Summary
这项工作描述了 在Pombe裂殖酵母中进行多拷贝抑制遗传筛选的方案。该筛选使用全基因组质粒文库来鉴定与查询突变菌株相关的功能丧失表型的抑制克隆。使用该筛选鉴定 ell1 零突变体的新型遗传抑制因子。
Abstract
遗传相互作用的鉴定是通过深入了解基因与其他基因的功能关系以及生物途径和过程的组织来破译基因功能的有力工具。虽然大多数遗传筛选最初是在 酿酒酵母中开发的,但 Pombe裂殖酵母提供了进行这些遗传筛选的补充平台。用于鉴定遗传相互作用的常用方法之一是在功能丧失突变体中过表达全基因组高拷贝数质粒文库中的克隆,然后选择抑制突变表型的克隆。
本文描述了一种在 庞贝链球菌中进行这种基于“多拷贝抑制”的遗传筛选的方案。该筛选有助于鉴定与 S. pombe 中缺乏 Ell1 转录伸长因子相关的遗传毒性应激敏感表型的多拷贝抑制因子。筛选是通过将查询 ell1 零突变株与高拷贝数 S. pombe cDNA质粒文库的转化并在含有4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)的EMM2平板上选择抑制子(一种遗传毒性应激诱导化合物)来启动的。随后,从两个入围的抑制菌落中分离质粒,并通过限制性内切酶消化以释放插入片段DNA。释放插入片段DNA片段的质粒被重新转化为ell1缺失菌株,以确认这些抑制质粒克隆在4-NQO和其他遗传毒性化合物存在下恢复 ell1 缺失突变体生长的能力。 对那些显示缺失表型拯救的质粒进行测序,以鉴定负责抑制 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感表型的基因。
Introduction
遗传相互作用网络提供有关基因的功能信息,并描绘这些基因可能参与体内的途径和生物过程。此外,它们还可以提供不同基因如何相互作用的见解,从而产生特定的表型1,2,3。多年来,研究人员设计了各种基因筛选来回答基本的生物学问题和研究人类疾病。用于识别遗传相互作用的筛选可以通过多种方式进行。在不同遗传筛选中鉴定的遗传相互作用可以代表基因之间的不同机制关系。此外,研究表明,编码属于同一途径或复合物4,5的蛋白质的基因共享一组共同的遗传相互作用。因此,遗传相互作用网络可用于在细胞中建立功能组织,其中共享最相似谱的基因属于相同的复合物或途径,那些具有不太相似的谱的基因属于相同的生物过程,并且那些表现出重叠但更多样化的谱的基因反映了属于同一细胞区室的成员6。
基于剂量抑制的遗传相互作用筛选(“高拷贝或多拷贝抑制”)是常用的方法之一。这些筛选可以通过使用高拷贝数基因组或cDNA文库转化查询突变株来进行,然后使用合适的测定/选择技术来鉴定抑制或增强遗传相互作用7,8,9。为了确保全面的全基因组覆盖,这些筛选还通过在全基因组功能丧失突变体集合中过表达感兴趣的特定基因或在功能丧失查询突变体中过表达高拷贝数质粒编码的基因组或cDNA文库来进行。 9,10,11,12,13,14,15.多拷贝策略也可以使用显性/过表达方法使用可调控启动子。
使用基于抑制因子的筛选的主要优点是,通过另一个基因抑制突变菌株中预先存在的表型,在这两种基因产物之间建立了遗传关系,而使用其他方法可能无法证明。其次,已经观察到预先存在的突变的存在使特定途径敏感,允许通过分离抑制因子来识别该途径的其他成分,而抑制因子可能无法通过更直接的遗传选择来识别。此外,该屏幕可用于识别具有不同抑制机制的抑制因子16。抑制因子相互作用通常发生在功能相关的基因之间,可用于阐明通路中的层次结构。抑制的确切潜在机制可能因几个因素而异,包括筛选中使用的查询突变体类型、实验条件和基因表达水平。常见的剂量抑制机制之一涉及编码在同一复合物中或在同一细胞/生物过程中并行起作用的产物的基因。在酵母等更简单的模式生物中进行这种筛选的结果可以扩展到更高的真核生物,因为大多数基本的生物途径和过程在整个进化过程中都是保守的。
这些基因筛选也可以以多种方式进行修改,以回答不同的生物学问题。例如,可以鉴定来自不同生物体的直系同源基因,这些基因可以抑制查询突变菌株的表型。它还被用于描述潜在的耐药机制并确定新型抗菌 17,18、抗真菌19,20、抗寄生虫 21 和抗癌 22 化合物的蛋白质靶标。该筛选也被用于识别作用机制未知的药物活性抑制因子。因此,原则上,这些多拷贝抑制器筛可以优化并用于不同生物体的各种应用。尽管酵母研究人员采用的大多数遗传筛选最初是在酿酒酵母中开发的,但S. pombe已成为进行各种遗传筛选和测定的补充模型系统23。此外,庞贝链球菌的基因组组织和生物学过程,例如更多基因中内含子的出现,DNA复制起源的复杂性,着丝粒结构,细胞周期的组织以及RNAi机制的存在,显示出庞贝链球菌和高等真核生物之间的更大相似性23,24,强调了设计和使用庞贝链球菌遗传工具的重要性。
本文描述了一种基于S . pombe功能丧失突变表型的“剂量抑制”鉴定遗传相互作用器的协议。该协议的基础是,它是一种快速有效的方法,可以在多拷贝质粒和/或强启动子上筛选过表达野生型基因的cDNA文库。该协议有四个主要步骤:将文库转化为查询突变株,选择抑制查询突变株所需表型的质粒克隆,从这些抑制克隆中检索质粒,以及鉴定负责抑制表型的基因。与任何基于从文库中选择和鉴定cDNA的方法一样,筛选的成功取决于使用高质量和高复杂性的文库,因为筛选只能检索文库中存在的那些cDNA克隆。
使用该协议,我们成功地鉴定了查询S. pombe ell1 null突变体的遗传毒性应激敏感表型的两种新型抑制因子。ELL(十一十九赖氨酸丰富白血病)家族的转录伸长因子在体外生化测定中抑制RNA聚合酶II在DNA模板上的瞬时停顿,并且在从裂变酵母到人类的各种生物体中是保守的25。早期的工作提供了证据,证明S. pombe ell1零突变体在4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)和甲磺酸甲酯(MMS)存在下显示出遗传毒性应激敏感性26。因此,我们将庞贝链球菌质粒编码的多拷贝cDNA文库转换为查询庞贝链球菌ell1空突变体,并鉴定了两个推定克隆,它们表现出在4-NQO(一种诱导DNA损伤的化合物)存在下抑制庞贝链球菌ell1零突变体的遗传毒性应激敏感性的能力。 对质粒克隆中存在的插入片段进行后续测序,发现编码rax2+和osh6+的基因在ell1无效突变体中过表达时负责抑制ell1无效突变体的遗传毒性应激敏感性。
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Protocol
1. 将cDNA文库转化为查询庞 贝链球菌 突变株以筛选多拷贝抑制因子
注意:遵循标准醋酸锂方法27将S. pombe cDNA文库转换为查询S. pombe ell1Δ菌株,并进行一些修改:
- 在 YE 培养基(表 1)上以 32 °C 培养 S. pombe ell1Δ 菌株生长,该板补充有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶各 225 μg/mL。将来自上述平板的 ell1Δ 菌株接种在 15-20 mL 的 YE 培养基中,接种各补充有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶各 225 μg/mL 的 YE 培养基。在32°C振荡(200-250rpm)孵育过夜。
- 第二天,将过夜培养物稀释在100mL新鲜YE培养基中,并添加所需添加剂至OD 600nm(600nm处的光密度)为0.3,并在32°C下以200-250rpm振荡孵育,直到OD600nm达到中间对数期。
- 将 100 mL 培养物分成两个 50 mL 离心管,然后在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液并用1mL无菌水洗涤细胞沉淀,即将细胞重悬于1mL无菌水中,并在室温下以4,000× g 离心5分钟。
- 弃去上清液,并用1mL的1x LiAc-TE(100mM乙酸锂,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.5)溶液洗涤每个细胞沉淀,如步骤1.4中所述。
- 取出上清液并将每个细胞沉淀重悬于 250 μL 1x LiAc-TE 中。使用这些 庞贝链球菌 感受态细胞(500μL)与感兴趣的DNA进行转化。将 125 μL 感受态细胞转移到四个不同的无菌微量离心管中,用于后续转化步骤。
- 将鲑鱼睾丸或鲱鱼精子的载体DNA煮沸1分钟,然后立即放在冰上。对于每次转化,将 10 μL 10 mg/mL 变性单链载体 DNA 加入含有 125 μL 感受态细胞的微量离心管中,然后使用微量移液器吸头轻轻混合。随后,将50μg庞 贝链球菌 cDNA文库添加到含有感受态细胞 - 载体DNA混合物的微量离心管中。
- 将微量离心管在室温下孵育10分钟,然后加入260μL聚乙二醇-醋酸锂溶液(40%[w / v] PEG 4,000,100mM乙酸锂,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.5)并借助微量移液器吸头轻轻混合。
- 将含有转化混合物的微量离心管在32°C孵育2小时而不摇动。向微量离心管中加入 43 μL 预热的二甲基亚砜 (DMSO) 并轻轻混合。随后,将管暴露在42°C的热冲击下5分钟。
- 在室温下以4,000× g 沉淀细胞5分钟。弃去上清液,并在微量移液器吸头的帮助下除去残留的PEG-LiAc-TE溶液。
- 将细胞重悬于100μL无菌水中,并用所需的补充剂和0.2μg/ mL的4-NQO在一个EMM2(表1)板(150mm)上平板上。
- 将板在32°C孵育5-6天,以使菌落出现在板上。在 0.2 μg/mL 4-NQO 存在下,将获得的菌落划线在同一培养基板上,并用于进一步筛选。
- 对于一个文库转化实验,如上述步骤1.8至1.14所述,使用500 μL感受态细胞(125 μL感受态细胞x 4个微量离心管)进行转化。
- 作为对照,将转化混合物的1/10放在一个EMM2板(150mm)上,并添加所需的补充剂,但缺少4-NQO,以计算转化文库后获得的文库克隆总数,并筛选抑制器克隆的分离 。
2. 通过推定抑制因子测试和验证与查询突变菌株相关的表型的拯救/抑制
注意:应力点测定如下所述进行,以测试和验证推定抑制器对 ell1 缺失相关4-NQO应力敏感性的拯救/抑制。
- 在无菌 96 孔微量滴定板的每个不同孔中加入 100-200 μL 无菌水。
- 使用无菌牙签或 20-200 μL 微量移液器吸头,从含有 4-NQO 的平板上 cDNA 文库转化后获得的每个不同菌落中挑选少量接种物。将来自每个不同菌落的接种物添加到含有100-200μL无菌水的微量滴定板的单独独立孔中。充分混合。
- 将每个孔中的 3 μL 细胞悬液点到含有腺嘌呤 (225 μg/mL) 和尿嘧啶 (225 μg/mL) 但缺乏亮氨酸(用于构建本文所用文库的质粒载体上存在的选择性营养标志物)的 EMM2 琼脂平板上。根据需要向板中加入适当浓度的4-NQO。
- 将板在32°C孵育3-4天以使细胞生长。确定在不同浓度的4-NQO作为推定抑制因子存在下显示生长的菌落。
- 为了进一步验证抑制器,在含有腺嘌呤和尿嘧啶各225μg/ mL但缺乏亮氨酸的EMM2培养基中振荡(200-250rpm)在32°C下将选定的抑制子与适当的对照菌株一起生长过夜。
- 第二天,在新鲜的EMM2培养基中将细胞稀释至OD 600nm的0.3,并在32°C下振荡直至对数中期(约OD600nm为0.6-0.8)。
- 在含有 0.4 μM 4-NQO 或 0.01% MMS 的所需补充剂的 EMM2 平板上发现适当的连续稀释(1:10 或 1:5)培养物。为了控制,在EMM2平板上发现菌株,并添加所需的补充剂,但缺乏任何DNA损伤剂。
- 将板在32°C孵育3-5天以监测生长。
注意:应使用基于与查询突变菌株相关的表型的合适测定来测试表型的挽救或抑制。例如,如果需要鉴定查询突变菌株的冷敏表型的抑制子,则用于测试和验证抑制子克隆的测定将涉及在低温下生长转化体。 - 发现用全长目的基因(在本例中为 Spell1 )或空载体转化的突变菌株分别作为阳性和阴性对照,以及文库转化体。
3. 从 庞贝链球菌 抑制克隆中分离质粒
注意:从 S. pombe 中分离质粒是按照裂变酵母:实验室手册28 中描述的方案进行的,并进行了一些修改。
- 在含有225μg/ mL腺嘌呤和尿嘧啶的EMM 2培养基中接种单个酵母菌落,并在32°C下以200-250rpm振荡孵育细胞过夜。第二天,通过在室温下以4,000× g 离心2分钟收获5个外径细胞(即10mL外径0.5培养物)。
- 除去上清液并将细胞沉淀重悬于 0.2 mL 裂解缓冲液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM TrisHCl(pH 8.0) 和 1 mM Na 2 EDTA)中。
- 向微量离心管中加入0.2mL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和0.3g酸洗玻璃珠。在4°C下涡旋微量离心管2分钟,并在冰上孵育1分钟。重复此步骤 6 次。
- 在室温下以10,000× g 离心管15分钟。将上层水层转移到新鲜的微量离心管中,并加入 200 μL 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)。
- 将管以10,000× g 离心10分钟。将上层水层转移到新管中,并向管中加入两体积的100%乙醇(~400μL)和1/10体积的乙酸钠(3M,pH 5.8)(~20μL)。将微量离心管-70°C孵育1小时。
- 通过在4°C下以10,000× g 离心15分钟沉淀DNA,并除去上清液。用70%乙醇(~500μL)洗涤DNA沉淀,并保持室温风干。
- 将 DNA 重悬于 20 μL 无菌水中。使用 2-5 μL 质粒 DNA 转化感受态 大肠杆菌 细胞。
注意:质粒也可以使用任何市售的酵母质粒分离试剂盒从酵母细胞中分离出来。
4. 抑制克隆编码基因的鉴定
- 使用标准方案29 将分离的酵母质粒转化为大肠杆菌 Top10 菌株 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG],并使用所需的抗生素将细胞散布在 LB(Luria 肉汤)平板上。
- 使用标准碱裂解方案29从大肠杆菌转化体中分离质粒,并遵循限制性内切酶的适当组合以检查通过限制性酶切释放插入的DNA片段。
注意:抑制质粒84用 BamHI限制性内切酶解,抑制质粒104用 PstI / BamHI限制性内切酶解。 - 在 ell1Δ 菌株中限制性酶切后显示插入片段释放的质粒重新转化,以检查它们拯救 ell1Δ 菌株的遗传毒性应激敏感表型的能力。
- 选择显示抑制遗传毒性应激敏感性的质粒克隆,并使用载体特异性正向和反向引物对这些质粒克隆中存在的插入片段DNA片段进行测序。
注意:在本研究中,使用了 adh1 启动子特异性通用正向引物(5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30。 - 为了鉴定负责抑制的基因,请对齐使用NCBI核苷酸原始细胞(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch)或Pombase序列比对工具(https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core)获得的序列。选择显示最大比对的序列,并将其鉴定为多拷贝抑制质粒的基因。
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Representative Results
筛选 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感性 的多拷贝抑制因子
我们使用上述协议进行了遗传筛选,以鉴定查询ell1缺失突变株的功能丧失表型的多拷贝抑制因子。在4-NQO基因毒性剂存在下观察到的ell1缺失菌株的生长相关敏感性被采用为功能丧失表型来选择多拷贝抑制因子。图1显示了遗传筛选的示意图。为了开始筛选,ell1缺失突变体(h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ:: kanMX6)的遗传毒性应激敏感性首先在4-NQO存在下确认其同基因野生型菌株(h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1)(图2A)。随后,用高拷贝数的庞贝链球菌cDNA文库转换查询S. pombe ell1空突变体,以选择那些可以抑制/挽救ell1空突变体的4-NQO生长相关敏感性的质粒克隆。该文库包含 ~6 × 105 个庞贝链球菌 cDNA 片段,在 adh1 启动子30 的控制下克隆在 pLEV3 庞贝链球菌过表达载体中。作为对照,将1/10的转化混合物接种在缺乏4-NQO的EMM2板上,以计算文库转化后获得的重组克隆总数,指示文库的覆盖范围,并筛选抑制克隆的分离。这一点至关重要,因为筛选较少的克隆将降低识别抑制器克隆的可能性。
图2B 显示了对照板和含4-NQO板的代表性图像。如图所示,在缺乏4-NQO的对照板上获得了大量菌落,显示出对文库的良好覆盖。正如预期的那样,在4-NQO平板上获得的转化体较少,因为这些转化体可能代表 ell1 零突变体的4-NQO敏感性的推定抑制因子。接下来,在含有0.2μM 4-NQO的EMM2板上获得的不同转化体菌落在含有0.2μM 4-NQO的EMM2板上进一步划线或点斑,以确认这些转化体在4-NQO存在下生长的能力。观察到620个转化菌落能够在0.2μM 4-NQO的EMM2板上生长。
验证推定抑制子克隆在遗传毒性胁迫条件下恢复ell1缺失突变体生长的能力
为了确认推定的抑制因子,重要的是在更严格的条件下测试所需表型的救援,如示意图所示(图3A)。因此,将620个入围的转化体点样在具有0.4μM 4-NQO的EMM2板上。如图 3B所示,只有74个转化体在0.4μM 4-NQO下显示出生长。随后,在含有0.8μM 4-NQO的EMM2平板上点缀了这74个转化体,并且观察到只有16个在0.8μM 4-NQO存在下显示出生长(图3C)。为了进一步证实这些观察结果,在EMM2平板上发现了这16个转化体,并添加了所需的补充剂,含有0.8μM 4-NQO或无4-NQO(对照),以及用空载体转化的 ell1 缺失突变体。这些点样测定的结果表明,正如预期的那样,用空载体转化的 ell1 缺失菌株以及所有16个转化体在缺乏4-NQO的平板上显示出生长。相比之下,虽然仅包含空载体的 ell1 缺失突变体在0.8μM 4-NQO处没有生长,但六个转化体在0.8μM 4-NQO处表现出生长(图3D),这表明其中存在的文库克隆具有抑制 ell1 无效突变体的遗传毒性应激表型的能力。
抑制子克隆编码基因的鉴定
接下来,我们选择了ell1缺失菌株的02个遗传抑制因子,sup 84和sup 104,在4-NQO存在下完全抑制ell1相关的生长敏感性。从这两种酵母抑制剂中分离文库质粒克隆并转化为感受态大肠杆菌细胞。随后,使用标准方案31从大肠杆菌细胞中分离质粒。将标记为84和104的两个分离质粒进行限制性酶切,结果分别显示存在约1,000 bp和800 bp插入DNA片段(图4A,B)。为了进一步验证该抑制因子筛选的结果,将这些质粒重新转化为ell1缺失突变体,并检查它们是否可以在4-NQO存在下恢复ell1空突变体的生长。应激斑测定显示,当重新引入ell1 null突变体时,抑制质粒克隆导致4-NQO相关生长敏感性的抑制,这表明抑制是质粒依赖性的(图4C)。此外,我们决定确定在另一种DNA损伤诱导化合物MMS存在的情况下,这些抑制克隆是否也可以抑制ell1缺失菌株的生长相关敏感性。斑点测定表明,抑制质粒克隆转化为ell1空突变体比具有空载体的ell1缺失突变体的转化在含MMS的培养基上导致更多的生长,表明这些质粒克隆可以在两种遗传毒性试剂存在下抑制ell1缺失突变体的遗传毒性应激敏感性, 即4-NQO和MMS(图4D)。
接下来,为了鉴定这些抑制质粒克隆中存在的基因,使用adh1启动子特异性通用正向引物30对插入片段DNA片段进行测序。使用PomBase网站(https://www.pombase.org)上的“Blastat Ensembl”工具搜索获得的核苷酸序列,结果显示两个质粒克隆84和104分别含有rax2+和osh6+基因,提供了Rax2和Osh6负责抑制与绒毛链球菌中ell1+缺失相关的遗传毒性应激敏感表型的证据.关于这两种蛋白质在S. pombe中的功能的知识是有限的。Rax2已被证明可以调节For3p的定位,以控制S. pombe32营养生长过程中的细胞极性。Osh6是一种脂质转运蛋白,属于氧甾醇结合蛋白相关蛋白家族。它参与磷脂酰丝氨酸从内质网到质膜的运输33。
图1:遗传多拷贝抑制器屏幕的示意图。 该协议有四个主要步骤:将文库转化为查询突变株,选择抑制查询突变株所需表型的质粒克隆,从这些抑制克隆中检索质粒,以及鉴定负责抑制表型的基因。缩写:4-NQO = 4-硝基喹啉 1-氧化物。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:筛选 S. pombe 中 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感性的多拷贝抑制因子。 (A) 胁迫点测定显示 ell1 缺失的 S. pombe 菌株与其同基因野生型菌株相比具有 4-NQO 敏感性。在含有腺嘌呤、亮氨酸和尿嘧啶各225 μg/mL(含或不带(对照)0.4 μM 4-NQO的EMM2培养基上标显适当菌株的连续稀释(1:10)。然后将板在32°C下孵育3-5天。 (B)在ell1缺失的S. pombe菌株中转化高拷贝数cDNA文库,并将转化的菌落接种在缺乏亮氨酸但含有0.2μM 4-NQO的EMM2培养基上。将转化混合物的一小部分等分试样也铺在缺乏4-NQO的EMM2板上,作为对照。将板在32°C孵育5-6天并拍照。图B显示了这些板的代表性图像。缩写:4-NQO = 4-硝基喹啉 1-氧化物。请点击此处查看此图的大图。
图 3:验证推定抑制子克隆抑制 ell1 缺失突变体的遗传毒性应激敏感性的能力。 (A)通过测试所需表型抑制来筛选文库转化体的示意图。通过在缺乏亮氨酸且含有 (B) 0.4 μM 4-NQO 或 (C) 0.8 μM 4-NQO 的 EMM2 平板上发现不同的转化体,在增加浓度的 4-NQO 上测试了 620 个转化体的生长。将板在32°C孵育5-6天并拍照。已经显示了板的代表性图像。(D)在缺乏亮氨酸但含有0.8μM 4-NQO(对照)的EMM2平板上发现16个在0.8μM 4-NQO上显示生长的转化体,以及用空载体转化的 ell1 缺失菌株。将板在32°C孵育5-6天并拍照。只有六个菌落表现出拯救 ell1 缺失相关遗传毒性应激敏感性的能力。缩写:4-NQO = 4-硝基喹啉 1-氧化物。 请点击此处查看此图的大图。
图4:抑制质粒克隆的鉴定。 (A)限制性酶切抑制质粒84与 BamHI限制性内切酶的琼脂糖凝胶图像释放了~1 kb的插入片段。(B)用 PstI/BamHI限制性内切酶消化的抑制质粒104释放~800 bp的插入片段。 (C)1:10连续稀释的用质粒sup 84或sup 104转化的 ell1 空突变体在缺乏亮氨酸且含有0.4μM 4-NQO或(D)0.01%MMS的EMM2平板上点样。在对照板中,没有添加DNA损伤剂。将板在32°C下孵育4-5天并拍照。 请点击此处查看此图的大图。
表1:促进S. pombe生长的培养基组成。请按此下载此表格。
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Discussion
酵母已被广泛用于研究在真核生物中进化上保守的基本生物过程和途径。遗传和基因组工具的可用性以及它们对各种生化,遗传和分子程序的适应性使酵母成为遗传研究的优秀模式生物34,35,36。多年来,酵母研究人员已经设计了各种遗传筛选来识别遗传相互作用,这些相互作用将揭示单个基因的功能,以及它们可能参与的途径和生物过程10,11,17,37。识别遗传相互作用的常见且有用的筛选之一被称为“多拷贝或高拷贝数抑制”。
该筛选需要表现出功能丧失表型的查询突变株,然后使用高拷贝数基因组或cDNA文库转换该突变查询菌株。随后,筛选获得的转化体以鉴定这些基因,这些基因在过表达时抑制与查询突变菌株相关的表型。特定突变菌株与质粒文库克隆中存在的基因之间的这种类型的遗传相互作用导致可能在同一途径中起作用或影响相同生物过程的基因产物的分离和鉴定4。因此,该筛选提供了对目标基因的功能及其在体内途径和生物过程中的功能组织的见解。传统上,这种屏幕已广泛用于酿酒酵母38,39,40,41,42。
本工作的目标是描述一种简单明了的方案,用于在S. pombe中进行多拷贝抑制遗传筛选。我们使用携带ell1转录延伸因子缺失的S. pombe菌株进行了筛选。ELL是转录延伸因子家族,存在于从裂变酵母到人类的各种生物体中。Ell1的功能才刚刚开始在S. pombe中被理解。早期的工作强调了Ell1在正常生长条件下的最佳生长和在遗传毒性应激条件下存活中的作用26。我们采用多拷贝抑制因子筛选作为揭示Ell1在S. pombe26遗传毒性应激敏感性中的作用的分子机制的方法之一。将多拷贝质粒编码的庞贝链球菌cDNA文库转化为对4-NQO敏感的庞贝链球菌ell1空突变体。随后,选择那些在4-NQO存在下可以生长的转化体。
从这些转化体中分离质粒并对存在于这些质粒中的插入片段进行测序,从而鉴定出庞贝链球菌中ell1+的两种新型遗传相互作用器,rax2+和osh6+。 之前在S. pombe中使用类似遗传筛选的研究也确定了抗沉默蛋白epe1+作为ell1缺失相关表型43的多拷贝抑制因子。我们还使用这种方法鉴定了S. pombe RNA聚合酶II的非必需Rpb9亚基的多拷贝抑制子(未发表的观察结果)。总的来说,这些结果验证了遗传多拷贝抑制因子筛选方法作为鉴定与所需目的基因表现出遗传相互作用的推定基因/蛋白质的方法的效用,阐明了目的基因可能参与的功能、途径和过程。
要使用这项工作中描述的筛选,重要的是首先有一个查询突变菌株,该菌株表现出与突变相关的清晰表型,可用于分离多拷贝抑制子。此外,该筛选的成功将取决于高质量和良好的代表性文库的可用性,其中包含代表最大数量的野生型基因或其相应cDNA的克隆。传统上,基因组和cDNA文库都用于这些筛选,但cDNA文库的优点是由细胞/生物体中表达的mRNA制成的。此外,其转化为酵母细胞的高效率对于筛选的成功至关重要,因为筛选大量转化体很重要,从而增加了识别抑制子的概率。如果使用醋酸锂方案将文库转化为查询突变菌株后,对照板上获得的转化体较少,则可以使用电穿孔来转化文库。
还建议在转化文库之前先使用另一个质粒标准化转化方案。否则,它将不必要地导致库丢失。此处描述的方案使用 4-NQO 敏感性作为突变表型,但应设计合适的筛选方法/测定,以便根据感兴趣的特定突变表型选择抑制因子。如果在将文库转化为查询突变菌株后,在平板上没有或很少获得转化体来选择抑制子,那么如果可能的话,在接种文库时应使用不太严格的条件/测定来选择抑制子,以便在高严格条件下确认之前检测尽可能多的遗传抑制因子。除了使用限制性酶切来检测鉴定的抑制质粒克隆中是否存在插入片段外,还可以使用载体特异性引物进行PCR扩增所需的插入片段DNA片段。或者,可以直接给予抑制质粒克隆进行测序,无需限制性酶切或PCR。
如果关于适当的突变菌株、质粒和启动子构建体的遗传工具包可用,可以促进基因的过表达,从而可以挽救宿主酵母细胞中存在的突变表型,则该筛选也可以用于酿酒酵母和庞贝链球菌以外的酵母。此外,随着全基因组资源的可用性,包括全基因组缺失突变体44和过表达文库37的集合,该筛选也可以通过将一个或几个查询质粒转化为酵母突变菌株收集的系统阵列或通过将系统阵列的过表达质粒集合转化为一个或几个突变查询菌株45来进行。.总之,这种方法可以清楚地推广到不同生物体的各种实验问题。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由印度政府生物技术部的研究资助(资助号。BT/PR12568/BRB/10/1369/2015)致尼米莎·夏尔马。作者感谢Charles Hoffman教授(美国波士顿学院)捐赠的S . pombe cDNA文库和Susan Forsburg教授的酵母质粒。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-NQO | Sigma | N8141 | |
Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
Agar | Himedia | GRM026 | |
Agarose | Lonza | 50004L | |
Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
BamHI | Fermentas | ER0051 | |
Biotin | Himedia | RM095 | |
Boric Acid | Himedia | MB007 | |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
Glucose | Amresco | 188 | |
Ionositol | Himedia | GRM102 | |
Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
Leucine | Himedia | GRM054 | |
Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
Phenol | Himedia | MB082 | |
Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
RNAse | Fermentas | EN0531 | |
SDS | Himedia | GRM205 | |
Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
Tris free Base | Himedia | MB209 | |
Uracil | Himedia | GRM264 | |
Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
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