Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En modell för encefalomyosynangios behandling efter mellersta cerebral artär ocklusion-inducerad stroke hos möss

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet syftar till att tillhandahålla metoder för encefalomyosynangios-ympning av en vaskulär temporalismuskelflik på pialytan av ischemisk hjärnvävnad-för behandling av icke-moyamoya akut ischemisk stroke. Metodens effekt för att öka angiogenesen utvärderas med hjälp av en övergående modell för ocklusion av cerebral artär i mitten hos möss.

Abstract

Det finns ingen effektiv behandling tillgänglig för de flesta patienter som lider av ischemisk stroke, vilket gör utveckling av nya terapier absolut nödvändig. Hjärnans förmåga att självläka efter ischemisk stroke begränsas av otillräcklig blodtillförsel i det drabbade området. Encefalomyosynangios (EMS) är ett neurokirurgiskt förfarande som uppnår angiogenes hos patienter med moyamoya sjukdom. Det involverar kraniotomi med placering av ett vaskulärt temporalismuskeltransplantat på den ischemiska hjärnytan. EMS har aldrig studerats vid akut ischemisk stroke hos möss. Hypotesen som driver denna studie är att EMS förbättrar cerebral angiogenes vid den kortikala ytan som omger muskeltransplantatet. Protokollet som visas här beskriver proceduren och ger initiala data som stöder genomförbarheten och effekten av EMS-metoden. I detta protokoll, efter 60 minuters övergående mellersta cerebral artärocklusion (MCAo), randomiserades möss till antingen MCAo eller MCAo + EMS-behandling. EMS utfördes 3-4 h efter ocklusion. Mössen offrades 7 eller 21 dagar efter MCAo eller MCAo + EMS-behandling. Temporalis transplantatviabilitet mättes med användning av nikotinamidadenindinukleotidreducerad tetrazoliumreduktasanalys. En musangiogenesuppsättning kvantifierade angiogent och neuromodulerande proteinuttryck. Immunohistokemi användes för att visualisera transplantatbindning med hjärnbarken och förändring i kärltäthet. De preliminära uppgifterna här tyder på att ympad muskel förblev livskraftig 21 dagar efter EMS. Immunfärgning visade framgångsrik transplantatimplantation och ökning av kärltätheten nära muskeltransplantatet, vilket indikerar ökad angiogenes. Data visar att EMS ökar fibroblasttillväxtfaktorn (FGF) och minskar osteopontinnivåerna efter stroke. Dessutom ökade EMS efter stroke inte dödligheten vilket tyder på att protokollet är säkert och pålitligt. Detta nya förfarande är effektivt och väl tolererat och har potential att ge information om nya interventioner för förbättrad angiogenes efter akut ischemisk stroke.

Introduction

Ischemisk stroke är en akut neurovaskulär skada med förödande kroniska följdsjukdomar. De flesta strokeöverlevare, 650 000 per år, i USA lider av permanent funktionsnedsättning1. Ingen av de tillgängliga behandlingarna ger neuroprotektion och funktionell återhämtning efter den akuta fasen av ischemisk stroke. Efter en akut ischemisk stroke minskar både direkta och kollaterala blodtillförsel vilket leder till dysfunktion i hjärnceller och nätverk, vilket resulterar i plötsliga neurologiska underskott 2,3. Återställande av blodtillförseln till den ischemiska regionen är fortfarande det främsta målet för strokebehandling. Således är förbättring av angiogenes för att främja blodtillförsel i det ischemiska territoriet ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt; Tidigare studerade metoder för att främja angiogenes efter stroke, inklusive erytropoietin, statiner och tillväxtfaktorer, har dock begränsats av oacceptabla nivåer av toxicitet eller översättningsbarhet4.

Encefalomyosynangios (EMS) är ett kirurgiskt ingrepp som förbättrar cerebral angiogenes hos människor med moyamoya sjukdom, ett tillstånd av förträngda kranialartärer som ofta leder till stroke. EMS innebär partiell frigöring av en vaskulär del av patientens temporalismuskel från skallen, följt av kraniotomi och ympning av muskeln på den drabbade cortexen. Denna procedur tolereras väl och inducerar cerebral angiogenes, vilket minskar risken för ischemisk stroke hos patienter med moyamoya sjukdom 5,6. Således tjänar proceduren till stor del en förebyggande roll hos dessa patienter. Angiogenesen som orsakas av denna procedur kan också ha en roll för att främja neurovaskulärt skydd och återhämtning vid inställningen av ischemisk stroke. Denna rapport stöder hypotesen att angiogenes orsakad av EMS har potential att utöka förståelsen för och terapeutiska alternativ för cerebral ischemi.

Förutom EMS finns det flera farmakologiska och kirurgiska metoder för att förbättra angiogenesen, men de har flera begränsningar. Farmakologiska tillvägagångssätt såsom administrering av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) har visat sig vara otillräcklig eller till och med skadlig på grund av flera begränsningar, inklusive bildandet av kaotiska, oorganiserade, läckande och primitiva vaskulära plexuser, som liknar de som finns i tumörvävnaderna 7,8 och inte har några fördelaktiga effekter i kliniska prövningar9.

Kirurgiska tillvägagångssätt inkluderar direkt anastomos såsom ytlig temporal artär-mellersta cerebral artäranastomos, indirekt anastomos såsom encefalo-duro arterio-synangios (EDAS), encefalomyosynangios (EMS) och kombinationer av direkt och indirekt anastomos10. Alla dessa procedurer är mycket tekniskt utmanande och krävande hos små djur, förutom EMS. Medan de andra procedurerna kräver komplex vaskulär anastomos, kräver EMS ett relativt enkelt muskeltransplantat. Dessutom gör närheten av temporalismuskeln till cortex det till ett naturligt val för ympning, eftersom det inte behöver skäras helt ut eller kopplas bort från blodtillförseln, vilket skulle vara nödvändigt om en mer avlägsen muskel användes för ympning.

EMS har studerats i kroniska cerebrala hypoperfusionsmodeller hos råttor 7,11. EMS med hjälp av ett temporalismuskeltransplantat har dock aldrig studerats vid akut ischemisk stroke hos gnagare. Här beskriver vi ett nytt protokoll för EMS hos möss efter en ischemisk stroke via mellersta cerebral artär ocklusionsmodell (MCAo). Detta manuskript fungerar som en beskrivning av metoder och tidiga data för detta nya tillvägagångssätt för EMS hos möss efter MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of UConn Health och genomfördes i enlighet med amerikanska riktlinjer. Följande protokoll ska fungera i alla arter eller stammar av gnagare. Här användes 8- till 12 veckor gamla, ålders- och viktmatchade C57BL/6 vildmushanar. Möss matades med standard chow-diet och vatten ad libitum. Standardhusförhållanden bibehölls vid 72.3 ° F och 30% -70% relativ luftfuktighet med en 12 h ljus / mörk cykel.

1. Förberedelse före operation

  1. Sterilisera alla instrument genom autoklavering före operation. Sanera arbetsytan med 70% etanol och värm arbetsytan till 37 °C med en elektrisk värmedyna.
  2. Använd en induktionskammare för att bedöva musen med 4%-5% isofluran för induktion. Leverera 1,5%-2,0% isofluran via näskon för underhåll fram till slutet av operationen. Se till att musen är ordentligt bedövad före operationen genom att bedöma bristen på svar på en fast bakfotsklämma och förlust av postural reaktion och rätningsreflex.
  3. Placera musen på vänster sida på operationsytan och applicera ögonsalva för att skydda båda ögonen.
  4. Raka hår över det kirurgiska fältet (dvs. höger lateralt kranium mellan öga och öra) med elektriska klippare. Rengör det kirurgiska fältet i koncentriska cirklar utåt från mitten av operationsstället, med 70% etanol följt av povidonlösning, och upprepa dessa steg 2x.
    OBS: På grund av att operationsplatsen är nära ögat kan det hända att det inte är möjligt att ta bort 150% av området kring ett kirurgiskt ställe för att undvika irritation eller oavsiktlig skada på ögat.
  5. Administrera en engångsdos på 0,25 % bupivakain (upp till 8 mg/kg kroppsvikt) genom subkutan injektion som preoperativ analgesi på operationsstället.
  6. Sätt upp ett kirurgiskt mikroskop med 4x förstoring. Mikroskopet används för alla kirurgiska steg.

2. Operation ingrepp

OBS: Operationsstegen presenteras i figur 1. För detta protokoll tilldelades tre möss till bluffgrupp, tre möss för enbart EMS, 12 möss för MCAo och 23 möss för MCAo + EMS-gruppen.

  1. MCAo-kirurgi
    OBS: MCAo är en väl karakteriserad modell av ischemisk stroke hos gnagare, som beskrivs av oss och andra12,13,14. Operationsstegen beskrivs i korthet här. Fokal övergående cerebral ischemi inducerades av en 60 min höger MCAo under isoflurananestesi följt av reperfusion i 7 eller 21 dagar.
    1. Gör ett mittlinje ventralt nacksnitt följt av ensidig höger MCAo genom att avancera en 10-11 mm lång 6.0 silikongummibelagd monofilament från den inre halspulsåderförgreningen via en extern halspulsåderstubbe. I skenmöss, utför identiska operationer förutom utvecklingen av suturen i den inre halspulsådern.
    2. Mät rektala temperaturer med hjälp av ett temperaturkontrollsystem och håll temperaturen vid ~ 37 ° C under operationen med en automatisk värmedyna.
    3. Använd laserdopplerflödesmetri för att mäta cerebralt blodflöde före suturinsättning genom att placera dopplersonden mot den laterala skallen (motsvarande MCA-territoriet) och registrera värdet8. För att bekräfta ocklusionsreduktion till 15% av baslinjen cerebralt blodflöde, använd samma procedur efter att suturen har avancerats. För att bekräfta reperfusion, använd samma procedur efter att suturen har tagits bort.
    4. Utfodra alla djur med vått mos tills de avlivas och/eller 1 vecka efter operationen för att säkerställa tillräcklig näring för kroniska endpoints, eftersom djuren har brister i uppfödningen efter stroke.
  2. EMS-kirurgi
    1. Efter 60 minuters MCAo, randomisera möss till MCAo-only eller MCAo + EMS-grupper. Utför EMS 4 h efter MCAo (MCAo + EMS-grupp) eller skenkirurgi för utvalda experiment (endast EMS-grupp). Byt till ett nytt par sterila operationshandskar innan operationen.
      OBS: Mössen återhämtade sig från anestesi efter 60 minuters MCAo och bedövades igen före EMS-operationen.
    2. För grupper som får EMS (MCAo + EMS eller endast EMS-grupper), gör ett 10-15 mm hudsnitt med sax, som sträcker sig från 1-2 mm rostralt till höger öra till 1-2 mm kaudalt till höger öga.
      OBS: Steril sax användes för att förhindra oavsiktlig skada på temporalismusklerna under.
    3. Dra tillbaka hudflikar med hjälp av klämmor och identifiera visuellt temporalismuskeln och skallen.
    4. Dissekera trubbigt temporalismuskeln bort från skallen med sax med spridningsteknik. Utför en 2-3 mm myotomi riktad ventralt längs muskelns kaudala kant för att underlätta ventral reflektion.
    5. Utför en kraniotomi ~ 5 mm i diameter vid skallen under den reflekterade temporalismuskeln med hjälp av en mikroborr.
    6. Ta bort dura mater med pincett för att exponera hjärnans pial yta. Var mycket försiktig för att undvika oavsiktlig skada på hjärnan.
    7. Suturera dorsalgränsen för temporalismuskeln till den subkutana vävnaden i dorsalhudfliken med 6-0 monokrylfilament, vilket gör att den spolar till den exponerade hjärnbarken.
    8. Stäng hudsnittet med 6-0 monofilamentsutur. Placera musen tillbaka i buret och övervaka tills den återhämtar sig från anestesi. Sätt tillbaka musen till dess bostadsanläggning.

3. Överväganden efter det operativa förfarandet

  1. Övervaka mössen för sjukdom och det kirurgiska stället för infektion dagligen. Ge subkutan normal saltlösning (1% volym i kroppsvikt) dagligen för att stödja hydrering.
  2. Övervaka för svår uttorkning (förlust av kroppsvikt >20%) fram till 7 dagar efter operationen. Administrera en extra bolus av subkutan normal saltlösning 1% volym i kroppsvikt om >20% viktminskning.
  3. Fortsätt med injektioner, fysiologisk övervakning och annan testning utan särskilda överväganden.
    OBS: I denna procedur undviks användning av opioider eller icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) för att behandla efter operation på grund av de kända effekterna av dessa medel på strokeutfall eller infarktstorlek i samråd med intern institutionell djurvård och användningskommitté15,16,17,18. Användningen av postoperativ analgesi uppmuntras dock starkt för EMS-kirurgi med andra modeller. Kontakta kommittén för institutionell djurvård och användning (IACUC) för detta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt 41 möss användes för denna studie. Efter tre dödsfall, en i MCAo och två i MCAo + EMS, användes totalt 38 möss för att erhålla de visade resultaten.

Statistik
Data från varje experiment presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (S.D.). Signifikansen bestämdes med hjälp av antingen oparade studenters t-test för att jämföra två grupper eller envägs ANOVA för mer än två grupper, med ett Newman-Keuls post-hoc-test för att korrigera för flera jämförelser.

Nikotinamidadenindinukleotid (reducerad)-tetrazoliumreduktas (NADH-TR) färgning
Denna färgning gjordes för att bedöma den långsiktiga livskraften hos den ympade muskeln som i Turoczi et al.19. Kortfattat, vid tidpunkten för offret, skars den ympade muskelfliken noggrant, fixerades med 4% paraformaldehyd i 30 minuter och kryokonserverades i optimalt skärtemperaturmedium (OCT) vid -80 ° C. Flera 12 μm tjocka kryosektioner av temporalis muskelvävnad färgades för NADH-TR-enzym-histokemisk reaktion. Objektsglasen inkuberades i 30 minuter vid 37 °C i en lösning av nitroblått tetrazolium (1,8 mg/dL) och NADH (15 mg/dL) i 0,05 M Tris-buffert (pH 7,6). Oanvänt tetrazoliumreagens avlägsnades med ökande följt av minskande koncentrationer av aceton. Kvantitativ bedömning av NADH-tetrazoliumfärgade muskler utfördes på muskelbilder tagna med 40x förstoring.

Studier av immunfärgning
Immunfärgning användes för att visualisera muskeltransplantatbindning med cortex och blodkärlstäthet vid korsningen av muskel och cortex20,21. För visualisering av muskelbindning med hjärnvävnad användes möss som hade genomgått EMS-kirurgi här. I slutet av respektive tidpunkt bedövades mössen med en avertininjektion (50 mg/kg kroppsvikt), följt av perfusion med 1x PBS innehållande 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och fixering med 4% paraformaldehyd. Skallen skars försiktigt för att förhindra oavsiktlig lossning av temporalismuskel (TM) transplantat från hjärnbarken. TM-transplantat ovanför hjärnbarken separerades sedan från den återstående temporalismuskeln. Hjärnan avlägsnades försiktigt och postfixerades i 4% paraformaldehyd över natten. Den fasta hjärnan dehydrerades sedan med 30% sackaros i 1x PBStills hjärnan sjönk till botten av injektionsflaskan (cirka 1-3 dagar). Vävnadssektioner av 30 μm storlek skars med frysande mikrotom och monterades på objektglas.

För immunfärgning av blodkärl i den ipsilaterala hjärnbarken offrades, perfuserades, fixerades och bearbetades MCAo + EMS-möss enligt ovan. Hjärnskivor med en storlek på 30 μm delades på en frysande mikrotom och monterades på en glassida. Antigenhämtning gjordes med hjälp av citratbuffert (pH 6,0) och sektioner inkuberades med blockerande buffert följt av inkubation över natten med primära antikroppar, anti-alfa skelettmuskelaktin 1:200 och Lectin-Dy59421,22. Tre koronala hjärnsektioner per mus (n = 5 möss/grupp; totalt = 15 sektioner) togs mellan 0,45 mm och 0,98 mm från bregma, färgades och visualiserades för kvantifiering vid 20x förstoring vid korsningen av den ischemiska kärnan och penumbraregionerna. En blindad observatör kvantifierade lektinpositiv kärltäthet i hjärnparenkymen med hjälp av ImageJ-programvaran.

Muskeltransplantat förblir livskraftigt 21 dagar efter EMS
En förutsättning för att lyckas med denna operation är långsiktig livskraft hos den ympade temporalismuskeln. TM-transplantatet visade övergående skador på muskelceller vid 7 dagar efter operationen i ympade muskler kontra kontrollmuskler (71,32% muskelcellsöverlevnad ± 16,64% jämfört med 97,19% ± 3,81%). Denna skillnad mellan ympad och kontrollmuskeln försvann dock och musklerna återhämtade sig helt 21 dagar efter operationen (98,22% ± 3,965 jämfört med 96,87% ± 2,27%; Figur 2A).

Muskeltransplantat gör lösa bindningar med hjärnvävnad
Framgångsrik ympning av temporalismuskeln på hjärnbarkens yta är ett främsta krav för att denna modell ska lyckas. I både EMS + MCAo- och EMS-modellen fästes temporalismuskeltransplantaten på den kortikala ytan 21 dagar efter EMS, vilket tyder på framgångsrik operation, transplantatimplantation och bindning (figur 1B och figur 2B).

Blodkärlstätheten ökar i perilesionell cortex efter EMS
Akut stroke leder till akut minskning av cerebralt blodflöde, hindrad rekrytering av säkerhetskärl, onormal vaskulär spridning och dysfunktionell angiogenes, vilket bidrar till dåliga strokeutfall23. EMS ökar signifikant blodkärlens ytarea och integrerade densitet i perilesionell cortex efter stroke (p < 0,05 jämfört med endast MCAo; Figur 3).

Analys av angiogena och neuromodulerande proteiner
En musangiogenesuppsättning användes för att jämföra uttryck av angiogena och neuromodulerande proteiner 7 dagar och 21 dagar efter MCAo i endast MCAo jämfört med MCAo + EMS-möss enligt tillverkarens instruktioner24. ImageJ-programvaran användes för att kvantifiera pixeldensitet för varje datapunkt för proteinpunktsfläcken. Data registrerades som förhållandet mellan densiteten hos varje analyserat protein och den genomsnittliga densiteten hos standarderna för varje fläck.

Fibroblasttillväxtfaktor (FGF)-surt är uppreglerat och osteopontin nedregleras efter EMS
Proteinmatrisresultat visade en signifikant ökning av proteinnivåerna av FGF-surt (0,677 ± 0,007 jämfört med 0,585 ± 0,014, p = 0,045), en potent angiogen faktor och minskning av osteopontinnivåerna, en multifunktionell molekyl uttryckt i inflammatoriska tillstånd (0,692 ± 0,007 jämfört med 0,758 ± 0,014, p = 0,048) i MCAo + EMS-gruppen 21 dagar efter stroke, vilket tyder på förbättrad angiogenes och neuroprotektion (figur 4A).

Dödlighetsresultat för EMS efter stroke
Både MCAo och EMS är invasiva kirurgiska tekniker som kan orsaka viss dödlighet hos möss. I detta experiment fanns det mellan 10% -11% dödlighet hos möss 21 dagar efter MCAo-operation, vilket är en accepterad dödlighet för möss som utsätts för 60 min MCAo14. Att utföra EMS på möss efter MCAo ökade inte dödligheten (figur 4B) vilket tyder på tolerans för EMS-kirurgi även efter MCAo.

Figure 1
Figur 1. Stegvis EMS-procedur efter mellersta cerebral artärocklusion (MCAo): (A) Steg 1. Ett hudsnitt görs över det högra mellersta cerebrala artärområdet. Huden och subkutana vävnader reflekteras och exponerar skallen och temporalismuskeln. Steg 2. Temporalismuskeln dissekeras bort från skallen och reflekteras ventralt. Steg 3. En kraniotomi utförs (4-5 mm) och dura avlägsnas försiktigt. Steg 4. Temporalismuskeln placeras direkt på hjärnytan för att täcka den exponerade cortexen. Steg 5. Temporalismuskelns dorsala kant sutureras till den subkutana vävnaden i dorsalhudfliken, spola med hjärnytan. Steg 6. Snittet är stängt och musen avlägsnas från anestesi och återförs till buret. Denna del av figuren har ändrats från25. (B) Konceptuellt schema för encefalomyosynangios (EMS) behandling av MCAo-inducerad stroke. Förkortningar: FGF = Fibroblast tillväxtfaktor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Immunostaining studier. (A) Temporalis muskeltransplantat upprätthåller livskraften. Temporalis muskeltransplantat (EMS) på ischemisk cortexvävnad upprätthåller hög livskraft. (Vänster) Representativ bild av nikotinamidadenindinukleotid (reducerad)-tetrazoliumreduktasfärgade muskelvävnadsceller från kontroll (naiv muskel från kontralateral sida) och ympad muskel vid 7 dagar efter mellersta cerebral artärocklusion (MCAo) + encefalomyosynangios (EMS) kirurgi. Svart pil () visar skadade celler. (Höger) Kvantifiering av levande/döda muskelceller. Muskelceller vid 7 dagar efter EMS visar några milda skador (p < 0.1; t-test) som helt återhämtade sig vid 21 dagar. (n = 5 möss/tidspunkter = totalt 10 möss i denna grupp) Data är medelvärde ± S.D. Skala bar = 20 μm. (B) Bindning av ympad temporalismuskel med hjärnbarken 21 dagar efter EMS-operation. EMS-vävnader färgade med anti-alfa skelettmuskelaktin (grön) och Lectin-Dy594 (röd; blodkärlsmarkör) antikropp (n = 3 möss). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Encefalomyosynangios (EMS) kirurgi ökar blodkärlstätheten vid ischemiska lesioner 21 dagar efter stroke . (A) Representativa bilder av koronala hjärnsektioner från möss som utsätts för (vänster) mellersta cerebral artär ocklusion (MCAo) eller (höger) MCAo + EMS och färgade med L. esculentum (Tomat) Lectin-Dy594, som binder till glykoproteiner i endotelcellernas basala membran. Grafer är kvantifierade områden. MCAo + EMS-möss visade högre endotelnätverk med hjälp av parametrar, nämligen vaskulär fraktionsarea ( B) och integrerad densitet (C). **p < 0,01 (oparat t-test), medan möss med endast MCAo visade skador nära den ischemiska lesionen (streckad linje). N = 5 möss/grupp= totalt 10 möss. Data är medelvärde ± S.D. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: Contra = kontralateral sida; Ipsi =ipsilateral sida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Encefalomyosynangios modulerar angiogena proteiner efter stroke. (A) En musangiogenesuppsättning (ARY015) användes för att samtidigt bedöma de relativa nivåerna av 53 musangiogenesrelaterade proteiner efter mellersta cerebral artärocklusion (MCAo) och MCAo + EMS (dag 21 efter MCAo) i hjärnvävnadslysater från perilesionell cortex. Kvantitativ analys visar att EMS-kirurgi signifikant minskade osteopontin och ökad fibroblasttillväxtfaktor (FGF) -surt protein efter stroke (* p < 0,05 eller ** p < 0,01) jämfört med ipsilateral MCAo. Data är medelvärde ± S.D.; n = 3 möss/grupp/tidpunkt = totalt 15 möss. (B) EMS ökade inte dödligheten efter stroke (MCAo). Kaplan Meiers överlevnadskurva visar att EMS + MCAO inte förändrade dödligheten efter stroke jämfört med MCAO ensam (p = 0,54). För EMS n = 3; för MCAo n = 11; och för MCAo + EMS n = 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en framgångsrik EMS-procedur i en musmodell av MCAo-inducerad stroke. Data visar att ympad vävnad förblir livskraftig och kan bilda bindningar med hjärnbarken långt efter EMS-operation. Dessa fynd stöder motiveringen för att använda ett cerebralt muskeltransplantat för att gradvis utveckla en rikt vaskulär trofisk miljö på strokeplatsen. EMS är en lovande terapi för att potentiellt reparera infarktisk hjärnvävnad i samma miljö.

De kritiska stegen i protokollet inkluderar steg 2.2.4: detta steg orsakar oundvikligt trauma mot TM, vilket kan minska dess förmåga att binda till cortex och frigöra trofiska faktorer. Var noga med att begränsa TM-trauma i den mån det är möjligt. En alternativ strategi för att minska vävnadstrauma är att trubbigt dissekera TM från skallen endast vid dess dorsala kant och avstå från myotomi. I detta fall skulle TM lyftas bort från skallen (snarare än helt reflekterad), och kraniotomin skulle utföras med kraniotomiborren under muskeln. Detta minskar mängden tillgängligt utrymme för att utföra detta steg men kan återigen minska TM-trauma. Vidare är extrem vård och övning nödvändig i steg 2.2.5 och 2.2.6 för att förhindra skada på den underliggande hjärnbarken under kraniotomi och manipulation av dura.

Denna EMS-modell är ett naturligt komplement till den väletablerade MCAo-modellen. Eftersom MCAo-modellen nära simulerar patofysiologin för ischemi och vaskulär nätverksskada, som är vanlig hos mänskliga patienter, kommer MCAo + EMS-modellen sannolikt att ha en hög nivå av översättning till människor. EMS-modellen som presenteras här är den första terapeutiska interventionen som har studerats för ischemisk stroke i preklinisk miljö som endast är beroende av autolog vävnad. Dessutom, eftersom TM-transplantatet är organiskt och autologt, kan det visa parakrina signalinteraktioner med den intilliggande skadade hjärnan som tjänar till att reglera frisättningen av trofiska faktorer till optimala nivåer vid olika tidpunkter.

Medan stroke skapar en proangiogen miljö och stimulerar angiogenes i sig26, är det inneboende svaret efter stroke inte tillräckligt för att förbättra vaskulär tillförsel i den skadade regionen på grund av subtröskelnivåer av angiogena faktorer. Här förbättrade EMS ytterligare FGF-surt proteinuttryck jämfört med stroke-bara djur. Detta protein styr indirekt neovaskularisering i samförstånd med andra tillväxtfaktorer. FGF-surt fungerar också som en neurotrofisk faktor, främja neuroprotektion och neurogenes27,28. Några av de neuroprotektiva effekterna av FGF-sura medieras genom aktivering av AKT- och MAPK / EPK-vägar29. Förutom FGF fanns det också minskat uttryck av proteinet osteopontin. Osteopontin är ett proinflammatoriskt, pleotropt cytokin som alltmer erkänns för sin roll i flera neuropatologier och vävnadsombyggnadsprocesser, bland andra funktioner. Osteopontins roll vid stroke är fortfarande osäker30. Nya studier på människor pekar dock på osteopontin som en dålig prognostisk faktor efter stroke. En minskning av osteopontinnivåerna i serum efter stroke visades i en studie förutsäga gynnsamma resultat (modifierad Rankin-skala poäng < 2 vid 90 dagar) hos humana patienter med stroke31. En annan studie visade ett dosberoende samband mellan högre nivåer av plasma osteopontin och resultat av död och funktionshinder hos mänskliga patienter efter stroke32. I linje med dessa kliniska studier tyder data här på att minskad osteopontin efter EMS kan främja en antiinflammatorisk miljö för att öka bildandet av neo-kärl. Sammantaget pekar det differentiella uttrycket av FGF-surt och osteopontin mot mekanismer som styr angiogenesen efter EMS i denna musmodell och ökar sannolikheten för att proceduren som också kan åstadkomma neuroprotektion och neuroregenerering utöver angiogenes.

Det finns några potentiella begränsningar för denna procedur. Att mäta hjärnflödet på grund av ökad blodkärlstäthet är utmanande i denna procedur, eftersom vanliga procedurer för laserdoppler eller laserspeckleflödesmätare påverkas av närvaron av temporalismuskel på toppen av cortex som förhindrar sann blodmätning på kortikal yta. Således kan denna procedur behöva mer sofistikerad, men sällan tillgänglig, liten gnagare MR-skanning om realtidsflödesmätning krävs. Användningen av mätning av blodkärlstäthet stöder emellertid indirekt framgången med EMS-förfarandet för att förbättra angiogenesen som föreslås av våra data. En annan begränsning är den invasiva karaktären hos EMS-ingrepp på toppen av MCAo, som i sig är ett invasivt förfarande. Även om det inte fanns någon ökad dödlighet med EMS i denna studie jämfört med endast MCAo, kan kravet på hemicraniektomi begränsa dess framtida översättningsbarhet för alla typer av stroke. I klinisk praxis kräver dock >10% av patienterna med stor ischemisk stroke hemicraniektomi för att hantera ökat intrakraniellt tryck23, och denna EMS-modell kan ha translationellt värde för denna undergrupp av strokepatienter i synnerhet. Slutligen valdes tidpunkten på 4 h efter MCAo för prestanda av EMS för att falla inom standardbehandlingsfönstret för rT-PA för de flesta mänskliga patienter, även om framtida studier kommer att använda senare tidpunkter för att utvärdera det terapeutiska fönstret för EMS.

Sammantaget ger EMS-modellen ett väl tolererat alternativ för att inducera angiogenes efter ischemisk stroke, och förutom dess potentiella kliniska översättning kan den användas i framtida studier som undersöker patofysiologin för stroke och angiogenes.

EMS-modellen som beskrivs här erbjuder en säker metod för att uppnå cerebral angiogenes för preklinisk studie, vilket undanröjer behovet av farmakologiska ingrepp, vilket ofta leder till oönskade biverkningar eller okontrollerad angiogenes. Många patienter med stora ischemiska stroke kräver en hemicraniektomi under sin kliniska kurs för att hantera ökande intrakraniellt tryck. Denna EMS-procedur, som också inkluderar hemicraniektomi hos möss för muskeltransplantation, kan ge prekliniskt bevis på koncept för translationell tillämpning av EMS vid ischemisk stroke. Därför har denna modell potential att utöka kunskapen om neurovaskulär återhämtning efter en ischemisk stroke och att underlätta utvecklingen av innovation, som är timmens behov, inom terapier för strokeöverlevande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Research Excellence Program-UConn Health (till Ketan R Bulsara och Rajkumar Verma) och UConn Health start-up (till Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

Neurovetenskap utgåva 184
En modell för encefalomyosynangios behandling efter mellersta cerebral artär ocklusion-inducerad stroke hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter