Summary
Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.
Abstract
Identificatie van genetische interacties is een krachtig hulpmiddel om de functies van gen(en) te ontcijferen door inzicht te geven in hun functionele relaties met andere genen en organisatie in biologische paden en processen. Hoewel de meerderheid van de genetische schermen aanvankelijk werden ontwikkeld in Saccharomyces cerevisiae, is een aanvullend platform voor het uitvoeren van deze genetische schermen geleverd door Schizosaccharomyces pombe. Een van de meest gebruikte benaderingen om genetische interacties te identificeren, is door overexpressie van klonen uit een genoombrede plasmidebibliotheek met een hoog aantal kopieën in een functieverliesmutant, gevolgd door selectie van klonen die het mutante fenotype onderdrukken.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van deze op 'multicopy suppression' gebaseerde genetische screening in S. pombe. Dit scherm heeft geholpen bij het identificeren van multikopie suppressor (s) van het genotoxische stressgevoelige fenotype geassocieerd met de afwezigheid van de Ell1 transcriptie-rekfactor in S. pombe. Het scherm werd geïnitieerd door transformatie van de query ell1 null mutante stam met een hoog-kopie-nummer S. pombe cDNA plasmide bibliotheek en het selecteren van de suppressors op EMM2 platen met 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), een genotoxische stress-inducerende verbinding. Vervolgens werd plasmide geïsoleerd uit twee op de shortlist geplaatste suppressorkolonies en verteerd door restrictie-enzymen om het insert-DNA vrij te maken. Plasmiden die een insert-DNA-fragment vrijgeven, werden opnieuw getransformeerd in de ell1-deletiestam om het vermogen van deze suppressorplasmideklonen te bevestigen om de groei van de ell1-deletiemutant te herstellen in aanwezigheid van 4-NQO en andere genotoxische verbindingen. Die plasmiden die een redding van het deletiefenotype vertoonden, werden gesequenced om de gen(en) te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van het ell1-deletie-geassocieerde genotoxische stressgevoelige fenotype.
Introduction
Netwerken van genetische interacties bieden functionele informatie over genen en bakenen routes en biologische processen af waar deze genen in vivo bij betrokken kunnen zijn. Daarnaast kunnen ze ook inzicht geven in hoe verschillende genen op elkaar inwerken, wat resulteert in een specifiek fenotype 1,2,3. In de loop der jaren zijn verschillende genetische schermen ontworpen door onderzoekers om fundamentele biologische vragen te beantwoorden en menselijke ziekten te bestuderen. Screenings voor de identificatie van genetische interacties kunnen op meerdere manieren worden uitgevoerd. Genetische interacties geïdentificeerd in verschillende genetische schermen kunnen verschillende mechanistische relaties tussen genen vertegenwoordigen. Bovendien hebben studies aangetoond dat een gemeenschappelijke reeks genetische interacties wordt gedeeld door genen die coderen voor eiwitten die tot dezelfde route of complex behoren 4,5. Genetische interactienetwerken kunnen dus worden gebruikt om de functionele organisatie in een cel vast te stellen, waarbij genen die de meest vergelijkbare profielen delen tot hetzelfde complex of dezelfde route behoren, die genen die iets minder vergelijkbare profielen delen tot hetzelfde biologische proces behoren en die genen overlappende maar meer diverse profielen weerspiegelen leden die tot hetzelfde cellulaire compartiment behoren6.
Genetische interactieschermen op basis van doseringsonderdrukking ('high-copy or multicopy suppression') zijn een van de meest gebruikte benaderingen. Deze schermen kunnen worden uitgevoerd door een querymutantenstam te transformeren met een genomische of cDNA-bibliotheek met een hoog kopieernummer, gevolgd door geschikte assays / selectietechnieken om onderdrukkende of verbeterende genetische interacties te identificeren 7,8,9. Om een uitgebreide genoombrede dekking te garanderen, zijn deze schermen ook uitgevoerd door een specifiek gen van belang te overexpresseren in een verzameling genoombrede functieverliesmutanten of door een hoog-kopie-nummer plasmide-gecodeerde genomische of cDNA-bibliotheek te overexpresseren in een functieverlies-querymutant 9,10,11,12,13,14,15 . De multikopiestrategie kan ook werken met behulp van een dominante / overexpressiebenadering met behulp van een regelbare promotor.
De belangrijkste voordelen van het gebruik van suppressor-gebaseerde schermen zijn dat onderdrukking van een reeds bestaand fenotype in een mutante stam door een ander gen een genetische relatie tussen deze twee genproducten tot stand brengt die mogelijk niet is aangetoond met behulp van andere benaderingen. Ten tweede is waargenomen dat de aanwezigheid van een reeds bestaande mutatie een bepaalde route sensibiliseert, waardoor extra componenten van die route kunnen worden geïdentificeerd door de isolatie van suppressors, die mogelijk niet zijn geïdentificeerd door meer directe genetische selecties. Bovendien kan dit scherm worden gebruikt om onderdrukkers te identificeren die verschillende mechanismen van onderdrukking hebben16. Suppressorinteracties komen meestal voor tussen genen die functioneel verwant zijn en kunnen worden gebruikt om hiërarchieën in paden op te helderen. Het exacte onderliggende mechanisme van onderdrukking kan verschillen op basis van verschillende factoren, waaronder het type querymutant dat in het scherm wordt gebruikt, experimentele omstandigheden en het niveau van genexpressie. Een van de gebruikelijke doseringsonderdrukkingsmechanismen omvat genen die coderen voor producten die samen functioneren in hetzelfde complex of parallel in hetzelfde cellulaire / biologische proces. De resultaten van dergelijke screenings in eenvoudigere modelorganismen zoals gist kunnen worden uitgebreid naar hogere eukaryote organismen, omdat de meeste fundamentele biologische routes en processen gedurende de evolutie worden bewaard.
Deze genetische schermen kunnen ook op verschillende manieren worden aangepast om verschillende biologische vragen te beantwoorden. Orthologe genen van verschillende organismen die het fenotype van de querymutantenstam kunnen onderdrukken, kunnen bijvoorbeeld worden geïdentificeerd. Het is ook gebruikt om potentiële resistentiemechanismen af te bakenen en eiwitdoelen te bepalen van nieuwe antibacteriële 17,18, antischimmel19,20, antiparasitaire21 en antikanker22 verbindingen. Dit scherm is ook gebruikt om onderdrukkers van de activiteit van farmaceutische geneesmiddelen te identificeren waarvan het werkingsmechanisme niet bekend is. Zo kunnen deze multicopy suppressor schermen in principe worden geoptimaliseerd en gebruikt in een verscheidenheid aan toepassingen in verschillende organismen. Hoewel de meeste genetische schermen die door gistonderzoekers worden gebruikt, aanvankelijk zijn ontwikkeld in S. cerevisiae, is S. pombe naar voren gekomen als een complementair modelsysteem voor het uitvoeren van verschillende genetische schermen en testen23. Bovendien vertonen genomische organisatie en biologische processen in S. pombe, zoals het voorkomen van introns in meer genen, complexiteit van de oorsprong van DNA-replicatie, centromeerstructuur, organisatie van de celcyclus en aanwezigheid van de RNAi-machinerie, een grotere gelijkenis tussen S. pombe en hogere eukaryoten23,24, wat het belang onderstreept van het ontwerpen en gebruiken van genetische hulpmiddelen in S. pombe.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het identificeren van genetische interactoren op basis van 'doseringsonderdrukking' van een mutant fenotype met functieverlies in S. pombe. De basis van dit protocol is dat het een snelle en efficiënte methode is om een cDNA-bibliotheek te screenen die wild-type genen overexpressie geeft, hetzij op een multicopy plasmide en / of van een sterke promotor. Dit protocol heeft vier hoofdstappen: transformatie van de bibliotheek in een querymutantenstam, selectie van plasmideklonen die het gewenste fenotype van de querymutantenstam onderdrukken, het ophalen van de plasmide(n) uit deze suppressorklonen en identificatie van het gen dat verantwoordelijk is voor de onderdrukking van het fenotype. Zoals geldt voor elke methode op basis van de selectie en identificatie van cDA's uit een bibliotheek, is het succes van het scherm afhankelijk van het gebruik van een bibliotheek van hoge kwaliteit en hoge complexiteit, omdat het scherm alleen die cDNA-klonen kan ophalen die in de bibliotheek aanwezig zijn.
Met behulp van dit protocol hebben we met succes twee nieuwe suppressors van het genotoxische stressgevoelige fenotype van de query S. pombe ell1 null mutant geïdentificeerd. De ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) familie van transcriptie-rekfactoren onderdrukken voorbijgaande pauzes van RNA-polymerase II op DNA-sjablonen in in vitro biochemische assays en worden bewaard in verschillende organismen, van splijtingsgist tot mensen25. Eerder werk heeft bewijs geleverd dat een S. pombe ell1 null mutant genotoxische stressgevoeligheid vertoont in de aanwezigheid van 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) en methylmethaansulfonaat (MMS)26. Daarom transformeerden we een S. pombe plasmide-gecodeerde multicopy cDNA-bibliotheek in de query S. pombe ell1 null mutant en identificeerden we twee vermeende klonen die het vermogen vertoonden om de genotoxische stressgevoeligheid van de S. pombe ell1 null mutant te onderdrukken in de aanwezigheid van 4-NQO, een verbinding die DNA-laesies induceert. Latere sequencing van de insert aanwezig in de plasmideklonen identificeerde dat de genen die coderen voor rax2+ en osh6+ verantwoordelijk waren voor het onderdrukken van de genotoxische stressgevoeligheid van ell1 null mutant wanneer overexpressie in de ell1 null mutant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformatie van de cDNA-bibliotheek in de query S. pombe mutant strain om te screenen op multicopy suppressors
OPMERKING: De standaard lithium-acetaatmethode27 werd gevolgd om de S. pombe cDNA-bibliotheek om te zetten in de query S. pombe ell1Δ-stam met een paar wijzigingen:
- Kweek de S. pombe ell1Δ-stam bij 32 °C op een YE-medium (tabel 1) plaat aangevuld met 225 μg/ml adenine, leucine en uracil. Ent een lus vol entmateriaal van ell1Δ-stam van de bovenstaande plaat in 15-20 ml YE-medium aangevuld met 225 μg / ml elk van adenine, leucine en uracil. Incubeer het 's nachts bij 32 °C met schudden (200-250 tpm).
- Verdun de volgende dag de nachtcultuur in 100 ml vers YE-medium met de gewenste supplementen tot een OD600 nm (optische dichtheid bij 600 nm) van 0,3 en incubeer het bij 32 ° C met schudden bij 200-250 tpm totdat de OD600 nm de mid-logfase bereikt.
- Verdeel de 100 ml cultuur in twee centrifugebuizen van 50 ml, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 4.000 × g.
- Gooi het supernatant weg en was de celkorrel met 1 ml steriel water, d.w.z. resuspenseer de cellen in 1 ml steriel water en centrifugeer op 4.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en was elke celpellet met 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM lithiumacetaat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) oplossing zoals beschreven in stap 1.4.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer elke celpellet in 250 μL 1x LiAc-TE. Gebruik deze S. pombe competente cellen (500 μL) voor transformatie met het DNA van belang. Breng 125 μL van de competente cellen over in vier verschillende steriele microcentrifugebuizen voor volgende transformatiestappen.
- Kook drager-DNA van zalmtestes of haringsperma gedurende 1 min en plaats het onmiddellijk op ijs. Voeg voor elke transformatie 10 μL 10 mg/ml gedenatureerd, enkelstrengs drager-DNA toe aan de microcentrifugebuis die 125 μL van de competente cellen bevat, gevolgd door voorzichtig mengen met behulp van een micropipettepunt. Voeg vervolgens 50 μg van de S. pombe cDNA-bibliotheek toe aan de competente cellen-drager DNA-mengselbevattende microcentrifugebuis.
- Incubeer de microcentrifugebuizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en voeg vervolgens 260 μL polyethyleenglycol-lithiumacetaatoplossing (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM lithiumacetaat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) toe aan de buizen en meng voorzichtig met behulp van een micropipettetip.
- Incubeer de microcentrifugebuizen met het transformatiemengsel bij 32 °C gedurende 2 uur zonder te schudden. Voeg 43 μL voorgewarmd dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Stel de buizen vervolgens gedurende 5 minuten bloot aan een hitteschok bij 42 °C.
- Pelleteer de cellen op 4.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en verwijder de resterende PEG- LiAc-TE-oplossing met behulp van een micropipettetip.
- Resuspensieer de cellen in 100 μL steriel water en plaat op één EMM2 (tabel 1) plaat (150 mm) met de vereiste supplementen en 0,2 μg/ml 4-NQO.
- Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 5-6 dagen om kolonies op de platen te laten verschijnen. Streep de verkregen kolonies op dezelfde mediumplaat in aanwezigheid van 0,2 μg/ml 4-NQO en gebruik voor verdere screening.
- Gebruik voor één bibliotheektransformatie-experiment 500 μL competente cellen (125 μL competente cellen x 4 microcentrifugebuizen) voor transformatie zoals beschreven in stappen 1,8 tot 1.14 hierboven.
- Als controle, plaat 1/10e van het transformatiemengsel op één EMM2-plaat (150 mm) met de vereiste supplementen, maar zonder 4-NQO, om het totale aantal bibliotheekklonen te berekenen dat is verkregen na transformatie van de bibliotheek, en scherm voor isolatie van de suppressorklonen.
2. Test en valideer de redding/onderdrukking van het fenotype geassocieerd met de querymutantenstam door de vermeende suppressor
OPMERKING: Stressvlektests werden uitgevoerd zoals hieronder beschreven om de redding /onderdrukking van de ell1-deletie-geassocieerde 4-NQO-stressgevoeligheid door de vermeende suppressor (s) te testen en te valideren.
- Voeg 100-200 μL steriel water toe in elk van de verschillende putten van een steriele 96-well microtiter plaat.
- Kies een kleine hoeveelheid entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies verkregen na cDNA-bibliotheektransformatie op de plaat met 4-NQO met behulp van een steriele tandenstoker of een 20-200 μL micropipettepunt. Voeg het entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies toe in afzonderlijke onafhankelijke putten van de microtiterplaat met 100-200 μL steriel water. Meng.
- Spot 3 μL van de celsuspensie van elke put op EMM2-agarplaten die adenine (225 μg / ml) en uracil (225 μg / ml) bevatten, maar geen leucine bevatten (de selecteerbare auxotrofe marker die aanwezig is op de plasmidevector die wordt gebruikt voor de constructie van de bibliotheek die in dit werk wordt gebruikt). Voeg indien nodig de juiste concentraties van 4-NQO toe aan de platen.
- Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 3-4 dagen om de cellen te laten groeien. Identificeer de kolonies die groei vertonen in de aanwezigheid van verschillende concentraties 4-NQO als vermeende onderdrukkers.
- Om de suppressors verder te valideren, kweekt u de geselecteerde suppressors samen met de juiste controlestammen 's nachts bij 32 °C met schudden (200-250 rpm) in EMM2-medium dat 225 μg / ml elk van adenine en uracil bevat, maar geen leucine bevat.
- Verdun de cellen de volgende dag tot een OD600 nm van 0,3 in vers EMM2-medium en laat ze groeien bij 32 °C met schudden tot halverwege de logfase (ongeveer OD600 nm van 0,6-0,8).
- Zoek geschikte seriële verdunningen (1:10 of 1:5) van culturen op EMM2-platen met de vereiste supplementen die 0,4 μM 4-NQO of 0,01% MMS bevatten. Voor controle, spot de stammen op een EMM2-plaat met de vereiste supplementen, maar zonder DNA-beschadigend middel.
- Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 3-5 dagen om de groei te controleren.
OPMERKING: Geschikte testen op basis van het fenotype geassocieerd met de query mutantenstam moeten worden gebruikt om de redding of onderdrukking van het fenotype te testen. Als bijvoorbeeld onderdrukkers van een koudgevoelig fenotype van een querymutantenstam moeten worden geïdentificeerd, zou de test voor het testen en valideren van de suppressorklonen het kweken van transformatoren bij lage temperatuur omvatten. - Spot de mutante stammen die zijn getransformeerd met een gen van belang over de volledige lengte (Spell1 in dit geval) of lege vector als respectievelijk positieve en negatieve controles, samen met de bibliotheektransformaties.
3. Isolatie van het plasmide van de S. pombe suppressor klonen
OPMERKING: Plasmide-isolatie van S. pombe werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in Splijtingsgist: een laboratoriumhandleiding28 met enkele wijzigingen.
- Ent een enkele gistkolonie in EMM2-medium met 225 μg / ml adenine en uracil en laat de cellen 's nachts groeien bij 32 ° C met schudden bij 200-250 tpm. Oogst de volgende dag 5 O.D.-cellen (d.w.z. 10 ml cultuur van O.D. 0,5) door centrifugeren gedurende 2 minuten bij 4.000 × g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,2 ml lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) en 1 mM Na2EDTA).
- Voeg 0,2 ml fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) en 0,3 g met zuur gewassen glasparels toe aan de microcentrifugebuis. Vortex de microcentrifugebuis gedurende 2 min bij 4 °C en incubeer op ijs gedurende 1 min. Herhaal deze stap 6x.
- Centrifugeer de buis op 10.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige laag over in een verse microcentrifugebuis en voeg 200 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) toe.
- Centrifugeer de buis op 10.000 × g gedurende 10 minuten. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg twee volumes 100% ethanol (~ 400 μL) en 1/10 volume natriumacetaat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) toe aan de buis. Incubeer de microcentrifugebuis -70 °C gedurende 1 uur.
- Zet het DNA neer door centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellet met 70% ethanol (~500 μL) en houd deze op kamertemperatuur om aan de lucht te drogen.
- Resuspendeer het DNA in 20 μL steriel water. Gebruik 2-5 μL plasmide-DNA voor de transformatie van competente E. coli-cellen .
OPMERKING: Plasmide kan ook worden geïsoleerd uit gistcellen met behulp van een van de in de handel verkrijgbare gistplasmide-isolatiekits.
4. Identificatie van het gen gecodeerd door de suppressor kloon
- Transformeer de geïsoleerde gistplasmiden in E. coli Top10 stam [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] met behulp van het standaardprotocol29 en verspreid de cellen op LB (Luria Broth) platen met de benodigde antibiotica.
- Isoleer de plasmide(n) uit E. coli-transformatoren met behulp van het standaard alkalische lysisprotocol29 en volg de juiste combinaties van restrictie-enzymen om te controleren op het vrijkomen van het insert-DNA-fragment door restrictieve vertering.
OPMERKING: Suppressorplasmide 84 werd verteerd met BamHI-restrictie-enzym en Suppressorplasmide 104 werd verteerd met PstI/ BamHI-restrictie-enzymen. - Vervorm de plasmiden met insertafgifte na restrictievertering in de ell1Δ-stam om te controleren op hun vermogen om het genotoxische stressgevoelige fenotype van de ell1Δ-stam te redden.
- Selecteer de plasmideklonen die de onderdrukking van de genotoxische stressgevoeligheid laten zien en rangschik het insert-DNA-fragment dat aanwezig is in deze plasmideklonen met behulp van vectorspecifieke voorwaartse en omgekeerde primers.
OPMERKING: In deze studie werd de adh1 promotor-specifieke universele forward primer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') gebruikt30. - Om het gen te identificeren dat verantwoordelijk is voor de onderdrukking, lijnt u de sequentie uit die is verkregen met behulp van NCBI-nucleotideblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) of Pombase-sequentie-uitlijningstool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selecteer de sequentie die de maximale uitlijning weergeeft en identificeer deze als het gen voor het multicopy suppressorplasmide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening op multikopie suppressor(s) van ell1 deletie-geassocieerde genotoxische stressgevoeligheid bij S. pombe
We voerden de genetische screening uit met behulp van het hierboven beschreven protocol om multikopie-suppressoren van het functieverliesfenotype van de query ell1-deletiemutantenstam te identificeren. De groeigerelateerde gevoeligheid van de ell1-deletiestam waargenomen in aanwezigheid van het 4-NQO genotoxische middel werd aangenomen als het fenotype voor functieverlies om te selecteren op multicopy suppressors. Figuur 1 toont een schematische weergave van het genetische scherm. Om het scherm te beginnen, werd de genotoxische stressgevoeligheid van de ell1-deletiemutant (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) voor het eerst bevestigd met betrekking tot zijn isogene wildtype stam (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) in aanwezigheid van 4-NQO (figuur 2A). Vervolgens werd de query S. pombe ell1 null mutant getransformeerd met een high-copy-number S. pombe cDNA bibliotheek om te selecteren op die plasmide klonen die de 4-NQO groei-gerelateerde gevoeligheid van de ell1 null mutant konden onderdrukken/redden. Deze bibliotheek bevat ~6 × 105S. pombe cDNA fragmenten gekloond in de pLEV3 S. pombe overexpressie vector onder controle van de adh1 promotor30. Als controle werd 1/10e van het transformatiemengsel ook verguld op EMM2-platen zonder 4-NQO om het totale aantal recombinante klonen te berekenen dat werd verkregen na transformatie van de bibliotheek, een indicatie van de dekking van de bibliotheek, en gescreend op isolatie van de suppressorklonen. Dit is van cruciaal belang, omdat het screenen van minder klonen de mogelijkheid om de suppressorklonen te identificeren zal verminderen.
Figuur 2B toont representatieve beelden van de controle en 4-NQO-bevattende platen. Zoals te zien is in de figuur, wordt een groot aantal kolonies verkregen op de controleplaat zonder 4-NQO met een goede dekking van de bibliotheek. Zoals verwacht werden er minder transformatoren verkregen op de 4-NQO-plaat, omdat deze transformatoren waarschijnlijk de vermeende suppressoren van de 4-NQO-gevoeligheid van de ell1 null-mutant vertegenwoordigen. Vervolgens werden de verschillende transformatiekolonies verkregen op EMM2-platen met 0,2 μM 4-NQO verder gestreept of gespot op EMM2-platen met 0,2 μM 4-NQO om het vermogen van deze transformatoren om te groeien in de aanwezigheid van 4-NQO te bevestigen. Er werd waargenomen dat 620 transformatorkolonies konden groeien op 0,2 μM 4-NQO-bevattende EMM2-platen.
Validatie van het vermogen van de vermeende suppressorklonen om de groei van ell1-deletiemutant onder genotoxische stressomstandigheden te herstellen
Om de vermeende suppressoren te bevestigen, is het belangrijk om de redding van het gewenste fenotype te testen onder omstandigheden met een hogere stringentie, zoals weergegeven in de schematische weergave (figuur 3A). Daarom werden de 620 genomineerde transformatoren gespot op EMM2-platen met 0,4 μM 4-NQO. Zoals te zien is in figuur 3B, vertoonden slechts 74 transformatoren een groei van 0,4 μM 4-NQO. Vervolgens werden deze 74 transformatoren gespot op EMM2-platen met 0,8 μM 4-NQO, en er werd waargenomen dat slechts 16 groei vertoonden in de aanwezigheid van 0,8 μM 4-NQO (figuur 3C). Om deze waarnemingen verder te bevestigen, werden deze 16 transformatoren gespot op EMM2-platen met de vereiste supplementen, die ofwel 0,8 μM 4-NQO of geen 4-NQO (controle) bevatten, samen met de ell1-deletiemutant getransformeerd met lege vector. Resultaten van deze spotting assays onthulden dat, zoals verwacht, de ell1-deletiestam getransformeerd met lege vector, evenals alle 16 transformatoren, groei vertoonden op de plaat zonder 4-NQO. Ter vergelijking: terwijl de ell1-deletiemutant die alleen de lege vector bevatte, geen groei vertoonde bij 0,8 μM 4-NQO, vertoonden zes transformanten groei bij 0,8 μM 4-NQO (figuur 3D), wat suggereert dat de bibliotheekkloon (en) die erin aanwezig waren het vermogen hadden om het genotoxische stressfenotype van de ell1 null-mutant te onderdrukken.
Identificatie van het gen gecodeerd door de suppressor kloon
Vervolgens selecteerden we 02 genetische onderdrukkers van de ell1-deletiestam, sup 84 en sup 104, die volledige onderdrukking van de ell1-geassocieerde groeigevoeligheid in aanwezigheid van 4-NQO lieten zien. De bibliotheekplasmidekloon(en) werd geïsoleerd uit deze twee gistonderdrukkers en omgezet in competente E. coli-cellen. Vervolgens werd plasmide geïsoleerd uit E. coli-cellen met behulp van standaardprotocollen31. De twee geïsoleerde plasmiden, gelabeld als 84 en 104, werden onderworpen aan restrictieve spijsvertering, wat de aanwezigheid van respectievelijk ongeveer 1.000 bp en 800 bp insert DNA-fragmenten onthulde (figuur 4A, B). Om de resultaten van dit suppressorscherm verder te valideren, werden deze plasmiden opnieuw omgevormd tot de ell1-deletiemutant en gecontroleerd of ze de groei van de ell1-nulmutant in aanwezigheid van 4-NQO konden herstellen. De stressvlektests onthulden dat de suppressorplasmide-klonen resulteerden in de onderdrukking van de 4-NQO-geassocieerde groeigevoeligheid wanneer ze opnieuw in de ell1 null-mutant werden geïntroduceerd, wat suggereert dat de onderdrukking plasmide-afhankelijk was (figuur 4C). Verder besloten we om te bepalen of deze suppressorklonen ook de groeigerelateerde gevoeligheid van de ell1-deletiestam konden onderdrukken in aanwezigheid van een andere DNA-schade-inducerende verbinding, MMS. De spottests toonden aan dat transformatie van de suppressorplasmideklonen in de ell1 null-mutant resulteerde in meer groei op MMS-bevattend medium dan transformatie van de ell1-deletiemutant met lege vector, wat aangeeft dat deze plasmideklonen de genotoxische stressgevoeligheid van de ell1-deletiemutant in aanwezigheid van beide genotoxische middelen konden onderdrukken, d.w.z. 4-NQO en MMS (figuur 4D).
Vervolgens, om het gen te identificeren dat aanwezig is in deze suppressorplasmideklonen, werd sequencing van het insert DNA-fragment uitgevoerd met behulp van de adh1 promotor-specifieke universele forward primer30. De verkregen nucleotidesequentie werd doorzocht met behulp van de 'BLAST at Ensembl'-tool die beschikbaar was op de PomBase-website (https://www.pombase.org), waaruit bleek dat de twee plasmideklonen 84 en 104 respectievelijk rax2+ en osh6+ genen bevatten, wat bewijs levert dat Rax2 en Osh6 verantwoordelijk waren voor het onderdrukken van het genotoxische stressgevoelige fenotype geassocieerd met de afwezigheid van ell1 + in S. pombe . De kennis over de functies van beide eiwitten in S. pombe is beperkt. Van Rax2 is aangetoond dat het de lokalisatie van For3p reguleert om de celpolariteit tijdens vegetatieve groei in S. pombe32 te regelen. Osh6 is een lipidetransporteiwit dat behoort tot de oxysterolbindende eiwitgerelateerde eiwitfamilie. Het is betrokken bij het transport van fosfatidylserine van het endoplasmatisch reticulum naar het plasmamembraan33.
Figuur 1: Schematische weergave van het genetische multikopie suppressorscherm. Dit protocol heeft vier hoofdstappen: transformatie van de bibliotheek in een querymutantenstam, selectie van plasmideklonen die het gewenste fenotype van de querymutantenstam onderdrukken, het ophalen van de plasmide(n) uit deze suppressorklonen en identificatie van het gen dat verantwoordelijk is voor de onderdrukking van het fenotype. Afkorting: 4-NQO = 4-nitroquinoline 1-oxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Screening op multicopy suppressor(s) van ell1 deletie-geassocieerde genotoxische stressgevoeligheid in S. pombe. (A) Stressvlektest die 4-NQO-gevoeligheid van ell1-verwijderde S. pombe-stam aantoont in vergelijking met de isogene wildtypestam. Seriële verdunningen (1:10) van geschikte stammen werden waargenomen op EMM2-medium met 225 μg/ml elk van adenine, leucine en uracil met of zonder (controle) 0,4 μM 4-NQO. Platen werden vervolgens gedurende 3-5 dagen geïncubeerd bij 32 °C. (B) Een cDNA-bibliotheek met een hoog kopieernummer werd getransformeerd in ell1-verwijderde S. pombe-stam en getransformeerde kolonies werden verguld op EMM2-medium zonder leucine maar met 0,2 μM 4-NQO. Een kleine aliquot van het transformatiemengsel werd ook verguld op EMM2-platen zonder 4-NQO, als controle. Platen werden gedurende 5-6 dagen geïncubeerd bij 32 °C en gefotografeerd. Paneel B toont een representatieve afbeelding van deze platen. Afkorting: 4-NQO = 4-nitroquinoline 1-oxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van het vermogen van vermeende suppressorklonen om de genotoxische stressgevoeligheid van de ell1-deletiemutant te onderdrukken. (A) Een schematische weergave van de screening van de bibliotheektransformatoren door het testen van onderdrukking van het gewenste fenotype. De groei van 620 transformatoren werd getest op toenemende concentraties van 4-NQO door verschillende transformatoren te spotten op EMM2-platen zonder leucine en die (B) 0,4 μM 4-NQO of (C) 0,8 μM 4-NQO bevatten. Platen werden gedurende 5-6 dagen geïncubeerd bij 32 °C en gefotografeerd. Er zijn representatieve afbeeldingen van platen getoond. (D) Zestien transformatoren die groei vertoonden op 0,8 μM 4-NQO werden gespot op EMM2-platen zonder leucine, maar met 0,8 μM 4-NQO of geen 4-NQO (controle), samen met de ell1-deletiestam getransformeerd met lege vector. Platen werden gedurende 5-6 dagen geïncubeerd bij 32 °C en gefotografeerd. Slechts zes kolonies vertoonden het vermogen om ell1-deletie geassocieerde genotoxische stressgevoeligheid te redden. Afkorting: 4-NQO = 4-nitroquinoline 1-oxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Identificatie van de suppressorplasmideklonen. Agarose gel beelden van (A) restrictie vertering van suppressor plasmide 84 met BamHI restrictie enzym vrijgegeven een insert van ~ 1 kb. (B) Suppressorplasmide 104 verteerd met PstI/ BamHI-restrictie-enzymen gaf een insert van ~ 800 bp vrij. (C) 1:10 serieel verdunde ell1 null-mutant getransformeerd met plasmiden, sup 84 of sup 104, werden gespot op EMM2-platen zonder leucine en bevattend 0,4 μM 4-NQO of (D) 0,01% MMS. In controleplaten werd geen DNA-beschadigend middel toegevoegd. Platen werden gedurende 4-5 dagen geïncubeerd bij 32 °C en gefotografeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van media voor de groei van S. pombe. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gisten zijn op grote schaal gebruikt om de fundamentele biologische processen en routes te onderzoeken die evolutionair geconserveerd zijn in eukaryote organismen. De beschikbaarheid van genetische en genomische hulpmiddelen samen met hun vatbaarheid voor verschillende biochemische, genetische en moleculaire procedures maken gisten een uitstekend modelorganisme voor genetisch onderzoek 34,35,36. In de loop der jaren zijn verschillende genetische schermen ontworpen door gistonderzoekers om genetische interacties te identificeren die licht zouden werpen op de functies van individuele gen (en), evenals de paden en biologische processen waarbij ze betrokken kunnen zijn 10,11,17,37. Een van de meest voorkomende en nuttige schermen om genetische interacties te identificeren staat bekend als 'multicopy of high copy number suppression'.
Dit scherm vereist een querymutante stam(en) die een functieverliesfenotype vertonen, gevolgd door transformatie van deze mutante querystam(s) met een genomische of cDNA-bibliotheek met een hoog kopieernummer. Vervolgens worden de verkregen transformatoren gescreend om die genen te identificeren, die, wanneer ze overexpressie vertonen, het fenotype onderdrukken dat geassocieerd is met de querymutante stam (en). Dit type genetische interactie tussen de specifieke mutante stam en gen(en) aanwezig in de plasmidebibliotheekklonen resulteert in de isolatie en identificatie van genproducten die waarschijnlijk in dezelfde route werken of hetzelfde biologische proces beïnvloeden4. Zo geeft dit scherm inzicht in de functies van het (de) gen(en) van belang en hun functionele organisatie in pathways en biologische processen in vivo. Traditioneel wordt dit scherm veel gebruikt in S. cerevisiae 38,39,40,41,42.
Het doel van dit werk is om een eenvoudig en ongecompliceerd protocol te beschrijven voor het uitvoeren van een multicopy suppressie genetische screening in S. pombe. We voerden het scherm uit met behulp van een S. pombe-stam met een deletie van de ell1-transcriptie-rekfactor. ELL is een familie van transcriptie-rekfactoren, die aanwezig zijn in een breed scala van organismen, van splijtingsgist tot mensen. De functies van Ell1 beginnen pas begrepen te worden in S. pombe. Eerder werk had de rol van Ell1 benadrukt in optimale groei tijdens normale groeiomstandigheden en in overleving tijdens genotoxische stressomstandigheden26. We hebben de multicopy suppressor screening gebruikt als een van de benaderingen om het moleculaire mechanisme te ontdekken dat ten grondslag ligt aan de rol van Ell1 in genotoxische stressgevoeligheid in S. pombe26. Een multicopy plasmide-gecodeerde S. pombe cDNA-bibliotheek werd getransformeerd in de S. pombe ell1 null-mutant die gevoeligheid voor 4-NQO vertoont. Vervolgens werden de transformatoren geselecteerd die konden groeien in de aanwezigheid van 4-NQO.
Isolatie van plasmiden uit deze transformatoren en sequencing van inserts aanwezig in deze plasmiden leidde tot de identificatie van twee nieuwe genetische interactoren van ell1+ in S. pombe, rax2+ en osh6+. Een eerdere studie met behulp van een vergelijkbare genetische screening in S. pombe heeft ook het anti-uitschakelingseiwit, epe1 +, geïdentificeerd als een multicopy suppressor van de ell1-deletie-geassocieerde fenotypen43. We hebben deze methode ook gebruikt bij het identificeren van de multikopie-suppressoren van de niet-essentiële Rpb9-subeenheid van S. pombe RNA-polymerase II (ongepubliceerde waarnemingen). Gezamenlijk valideren deze resultaten het nut van de genetische multicopy suppressor screeningsbenadering als een methode om vermeende genen / eiwitten te identificeren die genetische interactie vertonen met een gewenst gen van belang, waarbij de functie, paden en processen worden opgehelderd waarin het gen van belang betrokken kan zijn.
Om het scherm te gebruiken dat in dit werk wordt beschreven, is het belangrijk om eerst een querymutantenstam te hebben die een duidelijk fenotype vertoont dat geassocieerd is met de mutatie, die kan worden gebruikt om de multicopy suppressor (s) te isoleren. Bovendien zal het succes van dit scherm afhangen van de beschikbaarheid van een hoogwaardige en goed representatieve bibliotheek met klonen die het maximale aantal wildtypegenen of hun bijbehorende cDA's vertegenwoordigen. Traditioneel worden zowel genomische als cDNA-bibliotheken in deze schermen gebruikt, maar cDNA-bibliotheken hebben het voordeel dat ze zijn gemaakt van mRNA's die tot expressie komen in de cel / het organisme. Bovendien is een hoge efficiëntie van de transformatie in de gistcellen noodzakelijk voor het succes van het scherm, omdat het belangrijk is om een groot aantal transformanten te screenen, waardoor de kans op het identificeren van onderdrukkers toeneemt. Als er minder transformatoren worden verkregen op de regelplaat na transformatie van de bibliotheek in de querymutantstam met behulp van het lithiumacetaatprotocol, kan elektroporatie worden gebruikt om de bibliotheek te transformeren.
Het is ook raadzaam om het transformatieprotocol eerst te standaardiseren met een ander plasmide voordat de bibliotheek wordt getransformeerd. Anders leidt het onnodig tot verlies van de bibliotheek. Het hier beschreven protocol gebruikt 4-NQO-gevoeligheid als het mutante fenotype, maar geschikte screeningmethoden / assays moeten worden ontworpen voor selectie van suppressors op basis van het specifieke mutante fenotype van belang. Als er geen of zeer weinig transformatoren op de plaat worden verkregen om te selecteren op suppressors na transformatie van de bibliotheek in de querymutantenstam, dan moeten indien mogelijk minder strenge voorwaarden / assays worden gebruikt bij het platen van de bibliotheek om te selecteren op suppressors om zoveel mogelijk genetische suppressors te detecteren voordat die onder zeer stringentieve omstandigheden worden bevestigd. Naast het gebruik van restrictievertering om te testen op de aanwezigheid van de insert in de geïdentificeerde suppressorplasmide-klonen, kan PCR met behulp van vectorspecifieke primers worden gebruikt om het gewenste insert-DNA-fragment te versterken. Als alternatief kunnen de suppressorplasmide-klonen direct worden gegeven voor sequencing, waardoor de noodzaak van restrictieve spijsvertering of PCR wordt vermeden.
Dit scherm kan ook worden toegepast voor andere gisten dan S. cerevisiae en S. pombe als er een genetische gereedschapskist met betrekking tot geschikte mutante stammen, plasmiden en promotorconstructies beschikbaar is die overexpressie van genen zou vergemakkelijken, waardoor mutant fenotype in de gastheergistcel kan worden gered. Bovendien kan dit scherm, met de beschikbaarheid van genoombrede bronnen, waaronder verzameling van genoombrede deletiemutanten44 en overexpressiebibliotheken37, ook worden uitgevoerd door transformatie van een of enkele queryplasmiden in een systematische array van gistmutante stamcollectie of door transformatie van een systematische array van overexpressieplasmideverzameling in een of enkele gemuteerde querystammen45 . Kortom, deze benadering kan duidelijk worden gegeneraliseerd naar een breed scala aan experimentele vragen in verschillende organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een onderzoekssubsidie van het Department of Biotechnology, Government of India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) naar Nimisha Sharma. De auteurs bedanken Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) voor de schenking van de S. pombe cDNA bibliotheek en Prof. Susan Forsburg voor de gist plasmiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
References
- Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
- Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
- Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
- Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
- Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
- Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
- Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
- Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
- Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
- Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
- Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
- Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
- Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
- Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
- Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
- Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
- Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
- Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
- Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
- Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
- Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
- Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
- Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
- Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
- Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
- Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
- Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
- Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
- Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
- Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
- Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
- Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
- Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).
