Summary
Protokollen har til formål at tilvejebringe metoder til encephalomyosynangiosis-podning af en vaskulær temporalis muskelklap på den piale overflade af iskæmisk hjernevæv - til behandling af ikke-moyamoya akut iskæmisk slagtilfælde. Tilgangens effektivitet i at øge angiogenese evalueres ved hjælp af en forbigående mellemcerebral arterieokklusionsmodel hos mus.
Abstract
Der er ingen effektiv behandling tilgængelig for de fleste patienter, der lider af iskæmisk slagtilfælde, hvilket gør udvikling af nye terapeutiske midler bydende nødvendigt. Hjernens evne til at helbrede sig selv efter iskæmisk slagtilfælde er begrænset af utilstrækkelig blodforsyning i det berørte område. Encephalomyosynangiosis (EMS) er en neurokirurgisk procedure, der opnår angiogenese hos patienter med moyamoya sygdom. Det involverer kraniotomi med placering af en vaskulær temporalis muskeltransplantat på den iskæmiske hjerneoverflade. EMS er aldrig blevet undersøgt i forbindelse med akut iskæmisk slagtilfælde hos mus. Hypotesen, der driver denne undersøgelse, er, at EMS forbedrer cerebral angiogenese ved den kortikale overflade, der omgiver muskeltransplantatet. Den protokol, der vises her, beskriver proceduren og giver indledende data, der understøtter gennemførligheden og effektiviteten af EMS-tilgangen. I denne protokol blev mus efter 60 minutters forbigående mellemcerebral arterieokklusion (MCAo) randomiseret til enten MCAo- eller MCAo + EMS-behandling. EMS blev udført 3-4 timer efter okklusion. Musene blev ofret 7 eller 21 dage efter MCAo eller MCAo + EMS behandling. Temporalis graft levedygtighed blev målt ved anvendelse af nicotinamid-adenin-dinukleotid reduceret-tetrazoliumreduktassay. Et museangiogenesearray kvantificerede angiogent og neuromodulerende proteinekspression. Immunohistokemi blev brugt til at visualisere graftbinding med hjernebark og ændring i kardensitet. De foreløbige data her tyder på, at podet muskel forblev levedygtig 21 dage efter EMS. Immunostaining viste vellykket graftimplantation og stigning i kardensitet nær muskeltransplantatet, hvilket indikerer øget angiogenese. Data viser, at EMS øger fibroblastvækstfaktor (FGF) og nedsætter osteopontinniveauer efter slagtilfælde. Derudover øgede EMS efter slagtilfælde ikke dødeligheden, hvilket tyder på, at protokollen er sikker og pålidelig. Denne nye procedure er effektiv og veltolereret og har potentialet til at give information om nye interventioner for forbedret angiogenese efter akut iskæmisk slagtilfælde.
Introduction
Iskæmisk slagtilfælde er en akut neurovaskulær skade med ødelæggende kroniske følgevirkninger. De fleste af de overlevende efter slagtilfælde, 650.000 om året, i USA lider af permanent funktionsnedsættelse1. Ingen af de tilgængelige behandlinger giver neurobeskyttelse og funktionel genopretning efter den akutte fase af iskæmisk slagtilfælde. Efter et akut iskæmisk slagtilfælde formindskes både direkte og indirekte blodforsyninger, hvilket fører til dysfunktion af hjerneceller og netværk, hvilket resulterer i pludselige neurologiske underskud 2,3. Restaurering af blodforsyningen til den iskæmiske region er fortsat det vigtigste mål for slagtilfældebehandling. Således er forbedring af angiogenese for at fremme blodforsyningen i det iskæmiske område en lovende terapeutisk tilgang; Tidligere undersøgte metoder til fremme af angiogenese efter slagtilfælde, herunder erythropoietin, statiner og vækstfaktorer, har imidlertid været begrænset af uacceptable niveauer af toksicitet eller oversættelighed4.
Encephalomyosynangiosis (EMS) er en kirurgisk procedure, der forbedrer cerebral angiogenese hos mennesker med moyamoya sygdom, en tilstand af indsnævrede kraniale arterier, der ofte fører til slagtilfælde. EMS involverer delvis løsrivelse af en vaskulær del af patientens temporalis muskel fra kraniet efterfulgt af kraniotomi og podning af musklen på den berørte cortex. Denne procedure tolereres godt og inducerer cerebral angiogenese, hvilket reducerer risikoen for iskæmisk slagtilfælde hos patienter med moyamoya sygdom 5,6. Således tjener proceduren stort set en forebyggende rolle hos disse patienter. Angiogenese forårsaget af denne procedure kan også have en rolle i at fremme neurovaskulær beskyttelse og genopretning i indstillingen af iskæmisk slagtilfælde. Denne rapport understøtter hypotesen om, at angiogenese forårsaget af EMS har potentialet til at udvide forståelsen af og terapeutiske muligheder for cerebral iskæmi.
Udover EMS er der flere farmakologiske og kirurgiske tilgange til forbedring af angiogenese, men de har flere begrænsninger. Farmakologiske tilgange såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) administration har vist sig at være utilstrækkelig eller endda skadelig på grund af flere begrænsninger, herunder dannelsen af kaotiske, uorganiserede, utætte og primitive vaskulære plexuser, der ligner dem, der findes i tumorvævene 7,8 og ikke har nogen gavnlige virkninger i kliniske forsøg9.
Kirurgiske tilgange omfatter direkte anastomose såsom overfladisk temporal arterie-mellem cerebral arterieanastomose, indirekte anastomose såsom encephalo-duro arterio-synangiose (EDAS), encephalomyosynangiosis (EMS) og kombinationer af direkte og indirekte anastomose10. Alle disse procedurer er meget teknisk udfordrende og krævende hos små dyr, bortset fra EMS. Mens de andre procedurer kræver kompleks vaskulær anastomose, kræver EMS et relativt simpelt muskeltransplantat. Desuden gør nærheden af temporalis-musklen til cortex det til et naturligt valg til podning, da det ikke behøver at blive fuldstændigt udskåret eller afbrudt fra dets blodforsyning, som det ville være nødvendigt, hvis en fjernere muskel blev brugt til podning.
EMS er blevet undersøgt i kroniske cerebrale hypoperfusionsmodeller hos rotter 7,11. Ems ved hjælp af en temporalis muskeltransplantat er imidlertid aldrig blevet undersøgt ved akut iskæmisk slagtilfælde hos gnavere. Her beskriver vi en ny protokol for EMS hos mus efter et iskæmisk slagtilfælde via den midterste cerebrale arterieokklusionsmodel (MCAo). Dette manuskript tjener som en beskrivelse af metoder og tidlige data til denne nye tilgang til EMS hos mus efter MCAo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of UConn Health og udført i overensstemmelse med amerikanske retningslinjer. Følgende protokol skal fungere i enhver art eller stamme af gnaver. Her blev der brugt 8- til 12 uger gamle, alders- og vægtmatchede C57BL/6 vildtypehanmus. Mus blev fodret med standard chow diæt og vand ad libitum. Standard husforhold blev opretholdt ved 72,3 ° F og 30% -70% relativ luftfugtighed med en 12 timers lys / mørk cyklus.
1. Forberedelse før operationen
- Steriliser alle instrumenter ved autoklavering inden operationen. Desinficer driftsfladen med 70 % ethanol, og opvarm driftsfladen til 37 °C med en elektrisk varmepude.
- Brug et induktionskammer til at bedøve musen med 4% -5% isofluran til induktion. Lever 1,5% -2,0% isofluran via næsekegle til vedligeholdelse indtil afslutningen af operationen. Sørg før operationen for, at musen bedøves korrekt ved at vurdere manglen på et svar på en fast bagfodsklemme og tab af postural reaktion og korrigeringsrefleks.
- Placer musen på venstre side på betjeningsfladen og påfør øjensalve for at beskytte begge øjne.
- Barber hår over det kirurgiske felt (dvs. højre lateral kranium mellem øje og øre) med elektriske klippere. Rengør det kirurgiske felt i koncentriske cirkler udad fra midten af det kirurgiske sted med 70% ethanol efterfulgt af povidonopløsning, og gentag disse trin 2x.
BEMÆRK: På grund af at operationsstedet er tæt på øjet, er det muligvis ikke muligt at fjerne 150% af området omkring et kirurgisk sted for at undgå irritation eller utilsigtet skade på øjet. - Administrer en enkelt dosis på 0,25% bupivacain (op til 8 mg/kg legemsvægt) ved subkutan injektion som præoperativ analgesi på operationsstedet.
- Opsæt et kirurgisk mikroskop ved 4x forstørrelse. Mikroskopet bruges til alle kirurgiske trin.
2. Kirurgisk procedure
BEMÆRK: Operationstrinnene er vist i figur 1. Til denne protokol blev tre mus tildelt til sham-gruppe, tre mus til EMS alene, 12 mus til MCAo og 23 mus til MCAo + EMS-gruppen.
- MCAo kirurgi
BEMÆRK: MCAo er en velkarakteriseret model af iskæmisk slagtilfælde hos gnavere, som beskrevet af os og andre12,13,14. Operationstrinnene er kort beskrevet her. Fokal forbigående cerebral iskæmi blev induceret af en 60 minutters højre MCAo under isofluranbedøvelse efterfulgt af reperfusion i 7 eller 21 dage.- Lav et midterlinje ventral halssnit efterfulgt af ensidig højre MCAo ved at fremme et 10-11 mm langt 6,0 silikone gummibelagt monofilament fra den indre halspulsåre bifurcation via en ekstern halspulsåre stub. I falske mus udfører identiske operationer bortset fra udviklingen af suturen ind i den indre halspulsåre.
- Mål rektale temperaturer ved hjælp af et temperaturstyringssystem, og hold temperaturen ved ~ 37 ° C under operationen med en automatisk varmepude.
- Brug laser Doppler flowmetri til at måle cerebral blodgennemstrømning før suturindsættelse ved at placere Doppler-sonden mod lateralkraniet (svarende til MCA-territoriet) og registrere værdien8. For at bekræfte okklusionsreduktion til 15% af baseline cerebral blodgennemstrømning skal du bruge den samme procedure, efter at suturen er avanceret. For at bekræfte reperfusion skal du bruge den samme procedure, efter at suturen er fjernet.
- Foder alle dyr med våd mash indtil ofring og / eller 1 uge efter operationen for at sikre tilstrækkelig ernæring til kroniske endepunkter, da dyr har opdrætsunderskud efter slagtilfælde.
- EMS kirurgi
- Efter 60 minutters MCAo randomiseres mus i MCAo-only- eller MCAo + EMS-grupper. Udfør EMS 4 timer efter MCAo (MCAo + EMS-gruppe) eller sham-kirurgi til udvalgte eksperimenter (kun EMS-gruppe). Skift til et nyt par sterile kirurgiske handsker før operationen.
BEMÆRK: Musene kom sig efter anæstesi efter 60 minutters MCAo og blev bedøvet igen før EMS-operationen. - For grupper, der modtager EMS (MCAo + EMS eller EMS-only grupper), lav et 10-15 mm hudsnit med en saks, der strækker sig fra 1-2 mm rostral til højre øre til 1-2 mm kaudal til højre øje.
BEMÆRK: Steril saks blev brugt til at forhindre utilsigtet skade på temporalis musklerne nedenunder. - Træk hudflapper tilbage ved hjælp af klemmer og identificer visuelt temporalismusklen og kraniet.
- Diskret dissekere temporalismusklen væk fra kraniet ved hjælp af en saks med en spredningsteknik. Udfør en 2-3 mm myotomi rettet ventralt langs muskelens kaudale kant for at lette ventral refleksion.
- Udfør en kraniotomi ~ 5 mm i diameter ved kraniet under den reflekterede temporalis muskel ved hjælp af en mikroboremaskine.
- Fjern dura mater med pincet for at udsætte hjernens piale overflade. Vær yderst forsigtig for at undgå utilsigtet skade på hjernen.
- Sutur den dorsale grænse af temporalis muskel til det subkutane væv i dorsal hudklap med 6-0 monocryl filamenter, hvilket gør det flush til den udsatte hjernebark.
- Luk hudsnittet med 6-0 monofilament sutur. Placer musen tilbage i buret og overvåg indtil genopretning fra anæstesi. Returner musen til sin boligfacilitet.
- Efter 60 minutters MCAo randomiseres mus i MCAo-only- eller MCAo + EMS-grupper. Udfør EMS 4 timer efter MCAo (MCAo + EMS-gruppe) eller sham-kirurgi til udvalgte eksperimenter (kun EMS-gruppe). Skift til et nyt par sterile kirurgiske handsker før operationen.
3. Postoperative overvejelser
- Overvåg musene for sygdom og det kirurgiske sted for infektion dagligt. Giv subkutan normal saltvand (1% volumen efter kropsvægt) dagligt for at understøtte hydrering.
- Overvåg for alvorlig dehydrering (tab af kropsvægt >20%) indtil 7 dage efter operationen. Administrer en yderligere bolus af subkutan normal saltvand 1% volumen efter kropsvægt, hvis >20% vægttab.
- Fortsæt med injektioner, fysiologisk overvågning og anden test uden særlige overvejelser.
BEMÆRK: I denne procedure blev brugen af opioider eller ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID'er) til behandling efter operationen undgået på grund af de kendte virkninger af disse midler på slagtilfælde eller infarktstørrelse i samråd med internt institutionelt dyrepleje- og brugsudvalg15,16,17,18. Imidlertid opfordres brugen af postoperativ analgesi stærkt til EMS-kirurgi med andre modeller. Kontakt venligst Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I alt 41 mus blev brugt til denne undersøgelse. Efter tre dødeligheder, en i MCAo og to i MCAo + EMS, blev i alt 38 mus brugt til at opnå de viste resultater.
Statistik
Data fra hvert eksperiment præsenteres som middel ± standardafvigelse (S.D.). Signifikans blev bestemt ved hjælp af enten uparret elevs t-test til sammenligning af to grupper eller envejs ANOVA for mere end to grupper, med en Newman-Keuls post-hoc-test for at korrigere for flere sammenligninger.
Nikotinamid-adenin-dinukleotid (reduceret)-tetrazoliumreduktase (NADH-TR) farvning
Denne farvning blev udført for at vurdere den langsigtede levedygtighed af den podede muskel som i Turoczi et al.19. Kort fortalt blev den podede muskelklap på ofringstidspunktet omhyggeligt udskåret, fastgjort med 4% paraformaldehyd i 30 minutter og kryopræserveret i optimal skæretemperatur (OCT) medium ved -80 ° C. Flere 12 μm tykke kryosektioner af temporalis muskelvæv blev farvet til NADH-TR enzym-histokemisk reaktion. Dias blev inkuberet i 30 minutter ved 37 °C i en opløsning af nitroblue tetrazolium (1,8 mg/dL) og NADH (15 mg/dL) i 0,05 M Tris buffer (pH 7,6). Ubrugt tetrazoliumreagens blev fjernet ved hjælp af stigende efterfulgt af faldende koncentrationer af acetone. Kvantitativ vurdering af NADH-tetrazolium-farvet muskel blev udført på muskelbilleder taget ved 40x forstørrelse.
Immunostaining undersøgelser
Immunostaining blev brugt til at visualisere muskeltransplantatbinding med cortex og blodkartæthed ved krydset mellem muskel og cortex20,21. Til visualisering af muskelbinding med hjernevæv blev mus, der havde gennemgået EMS-operation, brugt her. Ved afslutningen af hvert respektive tidspunkt blev mus bedøvet med en avertininjektion (50 mg/kg legemsvægt) efterfulgt af perfusion med 1x PBS indeholdende 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og fiksering med 4% paraformaldehyd. Kraniet blev omhyggeligt skåret for at forhindre utilsigtet løsrivelse af temporalis muskel (TM) graft fra hjernebarken. TM-transplantat over hjernebarken blev derefter adskilt fra den resterende temporalismuskel. Hjernen blev omhyggeligt fjernet og efterfikseret i 4% paraformaldehyd natten over. Den faste hjerne blev derefter dehydreret med 30% saccharose i 1x PBSindtil hjernen sank til bunden af hætteglasset (ca. 1-3 dage). Vævssektioner af 30 μm størrelse blev skåret med frysemikrotom og monteret på dias.
Til immunfarvning af blodkar i den ipsilaterale hjernebark blev MCAo- og MCAo + EMS-mus ofret, perfunderet, fikseret og behandlet som ovenfor. Hjerneskiver af 30 μm størrelse blev snittet på et frysemikrotom og monteret på en glasside. Antigenhentning blev udført ved hjælp af citratbuffer (pH 6,0), og sektioner blev inkuberet med blokerende buffer efterfulgt af inkubation natten over med primære antistoffer, anti-alfa skeletmuskel actin 1:200 og Lectin-Dy59421,22. Tre koronale hjernesektioner pr. mus (n = 5 mus / gruppe; i alt = 15 sektioner) blev taget mellem 0,45 mm og 0,98 mm fra bregma, farvet og visualiseret til kvantificering ved 20x forstørrelse ved krydset mellem den iskæmiske kerne og penumbra-regionerne. En blindet observatør kvantificerede lektinpositiv kartæthed i hjernens parenchym ved hjælp af ImageJ-software.
Muskeltransplantat forbliver levedygtig 21 dage efter EMS
En forudsætning for succes med denne operation er langsigtet levedygtighed af den podede temporalis muskel. TM-transplantatet viste forbigående skader på muskelceller 7 dage efter operationen i podet muskel vs. kontrolmuskel (71,32% muskelcelleoverlevelse ± 16,64% vs. 97,19% ± 3,81%). Denne forskel mellem podet og kontrolmusklen forsvandt imidlertid, og musklerne kom sig fuldstændigt 21 dage efter operationen (98,22% ± 3,965 vs. 96,87% ± 2,27%; Figur 2A).
Muskeltransplantater skaber løse bindinger med hjernevæv
Vellykket podning af temporalis-musklen på hjernebarkoverfladen er en fremtrædende forudsætning for denne models succes. I både EMS + MCAo- og EMS-modellen klæbede temporalismuskeltransplantaterne til den kortikale overflade 21 dage efter EMS, hvilket tyder på vellykket kirurgi, graftimplantation og binding (figur 1B og figur 2B).
Blodkartætheden stiger i perilesionsbarken efter EMS
Akut slagtilfælde fører til akut reduktion i cerebral blodgennemstrømning, hæmmet rekruttering af sikkerhedskar, unormal vaskulær spiring og dysfunktionel angiogenese, hvilket bidrager til dårlige slagtilfælderesultater23. EMS øger blodkarets overfladeareal betydeligt og integreret tæthed i perilesionel cortex efter slagtilfælde (p < 0,05 vs. kun MCAo; Figur 3).
Analyse af angiogene og neuromodulerende proteiner
Et museangiogenesearray blev brugt til at sammenligne ekspression af angiogene og neuromodulerende proteiner 7 dage og 21 dage efter MCAo i MCAo-only vs. MCAo + EMS-mus i henhold til producentens anvisninger24. ImageJ-software blev brugt til at kvantificere pixeltætheden for hvert datapunkt i proteindot blot. Data blev registreret som forholdet mellem densiteten af hvert analyseret protein og den gennemsnitlige tæthed af standarderne for hver blot.
Fibroblastvækstfaktor (FGF) -sur er opreguleret, og osteopontin nedreguleres efter EMS
Proteinarray-resultater viste en signifikant stigning i proteinniveauer af FGF-sur (0,677 ± 0,007 vs. 0,585 ± 0,014, p = 0,045), en potent angiogen faktor og fald i osteopontinniveauer, et multifunktionelt molekyle udtrykt i inflammatoriske tilstande (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) i MCAo + EMS-gruppen 21 dage efter slagtilfælde, hvilket tyder på forbedret angiogenese og neurobeskyttelse (figur 4A).
Dødelighedsresultater for EMS efter slagtilfælde
Både MCAo og EMS er invasive kirurgiske teknikker, der kan forårsage en vis dødelighed hos mus. I dette forsøg var der mellem 10% -11% dødelighed hos mus 21 dage efter MCAo-operation, hvilket er en accepteret dødelighed for mus udsat for 60 minutters MCAo14. Udførelse af EMS på mus efter MCAo øgede ikke dødeligheden (figur 4B), hvilket tyder på tolerance for EMS-kirurgi, selv efter MCAo.
Figur 1. Trinvis EMS-procedure efter ondartet cerebral arterieokklusion (MCAo): (A) Trin 1. Et hudsnit er lavet over det højre midterste cerebrale arterieområde. Huden og subkutane væv reflekteres og udsætter kraniet og temporalismusklen. Trin 2. Temporalis-musklen dissekeres væk fra kraniet og reflekteres ventralt. Trin 3. En kraniotomi udføres (4-5 mm), og dura fjernes forsigtigt. Trin 4. Temporalis-musklen placeres direkte på hjerneoverfladen for at dække den udsatte cortex. Trin 5. Den dorsale kant af temporalismusklen sutureres til det subkutane væv i rygklappen, flush med hjerneoverfladen. Trin 6. Snittet er lukket, og musen fjernes fra anæstesi og returneres til buret. Denne del af tallet er ændret fra25. (B) Konceptuel skematisk for encephalomyosynangiose (EMS) behandling af MCAo-induceret slagtilfælde. Forkortelser: FGF = Fibroblast vækstfaktor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Immunostaining undersøgelser. (A) Temporalis muskeltransplantater opretholder levedygtigheden. Temporalis muskeltransplantater (EMS) på iskæmisk cortexvæv opretholder høj levedygtighed. (Venstre) Repræsentativt billede af nicotinamid-adenin-dinukleotid (reduceret)-tetrazoliumreduktasefarvede muskelvævsceller fra kontrol (naiv muskel fra kontralateral side) og podet muskel 7 dage efter ondartet cerebral arterieokklusion (MCAo) + encephalomyosynangiosis (EMS) kirurgi. Sort pil () viser beskadigede celler. (Højre) Kvantificering af levende/døde muskelceller. Muskelceller 7 dage efter EMS viser nogle milde skader (p < 0,1; t-test), der fuldstændigt genoprettes efter 21 dage. (n = 5 mus/tidspunkter = i alt 10 mus i denne gruppe) Data er gennemsnitlige ± S.D. Scale bar = 20 μm. (B) Binding af podet temporalis muskel med hjernebark 21 dage efter EMS operation. EMS-væv farvet med anti-alfa skeletmuskel actin (grøn) og Lectin-Dy594 (rød; blodkarmarkør) antistof (n = 3 mus). Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Encephalomyosynangiosis (EMS) kirurgi øger blodkartætheden i iskæmiske læsioner 21 dage efter slagtilfælde . (A) Repræsentative billeder af koronale hjerneafsnit fra mus udsat for (venstre) midterste cerebralarterieokklusion (MCAo) eller (højre) MCAo + EMS og farvet med L. esculentum (Tomat) Lectin-Dy594, som binder til glycoproteiner i den basale membran i endotelceller. Grafer er kvantificerede områder. MCAo + EMS-mus viste højere endotelnetværk ved hjælp af parametre, nemlig vaskulært fraktionsareal ( B) og integreret densitet (C). **p < 0,01 (uparret t-test), mens mus kun MCAo-viste skader tæt på den iskæmiske læsion (stiplet linje). N = 5 mus/gruppe= 10 mus i alt. Data er gennemsnitlige ± S.D. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: Contra = kontralateral side; Ipsi = ipsilateral side. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Encephalomyosynangiosis modulerer angiogene proteiner efter slagtilfælde. (A) En museangiogenesearray (ARY015) blev brugt til samtidig at vurdere de relative niveauer af 53 museangiogeneserelaterede proteiner efter okklusion mellem cerebralarterien (MCAo) og MCAo + EMS (dag 21 efter MCAo) i hjernevævslysater fra perilesionel cortex. Kvantitativ analyse viser, at EMS-kirurgi signifikant reducerede osteopontin og øget fibroblastvækstfaktor (FGF) -surt protein efter slagtilfælde (* p < 0,05 eller ** p < 0,01) vs ipsilateral MCAo. Data er gennemsnitlige ± S.D.; n = 3 mus/gruppe/tidspunkt = i alt 15 mus. (B) EMS øgede ikke dødeligheden efter slagtilfælde (MCAo). Kaplan Meier overlevelseskurve viser, at EMS + MCAO ikke ændrede dødeligheden efter slagtilfælde vs. MCAO alene (p = 0,54). For EMS n = 3; for MCAo n = 11; og for MCAo + EMS n = 21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en vellykket EMS-procedure i en musemodel af MCAo-induceret slagtilfælde. Dataene viser, at podet væv forbliver levedygtigt og kan danne bindinger med hjernebarken længe efter EMS-operationen. Disse resultater understøtter begrundelsen for at bruge et cerebralt muskeltransplantat til gradvist at udvikle et rigt vaskulært trofisk miljø på stedet for slagtilfælde. EMS er en lovende terapi til potentielt reparation af infarkt cerebral væv i samme miljø.
De kritiske trin i protokollen omfatter trin 2.2.4: Dette trin forårsager uundgåeligt traume for TM, hvilket kan reducere dets evne til at binde sig til cortex og frigive trofiske faktorer. Pas på at begrænse TM-traumer i det omfang, det er muligt. En alternativ strategi til at reducere vævstraumer er at dissekere TM fra kraniet kun ved dets dorsale grænse og give afkald på myotomien. I dette tilfælde ville TM blive løftet væk fra kraniet (snarere end fuldt reflekteret), og kraniotomien ville blive udført med kraniotomiboret under musklen. Dette reducerer mængden af plads, der er til rådighed til at udføre dette trin, men kan igen reducere TM-traumer. Endvidere er ekstrem pleje og praksis nødvendig i trin 2.2.5 og 2.2.6 for at forhindre skade på den underliggende hjernebark under kraniotomi og manipulation af dura.
Denne EMS-model er et naturligt supplement til den veletablerede MCAo-model. Fordi MCAo-modellen nøje simulerer patofysiologien af iskæmi og vaskulær netværksskade, der er almindelig hos menneskelige patienter, vil MCAo + EMS-modellen sandsynligvis have et højt niveau af oversættelighed til mennesker. EMS-modellen, der præsenteres her, er den første terapeutiske intervention, der er blevet undersøgt for iskæmisk slagtilfælde i den prækliniske indstilling, der kun er afhængig af autologt væv. Fordi TM-transplantatet er organisk og autologt, kan det desuden vise parakrine signalinteraktioner med den tilstødende skadede hjerne, der tjener til at regulere frigivelsen af trofiske faktorer til optimale niveauer på forskellige tidspunkter.
Mens slagtilfælde skaber et proangiogent miljø og stimulerer selve angiogenese26, er det iboende respons efter slagtilfælde ikke tilstrækkeligt til at forbedre vaskulær forsyning i den beskadigede region på grund af subthresholdniveauer af angiogene faktorer. Her forbedrede EMS yderligere FGF-surt proteinekspression sammenlignet med dyr, der kun er slagtilfælde. Dette protein styrer indirekte neovaskularisering i samspil med andre vækstfaktorer. FGF-sur virker også som en neurotrofisk faktor, der fremmer neurobeskyttelse og neurogenese27,28. Nogle af de neurobeskyttende virkninger af FGF-syreholdige medieres ved aktivering af AKT- og MAPK/EPK-veje29. Ud over FGF var der også reduceret ekspression af proteinet osteopontin. Osteopontin er et proinflammatorisk, pleotropisk cytokin, der i stigende grad anerkendes for sin rolle i flere neuropatologier og vævsombygningsprocesser, blandt andre funktioner. Osteopontins rolle i slagtilfælde er stadig usikker30. Nylige undersøgelser hos mennesker peger imidlertid på osteopontin som en dårlig prognostisk faktor efter slagtilfælde. Et fald i serum osteopontinniveauer efter slagtilfælde blev vist i en undersøgelse for at forudsige gunstige resultater (modificeret Rankin skala score < 2 ved 90 dage) hos humane patienter med slagtilfælde31. En anden undersøgelse viste et dosisafhængigt forhold mellem højere niveauer af plasma osteopontin og resultater af død og handicap hos menneskelige patienter efter slagtilfælde32. I overensstemmelse med disse kliniske undersøgelser tyder dataene her på, at reduceret osteopontin efter EMS kan fremme et antiinflammatorisk miljø for at øge dannelsen af neo-kar. Samlet set peger differentialekspressionen af FGF-sur og osteopontin mod mekanismer, der styrer angiogenesen efter EMS i denne musemodel og øger sandsynligheden for, at proceduren, der også kan medføre neurobeskyttelse og neuroregenerering ud over angiogenese.
Der er nogle potentielle begrænsninger ved denne procedure. Måling af cerebral flow på grund af øget blodkartæthed er udfordrende i denne procedure, da almindeligt anvendte procedurer for laser Doppler eller laser speckle flowmeter påvirkes af tilstedeværelsen af temporalis muskel på toppen af cortex, som forhindrer ægte blodmåling på kortikal overflade. Således kan denne procedure have brug for mere sofistikeret, men sjældent tilgængelig, lille gnaver MR-scanning, hvis der kræves flowmåling i realtid. Imidlertid understøtter brugen af måling af blodkardensitet indirekte succesen med EMS-proceduren til forbedring af angiogenese som foreslået af vores data. En anden begrænsning er den invasive karakter af EMS-interventioner på toppen af MCAo, som i sig selv er en invasiv procedure. Selvom der ikke var nogen øget dødelighed med EMS i denne undersøgelse sammenlignet med MCAo alene, kan kravet om hemicraniektomi begrænse dets fremtidige oversættelighed for alle typer slagtilfælde. I klinisk praksis kræver >10% af patienterne med stort iskæmisk slagtilfælde imidlertid hemicraniektomi for at håndtere øget intrakranielt tryk23, og denne EMS-model kan have translationel værdi for især denne undergruppe af slagtilfældepatienter. Endelig blev tidspunktet på 4 timer efter MCAo for udførelse af EMS valgt til at falde inden for standardbehandlingsvinduet for rT-PA for de fleste humane patienter, selvom fremtidige undersøgelser vil bruge senere tidspunkter til at evaluere det terapeutiske vindue for EMS.
Samlet set giver EMS-modellen en veltolereret mulighed for at inducere angiogenese efter iskæmisk slagtilfælde, og ud over dens potentielle kliniske oversættelse kan den anvendes i fremtidige undersøgelser, der undersøger patofysiologien af slagtilfælde og angiogenese.
EMS-modellen, der er beskrevet her, tilbyder en sikker metode til opnåelse af cerebral angiogenese til præklinisk undersøgelse, hvilket undgår behovet for farmakologiske indgreb, som ofte fører til uønskede bivirkninger eller ukontrolleret angiogenese. Mange patienter med store iskæmiske slagtilfælde kræver en hemicraniektomi under deres kliniske forløb for at klare stigende intrakranielt tryk. Denne EMS-procedure, som også omfatter hemicraniektomi hos mus til muskeltransplantation, kan give præklinisk bevis for koncept for translationel anvendelse af EMS i iskæmisk slagtilfælde. Derfor har denne model potentialet til at udvide kendskabet til neurovaskulær genopretning efter et iskæmisk slagtilfælde og lette udviklingen af innovation, som er timens behov, i terapi til overlevende efter slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Research Excellence Program-UConn Health (til Ketan R Bulsara og Rajkumar Verma) og UConn Health start-up (til Rajkumar Verma).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
- Stroke,
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
- Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
- Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
- Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
- Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
- Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
- Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
- Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
- Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
- Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
- Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
- Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
- Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
- Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
- Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
- Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
- Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
- Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P.
- Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
- Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
- Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
- Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
- Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
- Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
- Meller, R., et al.
- Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
- Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).
