til 12 uker gamle, alders- og vektmatchede C57BL / 6 villtype hannmus brukt. Mus ble matet standard chow diett og vann ad libitum. Standard husforhold ble opprettholdt ved 72,3 ° F og 30% -70% relativ fuktighet med en 12 h lys / mørk syklus.

1. Pre-kirurgi forberedelse

  1. Steriliser alle instrumenter ved autoklavering før kirurgi. Desinfiser driftsflaten med 70 % etanol og varm opp driftsflaten til 37 °C med en elektrisk varmepute.
  2. Bruk et induksjonskammer til å bedøve musen med 4% -5% isofluran for induksjon. Lever 1,5%-2,0% isofluran via nesekjegle for vedlikehold til slutten av operasjonen. Sørg før operasjonen at musen er riktig bedøvet ved å vurdere mangelen på respons på en fast bakfotklemme og tap av postural reaksjon og rettingsrefleks.
  3. Plasser musen på venstre side på driftsflaten og påfør øyesalve for å beskytte begge øynene.
  4. Barber håret over det kirurgiske feltet (dvs. høyre laterale kranium mellom øye og øre) med elektriske klippere. Rengjør det kirurgiske feltet i konsentriske sirkler utover fra midten av operasjonsstedet, med 70% etanol etterfulgt av povidonløsning, og gjenta disse trinnene 2x.
    MERK: På grunn av at operasjonsstedet er nær øyet, kan det hende at fjerning av 150% av området rundt et kirurgisk sted ikke er mulig for å unngå irritasjon eller utilsiktet skade på øyet.
  5. Administrer en enkeltdose på 0,25 % bupivakain (opptil 8 mg/kg kroppsvekt) ved subkutan injeksjon som preoperativ analgesi på operasjonsstedet.
  6. Sett opp et kirurgisk mikroskop ved 4x forstørrelse. Mikroskopet brukes til alle kirurgiske trinn.

2. Kirurgi prosedyre

MERK: Operasjonstrinnene er presentert i figur 1. For denne protokollen ble tre mus allokert til humbuggruppe, tre mus for EMS alene, 12 mus for MCAo og 23 mus for MCAo + EMS-gruppen.

  1. MCAo kirurgi
    MERK: MCAo er en godt karakterisert modell av iskemisk slag hos gnagere, som beskrevet av oss og andre12,13,14. Operasjonstrinnene er kort beskrevet her. Fokal forbigående cerebral iskemi ble indusert av en 60 min høyre MCAo under isofluranbedøvelse etterfulgt av reperfusjon i 7 eller 21 dager.
    1. Lag et midtlinje ventralhalssnitt etterfulgt av ensidig høyre MCAo ved å fremme en 10-11 mm lang 6,0 silikongummibelagt monofilament fra bifurkasjonen av halspulsåren interna via en ekstern halspulsårstubbe. I humbugmus, utfør identiske operasjoner bortsett fra fremdriften av suturen i den indre halspulsåren.
    2. Mål rektaltemperaturer ved hjelp av et temperaturkontrollsystem, og hold temperaturen på ~ 37 ° C under operasjonen med en automatisk varmepute.
    3. Bruk laserdopplerstrømningsmetri for å måle cerebral blodstrøm før suturinnsetting ved å plassere Doppler-sonden mot sideskallen (tilsvarende MCA-territoriet) og registrere verdien8. For å bekrefte okklusjonsreduksjon til 15% av baseline cerebral blodstrøm, bruk samme prosedyre etter at suturen er avansert. For å bekrefte reperfusjon, bruk samme prosedyre etter at suturen er fjernet.
    4. Fôr alle dyr med våt mos til ofring og/eller 1 uke etter operasjonen for å sikre tilstrekkelig ernæring for kroniske endepunkter, da dyr har oppdrettsunderskudd etter slag.
  2. EMS kirurgi
    1. Etter 60 minutter med MCAo, randomiser mus til MCAo-only eller MCAo + EMS-grupper. Utfør EMS 4 timer etter MCAo (MCAo + EMS-gruppe) eller humbugkirurgi for utvalgte eksperimenter (kun EMS-gruppe). Bytt til et nytt par sterile kirurgiske hansker før operasjonen.
      MERK: Musene kom seg fra anestesi etter 60 minutter med MCAo og ble bedøvet på nytt før EMS-operasjonen.
    2. For grupper som mottar EMS (MCAo + EMS eller EMS-bare grupper), gjør et 10-15 mm hudinnsnitt med saks, som strekker seg fra 1-2 mm rostral til høyre øre til 1-2 mm kaudal til høyre øye.
      MERK: Steril saks ble brukt for å forhindre utilsiktet skade på temporalismusklene under.
    3. Trekk inn hudlapper ved hjelp av klemmer og identifiser visuelt temporalismuskelen og skallen.
    4. Disseker temporalismuskelen direkte bort fra skallen ved hjelp av saks med spredningsteknikk. Utfør en 2-3 mm myotomi rettet ventralt langs muskelens kaudale kant for å lette ventral refleksjon.
    5. Utfør en kraniotomi ~ 5 mm i diameter på skallen under den reflekterte temporalismuskelen ved hjelp av en mikrobor.
    6. Fjern dura mater med pinsett for å eksponere den pial overflaten av hjernen. Vær ekstremt forsiktig for å unngå utilsiktet skade på hjernen.
    7. Sutur den dorsale grensen til temporalismuskelen til det subkutane vevet i dorsalhudklaffen med 6-0 monokrylfilamenter, noe som gjør den flush til den eksponerte hjernebarken.
    8. Lukk hudinnsnittet med 6-0 monofilament sutur. Plasser musen tilbake i buret og overvåke til utvinning fra anestesi. Returner musen til husanlegget.

3. Postoperative hensyn

  1. Overvåk musene for sykdom og operasjonsstedet for infeksjon daglig. Gi subkutan normal saltvann (1 % volum etter kroppsvekt) daglig for å støtte hydrering.
  2. Overvåk for alvorlig dehydrering (tap av kroppsvekt >20%) til 7 dager etter operasjonen. Administrer en ekstra bolus av subkutan normal saltvann 1% volum etter kroppsvekt hvis >20% vekttap.
  3. Fortsett med injeksjoner, fysiologisk overvåking og annen testing uten spesielle hensyn.
    MERK: I denne prosedyren ble bruk av opioider eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs) for å behandle etter kirurgi unngått på grunn av de kjente effektene av disse midlene på slagutfall eller infarktstørrelse i samråd med intern institusjonell dyrepleie og brukskomité15,16,17,18. Imidlertid er bruk av postoperativ analgesi sterkt oppmuntret for EMS-kirurgi med andre modeller. Ta kontakt med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for dette.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt 41 mus ble brukt til denne studien. Etter tre dødsfall, en i MCAo og to i MCAo + EMS, ble totalt 38 mus brukt til å oppnå resultatene som ble vist.

Statistikk
Data fra hvert eksperiment presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (S.D.). Signifikans ble bestemt ved bruk av enten uparret elevs t-test for sammenligning av to grupper eller enveis ANOVA for mer enn to grupper, med en Newman-Keuls post-hoc-test for å korrigere for flere sammenligninger.

Nikotinamid-adenin-dinukleotid (redusert)-tetrazoliumreduktase (NADH-TR) farging
Denne fargingen ble gjort for å vurdere den langsiktige levedyktigheten til den podede muskelen som i Turoczi et al.19. Kort fortalt ble den podede muskelklaffen forsiktig skåret ut, festet med 4 % paraformaldehyd i 30 minutter og kryopreservert i optimal skjæretemperatur (OCT) medium ved -80 °C. Flere 12 μm tykke kryoseksjoner av temporalis muskelvev ble farget for NADH-TR enzym-histokjemisk reaksjon. Lysbildene ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C i en oppløsning av nitroblått tetrazolium (1,8 mg/dl) og NADH (15 mg/dl) i 0,05 M Tris buffer (pH 7,6). Ubrukt tetrazoliumreagens ble fjernet med økende dosering etterfulgt av synkende konsentrasjoner av aceton. Kvantitativ vurdering av NADH-tetrazoliumfarget muskel ble utført på muskelbilder tatt ved 40x forstørrelse.

Immunostaining studier
Immunostaining ble brukt til å visualisere muskeltransplantatbinding med cortex og blodkartetthet ved krysset mellom muskel og cortex20,21. For visualisering av muskelbinding med hjernevev ble mus som hadde gjennomgått EMS-kirurgi brukt her. På slutten av hvert respektive tidspunkt ble mus bedøvet med en avertininjeksjon (50 mg / kg kroppsvekt), etterfulgt av perfusjon med 1x PBS inneholdende 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og fiksering med 4% paraformaldehyd. Hodeskallen ble forsiktig kuttet for å forhindre utilsiktet løsrivelse av temporalis muskel (TM) graft fra hjernebarken. TM-transplantat over hjernebarken ble deretter separert fra den gjenværende temporalismuskelen. Hjernen ble forsiktig fjernet og postfiksert i 4% paraformaldehyd over natten. Den faste hjernen ble deretter dehydrert med 30% sukrose i 1x PBSuntil hjernen sank til bunnen av hetteglasset (ca. 1-3 dager). Vevsseksjoner på 30 μm størrelse ble kuttet med frysemikrotom og montert på lysbilder.

For immunostaining av blodkar i den ipsilaterale hjernebarken ble MCAo og MCAo + EMS-mus ofret, perfundert, fast og behandlet som ovenfor. Hjerneskiver på 30 μm størrelse ble seksjonert på en iskald mikrotom og montert på en glassside. Antigenuthenting ble gjort ved bruk av sitratbuffer (pH 6,0) og snitt ble inkubert med blokkeringsbuffer etterfulgt av inkubasjon over natten med primære antistoffer, anti-alfa skjelettmuskelaktin 1:200 og lektin-Dy59421,22. Tre koronale hjerneseksjoner per mus (n = 5 mus/gruppe; totalt = 15 seksjoner) ble tatt mellom 0,45 mm og 0,98 mm fra bregma, farget og visualisert for kvantifisering ved 20x forstørrelse ved krysset mellom de iskemiske kjerne- og penumbraregionene. En blindet observatør kvantifiserte lektinpositiv fartøytetthet i hjerneparenkymen ved hjelp av ImageJ-programvare.

Muskeltransplantat forblir levedyktig ved 21 dager etter EMS
En forutsetning for å lykkes med denne operasjonen er langsiktig levedyktighet av den podede temporalismuskelen. TM-transplantatet viste forbigående skade på muskelceller 7 dager etter operasjon i transplantert muskel vs. kontrollmuskel (71,32 % muskelcelleoverlevelse ± 16,64 % vs. 97,19 % ± 3,81 %). Imidlertid forsvant denne forskjellen mellom podet og kontrollmuskelen, og musklene kom seg helt 21 dager etter operasjonen (98,22% ± 3,965 mot 96,87% ± 2,27%; Figur 2A).

Muskeltransplantater gir løse bindinger med hjernevev
Vellykket podning av temporalismuskelen på hjernebarkens overflate er en fremste forutsetning for å lykkes med denne modellen. I både EMS + MCAo- og EMS-only-modellen festet temporalismuskeltransplantatene seg til den kortikale overflaten 21 dager etter EMS, noe som tyder på vellykket kirurgi, transplantatimplantasjon og binding (figur 1B og figur 2B).

Blodkartettheten øker i perilesional cortex etter EMS
Akutt hjerneslag fører til akutt reduksjon i cerebral blodstrøm, hindret rekruttering av sikkerhetsfartøy, unormal vaskulær spiring og dysfunksjonell angiogenese, noe som bidrar til dårlige slagutfall23. EMS øker blodkarets overflateareal og integrert tetthet betydelig i perilesional cortex etter slag (p < 0,05 vs. kun MCAo; Figur 3).

Analyse av angiogene og nevromodulerende proteiner
En museangiogenesegruppe ble brukt til å sammenligne ekspresjon av angiogene og nevromodulerende proteiner 7 dager og 21 dager etter MCAo i MCAo-only vs. MCAo + EMS-mus i henhold til produsentens instruksjoner24. ImageJ-programvare ble brukt til å kvantifisere pikseltetthet for hvert datapunkt i proteinprikken blot. Data ble registrert som forholdet mellom tettheten av hvert analysert protein og gjennomsnittlig tetthet av standardene for hver blot.

Fibroblast vekstfaktor (FGF)-sur er oppregulert og osteopontin er nedregulert etter EMS
Protein array-resultater viste en signifikant økning i proteinnivåer av FGF-syre (0,677 ± 0,007 vs. 0,585 ± 0,014, p = 0,045), en potent angiogen faktor og reduksjon i osteopontinnivåer, et multifunksjonelt molekyl uttrykt i inflammatoriske tilstander (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) i MCAo + EMS-gruppen 21 dager etter hjerneslag, noe som tyder på forbedret angiogenese og nevroproteksjon (figur 4A).

Dødelighetsutfall for EMS etter hjerneslag
Både MCAo og EMS er invasive kirurgiske teknikker som kan forårsake noe dødelighet hos mus. I dette eksperimentet var det mellom 10% -11% dødelighet hos mus 21 dager etter MCAo-kirurgi, som er en akseptert dødsrate for mus utsatt for 60 minutter MCAo14. Å utføre EMS på mus etter MCAo økte ikke dødeligheten (figur 4B) noe som tyder på toleranse for EMS-kirurgi selv etter MCAo.

Figure 1
Figur 1. Trinnvis EMS-prosedyre etter okklusjon av mellomstor cerebral arterie (MCAo): (A) Trinn 1. Et hudinnsnitt er laget over høyre midtre hjernearterie territorium. Huden og subkutant vev reflekteres, utsetter skallen og temporalis muskelen. Trinn 2. Temporalismuskelen blir dissekert bort fra skallen og reflektert ventralt. Trinn 3. En kraniotomi utføres (4-5 mm) og duraen fjernes forsiktig. Trinn 4. Temporalismuskelen plasseres direkte på hjernens overflate for å dekke den eksponerte cortex. Trinn 5. Den dorsale kanten av temporalismuskelen sutureres til det subkutane vevet i dorsal hudklaffen, flush med hjerneoverflaten. Trinn 6. Snittet er lukket, og musen fjernes fra anestesi og returneres til buret. Denne delen av figuren er endret fra25. (B) Konseptuell skjematisk for encefalomyosynangiose (EMS) behandling av MCAo-indusert hjerneslag. Forkortelser: FGF = Fibroblast vekstfaktor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Immunostaining studier. (A) Temporalis muskeltransplantater opprettholder levedyktighet. Temporalis muskeltransplantater (EMS) på iskemisk cortexvev opprettholder høy levedyktighet. (Venstre) Representativt bilde av nikotinamid-adenin-dinukleotid (redusert)-tetrazoliumreduktasefargede muskelvevsceller fra kontroll (naiv muskel fra kontralateral side) og podet muskel 7 dager etter okklusjon av cerebrial cerebri cerebralt (MCAo) + encefalomyosynangiose (EMS) kirurgi. Svart pil () viser skadede celler. (Høyre) Kvantifisering av levende/døde muskelceller. Muskelceller 7 dager etter EMS viser noen milde skader (p < 0,1; t-test) som fullstendig gjenopprettet på 21 dager. (n = 5 mus/tidspunkter = totalt 10 mus i denne gruppen) Data er gjennomsnittlig ± S.D. Scale bar = 20 μm. (B) Binding av podet temporalis muskel med hjernebark 21 dager etter EMS-kirurgi. EMS-vev farget med anti-alfa skjelettmuskelaktin (grønn) og Lectin-Dy594 (rød; blodkarmarkør) antistoff (n = 3 mus). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Encephalomyosynangiosis (EMS) kirurgi øker blodkartettheten i iskemiske lesjoner 21 dager etter hjerneslag . (A) Representative bilder av koronale hjernesnitt fra mus utsatt for (venstre) okklusjon av cerebrial cerebri media (MCAo) eller (høyre) MCAo + EMS og farget med L. esculentum (Tomat) Lectin-Dy594, som binder seg til glykoproteiner i basalmembranen til endotelceller. Grafer er kvantifiserte områder. MCAo + EMS-mus viste høyere endotelnettverk ved bruk av parametere viz. vaskulært fraksjonsområde ( B) og integrert tetthet (C). **p < 0,01 (uparret t-test), mens mus kun MCAo viste skade nær den iskemiske lesjonen (stiplet linje). N = 5 mus/gruppe= 10 mus totalt. Data er gjennomsnittlige ± S.D. Skalalinje = 100 μm. Forkortelser: Contra = kontralateral side; Ipsi = ipsilateral side. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Encephalomyosynangiose modulerer angiogene proteiner etter hjerneslag. (A) En museangiogenese array (ARY015) ble brukt til samtidig å vurdere de relative nivåene av 53 mus angiogenese-relaterte proteiner etter okklusjon av cerebri cerebri hos cerebri cerebri (MCAo) og MCAo + EMS (dag 21 etter MCAo) i hjernevevslysater fra perilesional cortex. Kvantitativ analyse viser at EMS-kirurgi signifikant reduserte osteopontin og økt fibroblastvekstfaktor (FGF) -surt protein etter slag (* p < 0,05 eller ** p < 0,01) vs ipsilateral MCAo. Data er ment ± S.D.; n = 3 mus/gruppe/tidspunkt = totalt 15 mus. (B) EMS økte ikke dødeligheten etter hjerneslag (MCAo). Kaplan Meiers overlevelseskurve viser at EMS + MCAO ikke endret dødelighet etter hjerneslag vs. MCAO alene (p = 0,54). For EMS n = 3; for MCAo n = 11; og for MCAo + EMS n = 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en vellykket EMS-prosedyre i en musemodell av MCAo-indusert slag. Dataene viser at podet vev forblir levedyktig og kan danne bindinger med hjernebarken lenge etter EMS-kirurgi. Disse funnene støtter begrunnelsen for å bruke et cerebralt muskeltransplantat for gradvis å utvikle et rikt vaskulært trofisk miljø på slagstedet. EMS er en lovende terapi for potensielt å reparere infarkt hjernevev i samme miljø.

De kritiske trinnene i protokollen inkluderer trinn 2.2.4: dette trinnet forårsaker uunngåelig traumer til TM, noe som kan redusere evnen til å binde seg til cortex og frigjøre trofiske faktorer. Pass på å begrense TM-traumer i den grad det er mulig. En alternativ strategi for å redusere vevstraumer er å dissekere TM direkte fra skallen bare ved dorsalgrensen og gi avkall på myotomien. I dette tilfellet ville TM bli løftet bort fra skallen (i stedet for fullt reflektert), og kraniotomien ville bli utført med kraniotomiboret under muskelen. Dette reduserer mengden ledig plass til å utføre dette trinnet, men igjen kan redusere TM traumer. Videre er ekstrem omsorg og praksis nødvendig i trinn 2.2.5 og 2.2.6, for å forhindre skade på den underliggende hjernebarken under kraniotomi og manipulering av dura.

Denne EMS-modellen er et naturlig supplement til den veletablerte MCAo-modellen. Fordi MCAo-modellen nøye simulerer patofysiologien til iskemi og vaskulær nettverksskade, som er vanlig hos menneskelige pasienter, vil MCAo + EMS-modellen sannsynligvis ha et høyt nivå av oversettbarhet til mennesker. EMS-modellen som presenteres her, er den første terapeutiske intervensjonen som har blitt studert for iskemisk slag i preklinisk innstilling som bare er avhengig av autologt vev. Videre, fordi TM-transplantatet er organisk og autologt, kan det demonstrere parakrine signalinteraksjoner med den tilstøtende skadede hjernen som tjener til å regulere frigivelsen av trofiske faktorer til optimale nivåer på forskjellige tidspunkter.

Mens hjerneslag skaper et proangiogent miljø og stimulerer angiogenesen selv26, er den inneboende responsen etter hjerneslag ikke tilstrekkelig til å forbedre vaskulær forsyning i det skadede området på grunn av subthreshold nivåer av angiogene faktorer. Her forbedret EMS ytterligere FGF-surt proteinuttrykk sammenlignet med slagdyr. Dette proteinet kontrollerer indirekte neovaskularisering i samspill med andre vekstfaktorer. FGF-syre fungerer også som en nevrotrofisk faktor, og fremmer nevrobeskyttelse og nevrogenese27,28. Noen av de nevroprotektive effektene av FGF-syre er mediert ved aktivering av AKT- og MAPK/EPK-veier29. I tillegg til FGF var det også redusert ekspresjon av proteinet osteopontin. Osteopontin er et proinflammatorisk, pleotropisk cytokin som i økende grad blir anerkjent for sin rolle i flere nevropatologier og vevsremodelleringsprosesser, blant andre funksjoner. Osteopontins rolle i hjerneslag er fortsatt usikker30. Nyere studier på mennesker peker imidlertid på osteopontin som en dårlig prognostisk faktor etter hjerneslag. En reduksjon i serum osteopontinnivåer etter slag ble vist i en studie for å forutsi gunstige utfall (modifisert Rankin-skalascore < 2 ved 90 dager) hos mennesker med slag31. En annen studie viste et doseavhengig forhold mellom høyere nivåer av plasma osteopontin og utfall av død og funksjonshemming hos mennesker etter hjerneslag32. I tråd med disse kliniske studiene antyder dataene her at redusert osteopontin etter EMS kan fremme et antiinflammatorisk miljø for å øke dannelsen av neo-kar. Samlet sett peker differensialuttrykket av FGF-syre og osteopontin mot mekanismer som styrer angiogenesen etter EMS i denne musemodellen og øker sannsynligheten for at prosedyren som også kan føre til nevrobeskyttelse og nevroregenerering i tillegg til angiogenese.

Det er noen potensielle begrensninger i denne prosedyren. Måling av cerebral flyt på grunn av økt blodkartetthet er utfordrende i denne prosedyren, da vanlige prosedyrer for laserdoppler eller laserspeckle flowmeter påvirkes av tilstedeværelsen av temporalis muskel på toppen av cortex som forhindrer ekte blodmåling på kortikal overflate. Dermed kan denne prosedyren trenge mer sofistikert, men sjelden tilgjengelig, liten gnager MR-skanning hvis sanntids strømningsmåling er nødvendig. Imidlertid støtter bruken av måling av blodkartetthet indirekte suksessen til EMS-prosedyren for å forbedre angiogenese som foreslått av våre data. En annen begrensning er den invasive karakteren av EMS-intervensjoner på toppen av MCAo, som i seg selv er en invasiv prosedyre. Selv om det ikke var økt dødelighet med EMS i denne studien sammenlignet med MCAo bare, kan kravet til hemicraniectomy begrense fremtidig oversettbarhet for alle typer slag. I klinisk praksis trenger imidlertid >10 % av pasientene med stort iskemisk hjerneslag hemicraniectomy for å håndtere økt intrakranielt trykk23, og denne EMS-modellen kan ha translasjonsverdi spesielt for denne undergruppen av slagpasienter. Til slutt ble tidspunktet 4 timer etter MCAo for utførelse av EMS valgt for å falle innenfor standard behandlingsvindu for rT-PA for de fleste menneskelige pasienter, selv om fremtidige studier vil bruke senere tidspunkter for å evaluere det terapeutiske vinduet for EMS.

Samlet sett gir EMS-modellen et godt tolerert alternativ for å indusere angiogenese etter iskemisk slag, og i tillegg til den potensielle kliniske oversettelsen, kan den brukes i fremtidige studier som undersøker patofysiologien til hjerneslag og angiogenese.

EMS-modellen beskrevet her tilbyr en sikker metode for å oppnå cerebral angiogenese for preklinisk studie, og unngår behovet for farmakologiske inngrep, noe som ofte fører til uønskede bivirkninger eller ukontrollert angiogenese. Mange pasienter med store iskemiske slag krever en hemicraniectomy i løpet av sitt kliniske kurs for å håndtere økende intrakranielt trykk. Denne EMS-prosedyren, som også inkluderer hemicraniectomy hos mus for muskeltransplantasjon, kan gi preklinisk konseptbevis for translasjonell anvendelse av EMS ved iskemisk slag. Derfor har denne modellen potensial til å utvide kunnskapen om nevrovaskulær utvinning etter et iskemisk slag og for å lette utviklingen av innovasjon, som er behovet for timen, i terapi for slagoverlevende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Research Excellence Program-UConn Health (til Ketan R Bulsara og Rajkumar Verma) og UConn Health oppstart (til Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

Nevrovitenskap utgave 184
En modell for encefalomyosynangiose behandling etter Middle Cerebral Artery okklusjon-indusert hjerneslag hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter