Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס לאחר שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימת עורקים מוחיים באמצע בעכברים

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול נועד לספק שיטות לאנצפלומיוסיננגיוזיס - השתלה של דש שריר טמפורליס וסקולרי על פני השטח של רקמת מוח איסכמית - לטיפול בשבץ איסכמי שאינו מויאמויה. יעילות הגישה בהגברת אנגיוגנזה מוערכת באמצעות מודל חסימה חולף של עורק מוחי אמצעי בעכברים.

Abstract

אין טיפול יעיל זמין עבור רוב החולים הסובלים משבץ איסכמי, מה שהופך את הפיתוח של טיפולים חדשניים הכרחי. יכולתו של המוח לרפא את עצמו לאחר שבץ איסכמי מוגבלת על ידי אספקת דם לא מספקת באזור הפגוע. אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך נוירוכירורגי המשיג אנגיוגנזה בחולים עם מחלת מויאמויה. זה כרוך craniotomy עם מיקום של שתל שריר temporalis כלי הדם על פני השטח של המוח איסכמי. EMS מעולם לא נחקר במסגרת שבץ איסכמי חריף בעכברים. ההשערה המניעה את המחקר היא ש-EMS משפר את האנגיוגנזה המוחית במשטח קליפת המוח המקיף את שתל השריר. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך ומספק נתונים ראשוניים התומכים בהיתכנות וביעילות של גישת EMS. בפרוטוקול זה, לאחר 60 דקות של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (MCAo), עכברים שובצו באקראי לטיפול MCAo או MCAo + EMS. ה- EMS בוצע 3-4 שעות לאחר החסימה. העכברים הוקרבו 7 או 21 יום לאחר טיפול MCAo או MCAo + EMS. כדאיות השתל הטמפורליס נמדדה באמצעות בדיקת ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחת-טטרזוליום רדוקטאז. מערך אנגיוגנזה של עכבר כימת ביטוי חלבונים אנגיוגניים ונוירומודולטוריים. אימונוהיסטוכימיה שימשה להדמיה של קשר שתלים עם קליפת המוח ושינוי בצפיפות כלי הדם. הנתונים הראשוניים כאן מצביעים על כך ששריר מושתל נשאר בר קיימא 21 יום לאחר EMS. אימונוסטינינג הראה השתלה מוצלחת ועלייה בצפיפות כלי הדם ליד השתלת השריר, מה שמעיד על אנגיוגנזה מוגברת. הנתונים מראים כי EMS מגביר את גורם הגדילה של פיברובלסטים (FGF) ומוריד את רמות האוסטאופונטין לאחר שבץ מוחי. בנוסף, EMS לאחר שבץ לא העלה את התמותה מה שמרמז על כך שהפרוטוקול בטוח ואמין. הליך חדשני זה יעיל ונסבל היטב ויש לו פוטנציאל לספק מידע על התערבויות חדשניות לאנגיוגנזה משופרת לאחר שבץ איסכמי חריף.

Introduction

שבץ איסכמי הוא פגיעה נוירו-וסקולרית חריפה עם sequelae כרונית הרסנית. רוב הסובלים משבץ מוחי, 650,000 בשנה, בארה"ב סובלים מנכות תפקודית קבועה1. אף אחד מהטיפולים הזמינים אינו מעניק הגנה עצבית והתאוששות תפקודית לאחר השלב החריף של שבץ איסכמי. לאחר שבץ איסכמי חריף, אספקת הדם הישירה והבטוחה פוחתת, מה שמוביל לתפקוד לקוי של תאי המוח והרשתות, וכתוצאה מכך לליקויים נוירולוגיים פתאומיים 2,3. שיקום אספקת הדם לאזור האיסכמי נותר המטרה הראשונה במעלה של טיפול בשבץ מוחי. לפיכך, שיפור אנגיוגנזה כדי לקדם את אספקת הדם בשטח איסכמי היא גישה טיפולית מבטיחה; עם זאת, שיטות שנחקרו בעבר לקידום אנגיוגנזה לאחר שבץ, כולל אריתרופואיטין, סטטינים וגורמי גדילה, הוגבלו על ידי רמות בלתי מתקבלות על הדעת של רעילות או תרגום4.

אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך כירורגי המשפר אנגיוגנזה מוחית בבני אדם עם מחלת moyamoya, מצב של עורקי גולגולת צרים שלעתים קרובות מוביל לשבץ. EMS כולל ניתוק חלקי של קטע כלי הדם של שריר הטמפורליס של המטופל מהגולגולת, ולאחר מכן קרניוטומיה והשתלה של השריר על קליפת המוח הפגועה. הליך זה נסבל היטב ומשרה אנגיוגנזה מוחית, הפחתת הסיכון לשבץ איסכמי בחולים עם מחלת moyamoya 5,6. לפיכך, ההליך משמש במידה רבה תפקיד מניעתי בחולים אלה. לאנגיוגנזה שנגרמת על ידי הליך זה עשוי להיות גם תפקיד בקידום הגנה נוירו-וסקולרית והתאוששות בסביבה של שבץ איסכמי. דו"ח זה תומך בהשערה כי אנגיוגנזה שנוצרה על ידי EMS יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה ואת האפשרויות הטיפוליות עבור איסכמיה מוחית.

לצד EMS, ישנן מספר גישות פרמקולוגיות וכירורגיות לשיפור אנגיוגנזה, אך יש להן מספר מגבלות. גישות פרמקולוגיות כגון מתן פקטור גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) נמצאו כבלתי מספקות או אפילו מזיקות בשל מספר מגבלות, כולל היווצרות של פלקסוסים כאוטיים, לא מאורגנים, דולפים ופרימיטיביים של כלי הדם, הדומים לאלה שנמצאו ברקמות הגידול 7,8 ואין להם השפעות מועילות בניסויים קליניים9.

גישות כירורגיות כוללות אנסטומוזיס ישיר כגון אנסטומוזיס עורק רקיע-עורקי מוח אמצעי-שטחי שטחי, אנסטומוזיס עקיף כגון אנצפלו-דורו עורקי-סיננגיוזיס (EDAS), אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS), ושילובים של אנסטומוזיס ישיר ועקיף10. כל ההליכים הללו מאתגרים מאוד מבחינה טכנית ותובעניים בבעלי חיים קטנים, למעט EMS. בעוד שההליכים האחרים דורשים אנסטומוזיס וסקולרי מורכב, EMS דורש השתלת שריר פשוטה יחסית. יתר על כן, הקרבה של שריר temporalis לקליפת המוח עושה את זה בחירה טבעית עבור השתלה, כפי שהוא לא צריך להיות נכרת לחלוטין או מנותק מאספקת הדם שלה, כפי שיהיה צורך אם שריר מרוחק יותר שימשו להשתלה.

EMS נחקר במודלים של היפופרפוזיה מוחית כרונית בחולדות 7,11. עם זאת, EMS באמצעות שתל שריר טמפורליס מעולם לא נחקר בשבץ איסכמי חריף במכרסמים. כאן אנו מתארים פרוטוקול חדש של EMS בעכברים לאחר שבץ איסכמי באמצעות מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo). כתב יד זה משמש כתיאור של שיטות ונתונים מוקדמים עבור גישה חדשנית זו של EMS בעכברים לאחר MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UConn Health ונערכו בהתאם להנחיות ארה"ב. הפרוטוקול הבא צריך לעבוד בכל מין או זן של מכרסם. כאן נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג C57BL/6 בני 8 עד 12 שבועות, התואמים לגיל ולמשקל. עכברים הוזנו בדיאטת צ'או סטנדרטית ובמים עד ליביטום. תנאי הדיור הסטנדרטיים נשמרו על 72.3 מעלות פרנהייט ולחות יחסית של 30%-70% עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.

1. הכנה לפני הניתוח

  1. יש לעקר את כל המכשירים על ידי אוטוקלבינג לפני הניתוח. יש לחטא את משטח ההפעלה עם 70% אתנול ולחמם את משטח ההפעלה ל-37°C באמצעות כרית חימום חשמלית.
  2. השתמש בתא אינדוקציה כדי להרדים את העכבר עם 4%-5% isoflurane עבור אינדוקציה. יש לספק 1.5%-2.0% איזופלוראן דרך חרוט האף לתחזוקה עד סוף הניתוח. ודא לפני הניתוח כי העכבר מורדם כראוי על ידי הערכת חוסר תגובה לצביטה מוצקה בכף הרגל האחורית ואובדן תגובת היציבה ורפלקס הימין.
  3. הניחו את העכבר על צדו השמאלי על משטח הניתוח ומרחו משחת עיניים כדי להגן על שתי העיניים.
  4. יש לגלח את השיער מעל שדה הניתוח (כלומר, גולגולת צידית ימנית בין העין לאוזן) באמצעות קוצץ חשמלי. נקו את שדה הניתוח במעגלים קונצנטריים כלפי חוץ מאמצע האתר הכירורגי, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת פובידון, וחזרו על שלבים אלה פי 2.
    הערה: בשל היותו של אתר הניתוח קרוב לעין, ייתכן שלא ניתן יהיה להסיר 150% מהאזור המקיף אתר ניתוחי כדי למנוע גירוי או פגיעה מקרית בעין.
  5. מתן מנה אחת של 0.25% bupivacaine (עד 8 מ"ג / ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקה תת עורית כמו משכך כאבים טרום ניתוחי באתר הניתוח.
  6. הגדר מיקרוסקופ כירורגי בהגדלה של 4x. המיקרוסקופ משמש לכל השלבים הכירורגיים.

2. הליך כירורגי

הערה: שלבי הניתוח מוצגים באיור 1. עבור פרוטוקול זה, שלושה עכברים הוקצו לקבוצת sham, שלושה עכברים לקבוצת EMS בלבד, 12 עכברים לקבוצת MCAo ו-23 עכברים לקבוצת MCAo + EMS.

  1. ניתוח MCAo
    הערה: MCAo הוא מודל מאופיין היטב של שבץ איסכמי במכרסמים, כפי שתואר על ידינו ואחרים12,13,14. שלבי הניתוח מתוארים כאן בקצרה. איסכמיה מוחית חולפת מוקדית הושרה על ידי MCAo ימני של 60 דקות תחת הרדמה איזופלורן ואחריו reperfusion במשך 7 או 21 ימים.
    1. בצע חתך בצוואר הגחון בקו האמצע ואחריו MCAo ימני חד צדדי על ידי קידום מונופילמנט מצופה גומי סיליקון באורך 10-11 מ"מ 6.0 מצופה גומי מהביפורקציה של עורק הצוואר הפנימי דרך גדם עורק הצוואר החיצוני. בעכברי שאם, לבצע ניתוחים זהים למעט התקדמות התפר לתוך עורק הצוואר הפנימי.
    2. מדוד טמפרטורות רקטליות באמצעות מערכת בקרת טמפרטורה, שמירה על הטמפרטורה ב ~ 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח עם כרית חימום אוטומטית.
    3. השתמש בזרימת דופלר בלייזר כדי למדוד את זרימת הדם במוח לפני החדרת התפר על ידי הצבת גשושית הדופלר כנגד הגולגולת הצידית (המתאימה לשטח MCA) ורישום הערך8. כדי לאשר את הפחתת החסימה ל-15% מזרימת הדם המוחית הבסיסית, יש להשתמש באותו הליך לאחר התקדמות התפר. כדי לאשר reperfusion, להשתמש באותו הליך לאחר הסרת התפר.
    4. יש להאכיל את כל בעלי החיים במחית רטובה עד להקרבתם ו/או שבוע לאחר הניתוח כדי להבטיח תזונה נאותה לנקודות קצה כרוניות, שכן לבעלי החיים יש גירעונות גידול לאחר שבץ.
  2. ניתוח EMS
    1. לאחר 60 דקות של MCAo, הפוך עכברים באופן אקראי לקבוצות MCAo בלבד או MCAo + EMS. בצע EMS 4 שעות לאחר MCAo (קבוצת MCAo + EMS) או ניתוח בושה לניסויים נבחרים (קבוצת EMS בלבד). החלף לזוג חדש של כפפות כירורגיות סטריליות לפני הניתוח.
      הערה: העכברים התאוששו מההרדמה לאחר 60 דקות של MCAo והורדו מחדש לפני ניתוח ה- EMS.
    2. עבור קבוצות המקבלות EMS (MCAo + EMS או EMS בלבד קבוצות), לבצע חתך עור 10-15 מ"מ עם מספריים, המשתרע מ 1-2 מ"מ rostral לאוזן ימין ל 1-2 מ"מ caudal לעין ימין.
      הערה: נעשה שימוש במספריים סטריליים כדי למנוע נזק מקרי לשרירי הטמפורליס שמתחת.
    3. הסירו את דשי העור באמצעות מלחציים וזהו באופן חזותי את שריר הטמפורליס ואת הגולגולת.
    4. לנתח באופן בוטה את שריר הטמפורליס הרחק מהגולגולת באמצעות מספריים בטכניקת התפשטות. בצע מיוטומיה 2-3 מ"מ מכוונת הגחון לאורך הגבול caudal של השריר כדי להקל על השתקפות הגחון.
    5. בצע קרניוטומיה בקוטר ~ 5 מ"מ בגולגולת מתחת לשריר הטמפורליס המוחזר באמצעות מקדחה זעירה.
    6. הסר את הדורה מאטר עם פינצטה כדי לחשוף את פני השטח pial של המוח. נקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה מקרית במוח.
    7. תפר את הגבול הגבי של שריר הטמפורליס לרקמה התת עורית של דש העור הגבי עם 6-0 חוטים מונוקריליים, מה שהופך אותו סמוק לקליפת המוח החשופה.
    8. סגרו את החתך בעור עם תפר מונופילמנט 6-0. החזירו את העכבר לכלוב שלו ועקבו אחריו עד להתאוששות מההרדמה. החזר את העכבר למתקן הדיור שלו.

3. שיקולים פוסט-ניתוחיים

  1. עקוב אחר העכברים למחלה והאתר הכירורגי לזיהום מדי יום. יש לתת מלח תת-עורי רגיל (1% נפח לפי משקל גוף) מדי יום לתמיכה בהידרציה.
  2. עקוב אחר התייבשות חמורה (ירידה במשקל הגוף >20%) עד 7 ימים לאחר הניתוח. יש לתת בולוס נוסף של 1% מלוחים תת-עוריים רגילים לפי משקל הגוף אם >20% ירידה במשקל.
  3. המשך עם זריקות, ניטור פיזיולוגי, ובדיקות אחרות ללא שיקולים מיוחדים.
    הערה: בהליך זה, השימוש באופיואידים או בתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים (NSAIDs) לטיפול לאחר הניתוח נמנע בשל ההשפעות הידועות של חומרים אלה על תוצאות שבץ או גודל אוטם בהתייעצות עם הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים 15,16,17,18. עם זאת, השימוש במשכך כאבים לאחר הניתוח מעודד מאוד לניתוח EMS עם מודלים אחרים. אנא התייעצו עם הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לשם כך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסך הכל 41 עכברים שימשו למחקר זה. לאחר שלושה מקרי מוות, אחד ב- MCAo ושניים ב- MCAo + EMS, בסך הכל 38 עכברים שימשו להשגת התוצאות המוצגות.

סטטיסטיקה
הנתונים מכל ניסוי מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (S.D.). המשמעות נקבעה באמצעות מבחן t של תלמיד לא מזווג להשוואה בין שתי קבוצות או ANOVA חד-כיווני עבור יותר משתי קבוצות, עם מבחן ניומן-קולס פוסט-הוק לתיקון עבור השוואות מרובות.

ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (מופחת)-טטרזוליום רדוקטאז (NADH-TR) מכתים
צביעה זו נעשתה כדי להעריך את הכדאיות ארוכת הטווח של השריר המושתל כמו ב- Turoczi et al.19. בקצרה, בזמן ההקרבה, דש השריר המושתל נכרת בקפידה, תוקן עם 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות, והוקפא בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינונית ב -80 מעלות צלזיוס. מספר קריוסקסוציות בעובי 12 מיקרומטר של רקמת שריר טמפורליס הוכתמו בתגובה אנזים-היסטוכימית NADH-TR. השקופיות דוגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתמיסה של טראזוליום ניטרובלו (1.8 מ"ג/ד"ל) ו-NADH (15 מ"ג/ד"ל) ב-0.05 M Tris buffer (pH 7.6). מגיב tetrazolium שאינו בשימוש הוסר באמצעות הגדלת ואחריו ירידה בריכוזים של אצטון. הערכה כמותית של שריר מוכתם NADH-tetrazolium בוצעה על תמונות שרירים שצולמו בהגדלה של פי 40.

מחקרי חיסון
Immunostaining שימש כדי לדמיין קשר שתל שריר עם קליפת המוח ואת צפיפות כלי הדם בצומת של שריר וקליפת המוח20,21. להדמיה של קשר שרירים עם רקמת המוח, עכברים שעברו ניתוח EMS שימשו כאן. בסוף כל נקודת זמן בהתאמה, העכברים הורדו בזריקת אוורטין (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף), ולאחר מכן זלוף עם 1x PBS המכיל 5 mM חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) וקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד. הגולגולת נחתכה בקפידה כדי למנוע ניתוק מקרי של השתלת שריר טמפורליס (TM) מקליפת המוח. לאחר מכן הופרדה השתלת TM מעל קליפת המוח משריר הטמפורליס שנותר. המוח הוסר בזהירות ולאחר מכן תוקן ב-4% פרפורמלדהיד בן לילה. לאחר מכן, המוח המקובע התייבש עם 30% סוכרוז ב-PBStime אחד עד שהמוח שקע לתחתית הבקבוקון (בערך 1-3 ימים). מקטעי רקמה בגודל 30 מיקרומטר נחתכו במיקרוטום קפוא והורכבו על שקופיות.

עבור אימונוסטיין של כלי דם בקליפת המוח האיפסילטרלית, עכברי MCAo ו- MCAo + EMS הוקרבו, הוטבעו, תוקנו ועובדו כנ"ל. פרוסות מוח בגודל 30 מיקרומטר נחתכו על מיקרוטום קפוא והורכבו על צד זכוכית. שליפת אנטיגן נעשתה באמצעות חיץ ציטראט (pH 6.0) והקטעים דוגרו עם חיץ חוסם ואחריו דגירה לילה עם נוגדנים ראשוניים, אקטין שרירי שלד אנטי-אלפא 1:200, ולקטין-Dy59421,22. שלושה מקטעי מוח קורונלים לכל עכבר (n = 5 עכברים/קבוצה; סה"כ = 15 חלקים) צולמו בין 0.45 מ"מ ל-0.98 מ"מ מברגמה, הוכתמו והודמיו לכימות בהגדלה של פי 20 בצומת אזורי הליבה האיסכמית והפנומברה. צופה עיוור כימת את צפיפות כלי הדם החיוביים של לקטין בפרנכימה המוחית באמצעות תוכנת ImageJ.

השתלת שריר נשארת בת קיימא גם 21 יום לאחר EMS
אחד התנאים המוקדמים להצלחה של ניתוח זה הוא הכדאיות ארוכת הטווח של שריר הטמפורליס המושתל. השתלת TM הראתה נזק חולף לתאי שריר 7 ימים לאחר הניתוח בשריר מושתל לעומת שריר בקרה (71.32% הישרדות תאי שריר ± 16.64% לעומת 97.19% ± 3.81%). עם זאת, הבדל זה בין שריר מושתל לשריר הביקורת נעלם, והשרירים התאוששו לחלוטין 21 יום לאחר הניתוח (98.22% ± 3.965 לעומת 96.87% ± 2.27%; איור 2A).

שתלי שרירים יוצרים קשרים רופפים עם רקמת המוח
השתלה מוצלחת של שריר הטמפורליס על פני קליפת המוח היא דרישה ראשונה במעלה להצלחת מודל זה. גם במודל EMS + MCAo וגם במודל EMS בלבד, השתלות השריר הטמפורליס נדבקו למשטח קליפת המוח 21 יום לאחר ה-EMS, מה שמרמז על ניתוח מוצלח, השתלת שתלים והדבקה (איור 1B ואיור 2B).

צפיפות כלי הדם עולה בקליפת המוח הפרילסיונלית לאחר EMS
שבץ חריף מוביל לירידה חריפה בזרימת הדם במוח, עיכוב בגיוס כלי דם נלווים, הנבטת כלי דם לא תקינים ואנגיוגנזה לא מתפקדת, התורמים לתוצאות שבץ לקויות23. EMS מגדיל באופן משמעותי את שטח הפנים של כלי הדם ואת הצפיפות המשולבת בקליפת המוח הפרילסיונלית לאחר שבץ (p < 0.05 לעומת MCAo בלבד; איור 3).

ניתוח של חלבונים אנגיוגניים ונוירומודולטוריים
מערך אנגיוגנזה של עכבר שימש להשוואת ביטוי של חלבונים אנגיוגניים ונוירומודולטוריים 7 ימים ו-21 ימים לאחר MCAo בעכברי MCAo בלבד לעומת MCAo + EMS לפי הוראות היצרן24. תוכנת ImageJ שימשה לכימות צפיפות הפיקסלים עבור כל נקודת נתונים של כתם נקודות החלבון. הנתונים נרשמו כיחס בין הצפיפות של כל חלבון שנותח לבין הצפיפות הממוצעת של התקנים עבור כל כתם.

גורם גדילה פיברובלסט (FGF)-חומצי מווסת כלפי מעלה ואוסטאופונטין מווסת לאחר EMS
תוצאות מערך החלבונים הראו עלייה משמעותית ברמות החלבון של FGF-חומצי (0.677 ± 0.007 לעומת 0.585 ± 0.014, p = 0.045), גורם אנגיוגני רב עוצמה, וירידה ברמות האוסטאופונטין, מולקולה רב-תכליתית המתבטאת במצבים דלקתיים (0.692 ± 0.007 לעומת 0.758 ± 0.014, p = 0.048) בקבוצת MCAo + EMS 21 יום לאחר שבץ, מה שמרמז על שיפור באנגיוגנזה ובהגנה העצבית (איור 4A).

תוצאות תמותה עבור EMS לאחר שבץ מוחי
גם MCAo וגם EMS הן טכניקות כירורגיות פולשניות שעלולות לגרום לתמותה מסוימת בעכברים. בניסוי זה, הייתה בין 10%-11% תמותה בעכברים 21 יום לאחר ניתוח MCAo, שהוא שיעור תמותה מקובל לעכברים שהיו נתונים ל-60 דקות של MCAo14. ביצוע EMS בעכברים לאחר MCAo לא העלה את התמותה (איור 4B) מה שמרמז על סבילות לניתוח EMS גם לאחר MCAo.

Figure 1
איור 1. הליך EMS שלב לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo): (A) שלב 1. חתך בעור נעשה מעל שטח עורק המוח האמצעי הימני. העור והרקמות התת עוריות משתקפים, וחושפים את שריר הגולגולת והטמפורליס. שלב 2. שריר הטמפורליס מנותח הרחק מהגולגולת ומשתקף בגחון. שלב 3. מבוצעת קרניוטומיה (4-5 מ"מ) והדורה מוסרת בעדינות. שלב 4. שריר הטמפורליס ממוקם ישירות על פני המוח כדי לכסות את קליפת המוח החשופה. שלב 5. הקצה הגבי של שריר הטמפורליס נתפר לרקמה התת עורית של דש העור הגבי, סמוק עם פני המוח. שלב 6. החתך נסגר, והעכבר מוסר מההרדמה ומוחזר לכלוב שלו. חלק זה של הדמות שונה מ25. (B) סכמת מושגית לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) בשבץ מוחי הנגרם על ידי MCAo. קיצורים: FGF = גורם גדילה פיברובלסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. מחקרי אימונוסטינינג. (A) שתלי שריר טמפורליס שומרים על יכולת הכדאיות. השתלות שריר טמפורליות (EMS) על רקמת קליפת המוח האיסקמית שומרות על כדאיות גבוהה. (משמאל) תמונה מייצגת של ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (מופחת)-tetrazolium reductase-תאי רקמת שריר מוכתמים משליטה (שריר נאיבי מהצד הנגדי) ושריר מושתל ב 7 ימים לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) + אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) ניתוח. חץ שחור () מציג תאים פגומים. (זכות) כימות תאי שריר חיים/מתים. תאי שריר 7 ימים לאחר EMS מראים נזק קל (p < 0.1; t-test) שהתאושש לחלוטין לאחר 21 ימים. (n = 5 עכברים/נקודות זמן = סה"כ 10 עכברים בקבוצה זו) הנתונים ממוצעים ± סרגל סולם S.D. = 20 מיקרומטר. (B) הדבקה של שריר טמפורליס מושתל עם קליפת המוח 21 יום לאחר ניתוח EMS. רקמות EMS מוכתמות בנוגדן אקטין שרירי שלד אנטי-אלפא (ירוק) ולקטין-Dy594 (אדום; סמן כלי דם) (n = 3 עכברים). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) מעלה את צפיפות כלי הדם בנגעים איסכמיים 21 יום לאחר שבץ מוחי . (A) תמונות מייצגות של מקטעי מוח קורונליים מעכברים הנתונים (משמאל) לחסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) או MCAo + EMS (מימין) ומוכתמים בלקטין L. esculentum (עגבניות) Lectin-Dy594, הנקשר לגליקופרוטאינים בקרום הבסיסי של תאי האנדותל. גרפים הם אזורים מכמתים. עכברי MCAo + EMS הראו רשת אנדותל גבוהה יותר באמצעות פרמטרים viz. שטח שבר כלי הדם ( B) וצפיפות משולבת (C). **p < 0.01 (מבחן t לא מזווג), בעוד שעכברי MCAo בלבד הראו נזק קרוב לנגע האיסכמי (קו מקווקו). N = 5 עכברים/קבוצה = 10 עכברים בסך הכל. הנתונים ממוצעים ± סרגל סולם S.D. = 100 מיקרומטר. קיצורים: קונטרה = צד קונטרלטרלי; איפסי =צד איפסילטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אנצפלומיוסיננגיוזיס מווסת חלבונים אנגיוגניים לאחר שבץ . (A) מערך אנגיוגנזה של עכבר (ARY015) שימש להערכה בו-זמנית של הרמות היחסיות של 53 חלבונים הקשורים לאנגיוגנזה של עכברים לאחר חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAo) ו-MCAo + EMS (יום 21 לאחר MCAo) בליזטים של רקמת המוח מקליפת המוח הפרילציונית. ניתוח כמותי מראה כי ניתוח EMS הפחית באופן משמעותי את האוסטאופונטין והגדיל את גורם הגדילה הפיברובלסטים (FGF)-חלבון חומצי לאחר שבץ (*p < 0.05 או **p < 0.01) לעומת MCAo איפסילטרלי. נתונים ממוצעים ± S.D.; n = 3 עכברים/קבוצה/נקודת זמן = סה"כ 15 עכברים. (B) EMS לא העלה את התמותה לאחר שבץ מוחי (MCAo). עקומת ההישרדות של קפלן מאייר מראה כי EMS + MCAO לא שינו את התמותה לאחר שבץ מוחי לעומת MCAO בלבד (p = 0.54). עבור EMS n = 3; עבור MCAo n = 11; ועבור MCAo + EMS n = 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך EMS מוצלח במודל עכבר של שבץ מוחי המושרה על-ידי MCAo. הנתונים מראים כי רקמה מושתלת נשארת בת קיימא ויכולה ליצור קשרים עם קליפת המוח זמן רב לאחר ניתוח EMS. ממצאים אלה תומכים ברציונל של שימוש בשתל שריר מוחי כדי לפתח בהדרגה סביבה טרופית עשירה בכלי הדם במקום של שבץ. EMS הוא טיפול מבטיח לתיקון פוטנציאלי של רקמת מוח אוטמת באותה סביבה.

השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים את שלב 2.2.4: שלב זה גורם לטראומה בלתי נמנעת ל-TM, מה שעלול להפחית את יכולתו להתחבר לקליפת המוח ולשחרר גורמים טרופיים. הקפידו להגביל את טראומת המ"ט ככל האפשר. אסטרטגיה חלופית להפחתת טראומה מרקמתית היא לנתח בבוטות את ה-TM מהגולגולת רק בגבול הגבי שלה ולוותר על המיוטומיה. במקרה זה, ה- TM יוסר הרחק מהגולגולת (במקום להשתקף במלואו), והקרניוטומיה תבוצע עם תרגיל הקרניוטומיה מתחת לשריר. זה מקטין את כמות השטח הזמין לביצוע שלב זה, אך שוב עשוי להפחית את טראומת המ"ט. יתר על כן, זהירות ותרגול קיצוניים נחוצים בשלבים 2.2.5 ו -2.2.6, למניעת פגיעה בקליפת המוח הבסיסית במהלך קרניוטומיה ומניפולציה של הדורה.

מודל EMS זה הוא נספח טבעי למודל MCAo המבוסס היטב. מכיוון שמודל MCAo מדמה באופן הדוק את הפתופיזיולוגיה של איסכמיה ונזק לרשת כלי הדם, הנפוצה בחולים אנושיים, סביר להניח שלמודל MCAo + EMS תהיה רמה גבוהה של יכולת תרגום לבני אדם. מודל ה- EMS המוצג כאן הוא ההתערבות הטיפולית הראשונה שנחקרה עבור שבץ איסכמי בסביבה הפרה-קלינית המסתמכת רק על רקמה אוטולוגית. יתר על כן, מכיוון ששתל ה-TM הוא אורגני ואוטולוגי, הוא עשוי להדגים אינטראקציות איתות פאראקריניות עם המוח הפגוע הסמוך, המשמשות לוויסות שחרורם של גורמים טרופיים לרמות אופטימליות בנקודות זמן שונות.

בעוד שבץ יוצר סביבה פרואנגיוגנית וממריץ את האנגיוגנזה עצמה26, התגובה הפנימית שלאחר השבץ אינה מספיקה כדי לשפר את אספקת כלי הדם באזור הפגוע בשל רמות תת-קרקעיות של גורמים אנגיוגניים. כאן, EMS שיפר עוד יותר את ביטוי החלבון החומצי FGF בהשוואה לבעלי חיים עם שבץ מוחי בלבד. חלבון זה שולט בעקיפין על ניאו-וסקולריזציה בתיאום עם גורמי גדילה אחרים. FGF-חומצי פועל גם כגורם נוירוטרופי, המקדם הגנה עצבית ונוירוגנזה27,28. חלק מההשפעות הנוירו-פרוטקטיות של FGF-חומצי מתווכות על ידי הפעלה של מסלולי AKT ו-MAPK/EPK29. בנוסף ל-FGF, היה גם ביטוי מופחת של החלבון אוסטאופונטין. אוסטאופונטין הוא ציטוקין פרו-דלקתי, פלוטרופי, אשר מוכר יותר ויותר על תפקידו במספר נוירופתולוגיות ותהליכי שיפוץ רקמות, בין היתר. תפקידו של אוסטאופוטין בשבץ עדיין אינו ודאי30. עם זאת, מחקרים אחרונים בבני אדם מצביעים על אוסטאופונטין כגורם פרוגנוסטי גרוע לאחר שבץ. ירידה ברמות האוסטאופונטין בסרום לאחר שבץ מוחי הוכחה במחקר אחד כמנבאת תוצאות חיוביות (שינוי ציון סולם רנקין < 2 ב-90 יום) במטופלים אנושיים עם שבץמוחי 31. מחקר אחר הראה קשר תלוי מינון בין רמות גבוהות יותר של אוסטאופונטין פלזמה לבין תוצאות של מוות ונכות בחולים אנושיים לאחר שבץ32. בהתאם למחקרים קליניים אלה, הנתונים כאן מצביעים על כך שאוסטאופונטין מופחת לאחר EMS עשוי לקדם סביבה אנטי דלקתית להגברת היווצרות כלי הדם הניאו-כלי. באופן כללי, הביטוי הדיפרנציאלי של FGF-חומצי ואוסטאופונטין מצביע על מנגנונים השולטים באנגיוגנזה בעקבות EMS במודל עכבר זה ומגדיל את הסבירות שההליך שיכול להביא גם להגנה עצבית והתחדשות עצבית בנוסף לאנגיוגנזה.

ישנן כמה מגבלות פוטנציאליות של הליך זה. מדידת זרימה מוחית עקב צפיפות כלי דם מוגברת היא מאתגרת בהליך זה, שכן הליכים נפוצים של דופלר לייזר או מד זרימת כתם לייזר מושפעים מנוכחות של שריר טמפורליס בחלק העליון של קליפת המוח אשר מונעים מדידת דם אמיתית על פני קליפת המוח. לפיכך, הליך זה עשוי להזדקק לסריקת MRI מתוחכמת יותר, אך לעתים רחוקות זמינה, של מכרסמים קטנים אם נדרשת מדידת זרימה בזמן אמת. עם זאת, השימוש במדידת צפיפות כלי הדם תומך בעקיפין בהצלחת הליך EMS בשיפור אנגיוגנזה כפי שמציעים הנתונים שלנו. מגבלה נוספת היא האופי הפולשני של התערבויות EMS בחלק העליון של MCAo, שהוא עצמו הליך פולשני. אמנם לא הייתה תמותה מוגברת עם EMS במחקר זה בהשוואה ל- MCAo בלבד, אך הדרישה לכריתת המיקרניקטומיה עשויה להגביל את יכולת התרגום העתידית שלה לכל סוגי השבץ. עם זאת, בפרקטיקה הקלינית, >10% מהחולים עם שבץ איסכמי גדול זקוקים לכריתת המיקרניקטומיה כדי לנהל לחץ תוך גולגולתי מוגבר23, ומודל EMS זה עשוי להיות בעל ערך תרגומי עבור תת-קבוצה זו של חולי שבץ בפרט. לבסוף, נקודת הזמן של 4 שעות לאחר MCAo לביצועים של EMS נבחרה ליפול בתוך חלון הטיפול הסטנדרטי של rT-PA עבור רוב החולים האנושיים, אם כי מחקרים עתידיים ישתמשו בנקודות זמן מאוחרות יותר כדי להעריך את החלון הטיפולי עבור EMS.

באופן כללי, מודל EMS מספק אפשרות נסבלת היטב לגרימת אנגיוגנזה לאחר שבץ איסכמי, ובנוסף לתרגום הקליני הפוטנציאלי שלו, עשוי לשמש במחקרים עתידיים שיבחנו את הפתופיזיולוגיה של שבץ ואנגיוגנזה.

מודל ה- EMS המתואר כאן מציע שיטה בטוחה להשגת אנגיוגנזה מוחית למחקר פרה-קליני, ומייתר את הצורך בהתערבויות פרמקולוגיות, שלעתים קרובות מובילות לתופעות לוואי לא רצויות או לאנגיוגנזה בלתי מבוקרת. חולים רבים עם שבץ איסכמי גדול זקוקים לכריתת המיקרניקטומיה במהלך הקליני שלהם כדי להתמודד עם לחץ תוך גולגולתי גובר. הליך EMS זה, הכולל גם כריתת המיקרניקטומיה בעכברים להשתלת שרירים, עשוי לספק הוכחת היתכנות פרה-קלינית ליישום תרגומי של EMS בשבץ איסכמי. לכן, למודל זה יש פוטנציאל להרחיב את הידע על התאוששות נוירו-וסקולרית לאחר שבץ איסכמי ולהקל על פיתוח חדשנות, שהם צורך השעה, בטיפולים לניצולי שבץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מצוינות מחקרית - UConn Health (לקטאן ר בולסארה וראג'קומאר ורמה) וסטארט-אפ הבריאות UConn (לראג'קומאר ורמה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 184
מודל לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס לאחר שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימת עורקים מוחיים באמצע בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter