Summary
この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1 null変異体の新規遺伝子抑制因子をこのスクリーンを用いて同定した。
Abstract
遺伝的相互作用の同定は、他の遺伝子との機能的関係や生物学的経路やプロセスへの組織化に関する洞察を提供することにより、遺伝子の機能を解読するための強力なツールです。遺伝子スクリーニングの大部分は当初、 Saccharomyces cerevisiaeで開発されましたが、これらの遺伝子スクリーニングを実施するための補完的なプラットフォームは、 Schizosaccharomyces pombeによって提供されています。遺伝的相互作用を同定するために使用される一般的なアプローチの1つは、機能喪失変異体におけるゲノムワイドな高コピー数プラスミドライブラリからのクローンの過剰発現と、それに続く変異表現型を抑制するクローンの選択です。
この論文では、 S. pombeでこの「マルチコピー抑制」ベースの遺伝子スクリーニングを実施するためのプロトコルについて説明します。このスクリーニングは、 S. pombe におけるEll1転写伸長因子の欠如に関連する遺伝毒性ストレス感受性表現型のマルチコピー抑制因子を特定するのに役立ちました。スクリーニングは、クエリ ell1 ヌル変異株を高コピー数の S.ポンベ cDNAプラスミドライブラリで形質転換し、遺伝毒性ストレス誘導化合物である4-ニトロキノリン1-オキシド(4-NQO)を含むEMM2プレート上のサプレッサーを選択することによって開始されました。続いて、プラスミドを2つの候補リストに載せたサプレッサーコロニーから単離し、制限酵素によって消化してインサートDNAを放出した。インサートDNA断片を 放出 するプラスミドをell1欠失株に再形質転換し、これらのサプレッサープラスミドクローンが4-NQOおよび他の遺伝毒性化合物の存在下で ell1 欠失変異体の増殖を回復する能力を確認した。欠失表現型のレスキューを示すこれらのプラスミドを配列決定して、 ell1 欠失関連遺伝毒性ストレス感受性表現型の抑制に関与する遺伝子を同定した。
Introduction
遺伝的相互作用のネットワークは、遺伝子に関する機能情報を提供し、これらの遺伝子がin vivoで関与する可能性のある経路と生物学的プロセスを描写します。さらに、それらはまた、異なる遺伝子が互いにどのように相互作用し、特定の表現型をもたらすかについての洞察を提供するかもしれない1,2,3。長年にわたり、基本的な生物学的質問に答え、人間の病気を研究するために、さまざまな遺伝子スクリーニングが研究者によって設計されてきました。遺伝的相互作用の同定のためのスクリーニングは、複数の方法で実施することができる。異なる遺伝子スクリーニングで同定された遺伝的相互作用は、遺伝子間の異なる機構的関係を表すことができる。さらに、研究により、遺伝的相互作用の共通のセットが、同じ経路または複合体に属するタンパク質をコードする遺伝子によって共有されることが明らかになりました4,5。したがって、遺伝的相互作用ネットワークは、細胞内の機能的組織を確立するために使用することができ、ここで、最も類似したプロファイルを共有する遺伝子は同じ複合体または経路に属し、幾分類似していないプロファイルを共有するそれらの遺伝子は同じ生物学的プロセスに属し、重複するがより多様なプロファイルを示すそれらの遺伝子は同じ細胞区画6に属するメンバーを反映する。
投与量抑制(「高コピーまたはマルチコピー抑制」)に基づく遺伝的相互作用スクリーニングは、一般的に使用されるアプローチの1つです。これらのスクリーニングは、クエリ変異株を高コピー数のゲノムまたはcDNAライブラリで形質転換し、続いて遺伝的相互作用を抑制または増強することを同定するための適切なアッセイ/選択技術によって実行することができる7、8、9。ゲノムワイドな包括的なカバレッジを確保するために、これらのスクリーニングは、ゲノムワイドな機能喪失変異体のコレクションにおいて目的の特定の遺伝子を過剰発現させることによって、または機能喪失クエリ変異体9、10、11、12、13、14、15において、高コピー数のプラスミドコードゲノムまたはcDNAライブラリを過剰発現することによっても実施されている。.マルチコピー戦略は、調節可能なプロモーターを用いたドミナント/過剰発現アプローチを使用しても機能する可能性がある。
サプレッサーベースのスクリーニングを使用する主な利点は、別の遺伝子による変異株における既存の表現型の抑制が、他のアプローチでは実証されなかった可能性のあるこれら2つの遺伝子産物間の遺伝的関係を確立することである。第二に、既存の突然変異の存在が特定の経路を感作し、より直接的な遺伝的選択によって同定されなかった可能性のあるサプレッサーの単離によってその経路の追加成分を同定することを可能にすることが観察されている。さらに、この画面は、抑制16の異なるメカニズムを有するサプレッサを識別するために使用することができる。サプレッサー相互作用は通常、機能的に関連する遺伝子間で発生し、経路の階層を解明するために使用できます。抑制の正確な根底にあるメカニズムは、スクリーニングで使用されるクエリ変異体の種類、実験条件、および遺伝子発現のレベルを含むいくつかの要因に基づいて異なり得る。一般的な投与量抑制メカニズムの1つは、同じ複合体内で、または同じ細胞/生物学的プロセス内で並行して機能する製品をコードする遺伝子を含む。酵母などのより単純なモデル生物におけるこのようなスクリーニングの結果は、ほとんどの基本的な生物学的経路とプロセスが進化全体にわたって保存されるため、高等真核生物に拡張することができます。
これらの遺伝子スクリーニングは、さまざまな生物学的質問に答えるためにいくつかの方法で変更することもできます。例えば、クエリ変異株の表現型を抑制することができる異なる生物由来のオーソログ遺伝子を同定することができる。また、潜在的な耐性メカニズムを描写し、新規抗菌17,18、抗真菌19,20、抗寄生虫21、および抗癌22化合物のタンパク質標的を決定するためにも使用されています。このスクリーニングは、作用機序が不明な医薬品の活性の抑制因子を特定するためにも利用されています。したがって、原則として、これらのマルチコピーサプレッサースクリーンは、最適化され、異なる生物の様々な用途で使用することができる。酵母研究者が採用する遺伝子スクリーニングのほとんどは、最初はS. cerevisiaeで開発されましたが、S. pombeは、さまざまな遺伝子スクリーニングおよびアッセイを実施するための補完的なモデルシステムとして浮上しています23。さらに、より多くの遺伝子におけるイントロンの発生、DNA複製の起源の複雑さ、セントロメア構造、細胞周期の組織化、RNAi機構の存在など、S. pombeのゲノム組織化と生物学的プロセスは、S. pombeと高等真核生物との間により大きな類似性を示しており23,24、S. pombeの遺伝的ツールの設計と使用の重要性を強調しています。
この論文では、 S. pombeの機能喪失変異表現型の「投与量抑制」に基づいて遺伝的相互作用者を特定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルの基礎は、マルチコピープラスミド上および/または強力なプロモーターのいずれかで野生型遺伝子を過剰発現するcDNAライブラリをスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法であるということです。このプロトコルには、ライブラリのクエリ変異株への形質転換、クエリ変異株の望ましい表現型を抑制するプラスミドクローンの選択、これらのサプレッサークローンからのプラスミドの取得、および表現型の抑制に関与する遺伝子の同定の4つの主要なステップがあります。ライブラリからのcDNAの選択と同定に基づくあらゆる方法に当てはまるように、スクリーンはライブラリに存在するcDNAクローンのみを取得できるため、スクリーンの成功は高品質で複雑なライブラリの使用に依存します。
このプロトコルを使用して、クエリS. pombe ell1 null変異体の遺伝毒性ストレス感受性表現型の2つの新規サプレッサーを特定することに成功しました。転写伸長因子のELL(Eleven Nineteen Lysine Rich Whiteemia)ファミリーは、in vitro生化学的アッセイにおけるDNAテンプレート上のRNAポリメラーゼIIの一時的な休止を抑制し、分裂酵母からヒトまで、さまざまな生物にわたって保存されています25。以前の研究では、S. pombe ell1ヌル変異体が4-ニトロキノリン1-オキシド(4-NQO)およびメタンスルホン酸メチル(MMS)の存在下で遺伝毒性ストレス感受性を示すという証拠が提供されています26。そこで、S. pombe プラスミドにコードされたマルチコピーcDNAライブラリをクエリ S. pombe ell1 null 変異体に形質転換し、DNA病変を誘発する化合物である 4-NQO の存在下で S. pombe ell1 null 変異体の遺伝毒性ストレス感受性を抑制する能力を示す2つの推定クローンを同定しました。プラスミドクローンに存在するインサートのその後の配列決定により、rax2+およびosh6+をコードする遺伝子が、ell1 null変異体で過剰発現した場合のell1 null変異体の遺伝毒性ストレス感受性の抑制に関与していることが特定されました。
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Protocol
1. cDNAライブラリのクエリ S.ポンベ 変異株への変換によるマルチコピーサプレッサーのスクリーニング
注:標準酢酸リチウム法27に従って、S.ポンベcDNAライブラリをクエリS.ポンベell1Δ株にいくつかの変更を加えて変換しました。
- S. pombe ell1Δ株を、アデニン、ロイシン、ウラシルをそれぞれ225 μg/mL添加したYE培地(表1)プレート上で32°Cで増殖させます。上記のプレートからのell1Δ株の接種材料でいっぱいのループを、アデニン、ロイシン、およびウラシルをそれぞれ225 μg / mLを添加した15〜20 mLのYE培地に接種します。振とう(200-250rpm)しながら32°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、100 mLの新鮮なYE培地で一晩培養液を目的のサプリメントでOD 600 nm(600 nmでの光学密度)が0.3になるように希釈し、OD600 nm が中期対数期に達するまで200〜250 rpmで振とうしながら32°Cでインキュベートします。
- 100 mLの培養液を2本の50 mL遠沈管に分割し、室温で4,000 × gで10分間遠心分離します。
- 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの滅菌水で洗浄する、すなわち細胞を1 mLの滅菌水に再懸濁し、室温で5分間4,000 × g で遠心分離する。
- 上清を廃棄し、ステップ1.4に記載されているように、1 mLの1x LiAc-TE(100 mM酢酸リチウム、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5)溶液で各細胞ペレットを洗浄します。
- 上清を除去し、各細胞ペレットを250 μLの1x LiAc-TEに再懸濁します。これらの S.ポンベ コンピテントセル(500 μL)を使用して、目的のDNAで形質転換します。125 μLのコンピテントセルを4つの異なる滅菌マイクロ遠心チューブに移し、後続の形質転換ステップを行います。
- サーモン精巣またはニシン精子からのキャリアDNAを1分間煮沸し、すぐに氷の上に置きます。形質転換ごとに、125 μLのコンピテントセルを含むマイクロ遠心チューブに10 μLの10 mg/mL変性一本鎖キャリアDNAを加え、マイクロピペットチップを使用して穏やかに混合します。続いて、50 μgの S. pombe cDNAライブラリをコンピテントセルキャリアDNA混合物含有微量遠心チューブに加えます。
- マイクロ遠心チューブを室温で10分間インキュベートし、260 μLのポリエチレングリコール-酢酸リチウム溶液(40%[w/v] PEG 4,000、100 mM酢酸リチウム、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5)をチューブに加え、マイクロピペットチップを使用して穏やかに混合します。
- 形質転換混合物を含む微量遠心チューブを振とうせずに32°Cで2時間インキュベートします。43 μLの予熱ジメチルスルホキシド(DMSO)をマイクロ遠心チューブに加え、穏やかに混合します。続いて、チューブを42°Cで5分間ヒートショックにさらします。
- 細胞を4,000 × g で室温で5分間ペレット化します。上清を廃棄し、マイクロピペットチップを使用して残留PEG-LiAc-TE溶液を除去します。
- 細胞を100 μLの滅菌水に再懸濁し、必要なサプリメントと0.2 μg/mLの4-NQOを含む1枚のEMM2(表1)プレート(150 mm)にプレートします。
- プレートを32°Cで5〜6日間インキュベートして、コロニーがプレート上に現れるようにします。得られたコロニーを0.2 μg/mLの4-NQOの存在下で同じ培地プレート上にストリークし、さらなるスクリーニングに使用します。
- 1回のライブラリー形質転換実験では、上記のステップ1.8から1.14で説明されている形質転換に、500 μLのコンピテントセル(125 μLのコンピテントセルx 4本のマイクロ遠心チューブ)を使用します。
- 対照として、1/10番目の 形質転換混合物を必要なサプリメントを有するが4-NQOを欠く1枚のEMM2プレート(150mm)上に、ライブラリーの形質転換後に得られたライブラリークローンの総数を計算し、サプレッサークローンの単離をスクリーニングした。
2.推定サプレッサーによるクエリ変異株に関連する表現型のレスキュー/抑制をテストおよび検証します
注:ストレススポットアッセイは、推定サプレッサーによる ell1 欠失関連4-NQOストレス感受性のレスキュー/抑制をテストおよび検証するために、以下のように実施されました。
- 滅菌96ウェルマイクロタイタープレートの異なるウェルのそれぞれに100〜200μLの滅菌水を追加します。
- 滅菌爪楊枝または20-200 μLのマイクロピペットチップを使用して、4-NQOを含むプレート上のcDNAライブラリ変換後に得られた異なるコロニーのそれぞれから少量の接種材料をピックします。異なるコロニーのそれぞれからの接種材料を、100〜200μLの滅菌水を含むマイクロタイタープレートの別々の独立したウェルに追加します。よく混ぜます。
- 各ウェルからの細胞懸濁液3 μLを、アデニン(225 μg/mL)とウラシル(225 μg/mL)を含むEMM2寒天プレートにスポットしますが、ロイシン(この研究で使用したライブラリの構築に使用したプラスミドベクターに存在する選択可能な栄養要求性マーカー)がありません。必要に応じて、適切な濃度の4-NQOをプレートに追加します。
- プレートを32°Cで3〜4日間インキュベートして、細胞を増殖させます。推定サプレッサーとして、異なる濃度の4-NQOの存在下で増殖を示すコロニーを特定します。
- サプレッサーをさらに検証するには、選択したサプレッサーを適切なコントロール株とともに、アデニンとウラシルのそれぞれ225 μg / mLを含むがロイシンを含まないEMM2培地で振とう(200〜250 rpm)しながら32°Cで一晩増殖させます。
- 翌日、新鮮なEMM2培地で細胞をOD 600 nmに希釈し、中期対数期(約OD600 nmの0.6-0.8)まで振とうしながら32°Cで増殖させます。
- EMM2プレート上で培養物の適切な段階希釈(1:10または1:5)を、0.4 μM 4-NQOまたは0.01% MMSを含む必要なサプリメントで見つけます。対照のために、必要なサプリメントを含むEMM2プレート上の菌株を見つけますが、DNA損傷剤はありません。
- プレートを32°Cで3〜5日間インキュベートして、成長を監視します。
注:クエリ変異株に関連する表現型に基づく適切なアッセイを使用して、表現型のレスキューまたは抑制をテストする必要があります。例えば、クエリ変異株の低温感受性表現型のサプレッサーを同定する必要がある場合、サプレッサークローンの試験および検証のためのアッセイは、低温で形質転換体を増殖させることを含むであろう。 - 目的の完全長遺伝子(この場合はSpell1 )または空のベクターで形質転換された変異株を、ライブラリー形質転換体とともに、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして見つけます。
3. S.ポンベ サプレッサークローンからのプラスミドの単離
注: S. pombe からのプラスミド単離は、分裂酵母:いくつかの変更を加えた実験マニュアル28 に記載されているプロトコルに従って実施しました。
- 225 μg/mLのアデニンとウラシルを含むEMM2培地に単一の酵母コロニーを接種し、200〜250 rpmで振とうしながら32°Cで一晩細胞を増殖させます。翌日、室温で4,000 × g で2分間遠心分離することにより、5 O.D.細胞(すなわち、O.D.0.5の10 mL培養物)を回収します。
- 上清を除去し、細胞ペレットを0.2 mLの溶解バッファー(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris HCl(pH 8.0)、および1 mM Na2EDTA)に再懸濁します。
- 0.2 mLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)と0.3 gの酸洗浄ガラスビーズをマイクロ遠心チューブに加えます。マイクロ遠心チューブを4°Cで2分間ボルテックスし、氷上で1分間インキュベートします。この手順を6回繰り返します。
- チューブを10,000 × g で室温で15分間遠心分離します。上部の水層を新しい微量遠心チューブに移し、200 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。
- チューブを10,000 × g で10分間遠心分離します。上部水層を新しいチューブに移し、2倍量の100%エタノール(~400 μL)と1/10容量の酢酸ナトリウム(3 M、pH 5.8)(~20 μL)をチューブに加えます。微量遠心チューブを-70°Cで1時間インキュベートします。
- 10,000 × g で4°Cで15分間遠心分離してDNAを沈殿させ、上清を除去します。DNAペレットを70%エタノール(~500 μL)で洗浄し、室温で風乾します。
- DNAを20 μLの滅菌水に再懸濁します。2〜5 μLのプラスミドDNAを使用して、有能な 大腸菌 細胞を形質転換します。
注:プラスミドは、市販の酵母プラスミド単離キットのいずれかを使用して酵母細胞から単離することもできます。
4. サプレッサークローンがコードする遺伝子の同定
- 単離した酵母プラスミドを、標準プロトコル29を用いて大腸菌Top10株[F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG]に形質転換し、必要な抗生物質を含むLB(ルリアブロス)プレート上に細胞を広げます。
- 標準的なアルカリ溶解プロトコル29を使用して大腸菌形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素の適切な組み合わせに従って、制限酵素によるインサートDNA断片の放出を確認します。
注:サプレッサープラスミド84は BamHI制限酵素で消化され、サプレッサープラスミド104は PstI / BamHI制限酵素で消化されました。 - ell1Δ株の制限消化後にインサート放出を示すプラスミドを再形質転換して、ell1Δ株の遺伝毒性ストレス感受性表現型を救済する能力を確認します。
- 遺伝毒性ストレス感受性の抑制を示すプラスミドクローンを選択し、ベクター特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてこれらのプラスミドクローンに存在するインサートDNA断片を配列決定する。
注:本研究では、 adh1 プロモーター特異的ユニバーサルフォワードプライマー(5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30を用いた。 - 抑制の原因となる遺伝子を特定するには、NCBIヌクレオチドブラスト(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch)またはポン塩基配列アラインメントツール(https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core)を使用して得られた配列をアラインメントします。最大アライメントを示す配列を選択し、マルチコピーサプレッサープラスミドの遺伝子として同定します。
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Representative Results
S. pombeにおけるell1欠失関連遺伝毒性ストレス感受性のマルチコピー抑制因子のスクリーニング
上記のプロトコルを用いて遺伝子スクリーニングを行い、クエリell1欠失変異株の機能喪失表現型のマルチコピー抑制因子を同定した。4-NQO遺伝毒性物質の存在下で観察されたell1欠失株の成長関連感受性は、マルチコピーサプレッサーを選択する機能喪失表現型として採用されました。図1は、遺伝子スクリーニングの概略図を示す。スクリーニングを開始するために、ell1欠失変異株(h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ :: kanMX6)の遺伝毒性ストレス感受性を、4-NQOの存在下でその同質遺伝子野生株(h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1)に関して最初に確認した(図2A)。続いて、クエリS. pombe ell1ヌル変異体を高コピー数S. pombe cDNAライブラリで形質転換し、ell1ヌル変異体の4-NQO増殖関連感受性を抑制/レスキューできるプラスミドクローンを選択しました。このライブラリは×、adh1プロモーター30の制御下でpLEV3 S.ポンベ過剰発現ベクターにクローニングされた~6~105S.ポンベcDNA断片を含む。対照として、形質転換混合物の1/10を4-NQOを欠くEMM2プレートにも播種し、ライブラリーの形質転換後に得られた組換えクローンの総数、ライブラリーのカバレッジの指標を計算し、サプレッサークローンの単離についてスクリーニングした。スクリーニングするクローンの数が少ないほど、サプレッサークローンを同定する可能性が低くなるため、これは非常に重要です。
図2B は、コントロールおよび4-NQO含有プレートの代表像を示す。図に示すように、4-NQOを欠くコントロールプレート上に多数のコロニーが得られ、ライブラリーの良好なカバレッジを示す。予想通り、これらの形質転換体は ell1 ヌル変異体の4-NQO感受性の推定サプレッサーを表す可能性が高いため、4-NQOプレート上で得られた形質転換体は少なかった。次に、0.2 μM 4-NQOを含むEMM2プレートで得られたさまざまな形質転換体コロニーをさらにストリークまたはスポットして、0.2 μM 4-NQOを含むEMM2プレートでさらにストリークまたはスポットし、これらの形質転換体が4-NQOの存在下で増殖する能力を確認しました。620個の形質転換コロニーが0.2 μM 4-NQO含有EMM2プレート上で増殖できることが観察されました。
遺伝毒性ストレス条件下でell1欠失変異体の増殖を回復する推定サプレッサークローンの能力の検証
推定サプレッサーを確認するためには、概略図(図3A)に示すように、より高いストリンジェンシー条件下で所望の表現型のレスキューを試験することが重要である。したがって、620個の最終候補形質転換体は、0.4 μM 4-NQOのEMM2プレート上にスポットされました。 図3Bに見られるように、74個の形質転換体のみが0.4 μM 4-NQOで増殖を示した。続いて、これらの74個の形質転換体を0.8 μM 4-NQOを含むEMM2プレートにスポットし、0.8 μM 4-NQOの存在下で増殖を示したのは16個のみであることが観察されました(図3C)。これらの観察をさらに確認するために、これらの16個の形質転換体を、0.8 μM 4-NQOまたは4-NQOを含まない(対照)のいずれかを含む必要なサプリメントを含むEMM2プレートにスポットし、空のベクターで形質転換した ell1 欠失変異体とともに発見しました。これらのスポッティングアッセイの結果、予想通り、空のベクターで形質転換された ell1 欠失株、および16個の形質転換体すべてが、4-NQOを欠くプレート上で増殖を示したことが明らかになりました。比較すると、空のベクターのみを含む ell1 欠失変異体は0.8 μM 4-NQOで増殖を示さなかったのに対し、6つの形質転換体は0.8 μM 4-NQOで増殖を示し(図3D)、それらに存在するライブラリクローンが ell1 null変異体の遺伝毒性ストレス表現型を抑制する能力を持っていることが示唆されました。
サプレッサークローンによってコードされる遺伝子の同定
次に、ell1欠失株の02遺伝子抑制因子sup84およびsup104を選択し、4-NQOの存在下でell1関連増殖感受性を完全に抑制した。ライブラリプラスミドクローンは、これら2つの酵母サプレッサーから単離され、有能な大腸菌細胞に形質転換されました。続いて、プラスミドを、標準プロトコール31を用いて大腸菌細胞から単離した。84および104と標識された2つの単離されたプラスミドを制限消化にかけたところ、それぞれ約1,000 bpおよび800 bpのインサートDNA断片が存在することが明らかになりました(図4A、B)。このサプレッサースクリーニングの結果をさらに検証するために、これらのプラスミドをell1欠失変異体に再形質転換し、4-NQOの存在下でell1ヌル変異体の増殖を回復できるかどうかを調べました。ストレススポットアッセイの結果、サプレッサープラスミドクローンがell1 null変異体に再導入されたときに4-NQO関連増殖感受性の抑制をもたらすことが明らかになり、抑制がプラスミド依存性であることが示唆されました(図4C)。さらに、これらのサプレッサークローンが、別のDNA損傷誘発化合物であるMMSの存在下で、ell1欠失株の増殖関連感受性も抑制できるかどうかを決定することにしました。スポットアッセイは、サプレッサープラスミドクローンのell1ヌル変異体への形質転換が、空のベクターによるell1欠失変異体の形質転換よりもMMS含有培地上でより多くの増殖をもたらすことを示し、これらのプラスミドクローンが両方の遺伝毒性物質の存在下でell1欠失変異体の遺伝毒性ストレス感受性を抑制できることを示しました。 すなわち、4-NQOおよびMMSである(図4D)。
次に、これらのサプレッサープラスミドクローンに存在する遺伝子を同定するために、adh1プロモーター特異的ユニバーサルフォワードプライマー30を用いてインサートDNA断片の配列決定を行った。得られた塩基配列をPomBaseウェブサイト(https://www.pombase.org)で入手可能な「BLAST at Ensembl」ツールを用いて検索したところ、2つのプラスミドクローン84および104にそれぞれrax2+およびosh6+遺伝子が含まれていることが明らかになり、Rax2およびOsh6がS. pombeにおけるell1+の不在に関連する遺伝毒性ストレス感受性表現型の抑制に関与しているという証拠を提供した。.S. pombeにおけるこれら両方のタンパク質の機能に関する知識は限られている。Rax2は、S. pombe32の栄養成長中の細胞極性を制御するためにFor3pの局在を制御することが示されています。Osh6は、オキシステロール結合タンパク質関連タンパク質ファミリーに属する脂質輸送タンパク質です。小胞体から原形質膜33へのホスファチジルセリンの輸送に関与している。
図1:遺伝子マルチコピーサプレッサースクリーンの概略図。このプロトコルには、ライブラリのクエリ変異株への形質転換、クエリ変異株の望ましい表現型を抑制するプラスミドクローンの選択、これらのサプレッサークローンからのプラスミドの取得、および表現型の抑制に関与する遺伝子の同定の4つの主要なステップがあります。略称:4-NQO = 4-ニトロキノリン1-オキシド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:S. pombeにおけるell1欠失関連遺伝毒性ストレス感受性のマルチコピーサプレッサーのスクリーニング。 (A)ell1-欠失したS. pombe株の同質遺伝子野生株と比較した4-NQO感受性を示すストレススポットアッセイ。適切な菌株の段階希釈(1:10)を、アデニン、ロイシン、およびウラシルのそれぞれ225 μg/mLを含むEMM2培地に、0.4 μM 4-NQOの有無にかかわらずスポットしました。次いで、プレートを32°Cで3〜5日間インキュベートした。 (B)高コピー数cDNAライブラリーをell1欠失S. pombe株で形質転換し、形質転換コロニーをロイシンを含まないが0.2μM 4-NQOを含むEMM2培地に播種した。少量の変態混合物も、対照として、4-NQOを欠くEMM2プレートに播種した。プレートを32°Cで5〜6日間インキュベートし、写真を撮影した。パネルBは、これらのプレートの代表像を示す。略称:4-NQO = 4-ニトロキノリン1-オキシド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: ell1 欠失変異体の遺伝毒性ストレス感受性を抑制する推定サプレッサークローンの能力の検証。 (a)所望の表現型の試験抑制によるライブラリー形質転換体のスクリーニングの模式図。ロイシンを含まず、(B)0.4 μM 4-NQOまたは(C)0.8 μM 4-NQOのいずれかを含むEMM2プレート上の異なる形質転換体を発見して、620形質転換体の増殖を4-NQO濃度の増加でテストしました。プレートを32°Cで5〜6日間インキュベートし、写真を撮影した。プレートの代表的な画像が示されています。(D)0.8 μM 4-NQOで増殖を示した16個の形質転換体を、ロイシンを含まないが0.8 μM 4-NQOを含むか、4-NQOを含まないEMM2プレート(対照)と、空のベクターで形質転換した ell1 欠失株で発見しました。プレートを32°Cで5〜6日間インキュベートし、写真を撮影した。6つのコロニーのみが ell1 欠失関連遺伝毒性ストレス感受性を救済する能力を示した。略称:4-NQO = 4-ニトロキノリン1-オキシド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:サプレッサープラスミドクローンの同定。 (A) BamHI制限酵素によるサプレッサープラスミド84の制限消化のアガロースゲル画像は、~1kbのインサートを放出した。(B) PstI/BamHI制限酵素で消化されたサプレッサープラスミド104は、~800 bpのインサートを放出した。 (C)プラスミドsup 84またはsup 104で形質転換された1:10段階希釈 されたell1 ヌル変異体を、ロイシンを欠き、0.4μM 4-NQOまたは(D)0.01%MMSのいずれかを含むEMM2プレートにスポットした。コントロールプレートでは、DNA損傷剤は添加されませんでした。プレートを32°Cで4〜5日間インキュベートし、写真を撮影した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:S.ポンベの成長のための培地の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
酵母は、真核生物全体で進化的に保存されている基本的な生物学的プロセスと経路を調査するために広く使用されています。遺伝学的およびゲノム的ツールの利用可能性と、さまざまな生化学的、遺伝的、および分子的手順へのそれらの快適さにより、酵母は遺伝子研究のための優れたモデル生物になります34,35,36。長年にわたり、個々の遺伝子の機能、およびそれらが関与する可能性のある経路と生物学的プロセスに光を当てる遺伝的相互作用を特定するために、酵母研究者によってさまざまな遺伝子スクリーニングが設計されてきました10,11,17,37。遺伝的相互作用を同定するための一般的で有用なスクリーニングの1つは、「マルチコピーまたは高コピー数抑制」として知られています。
このスクリーニングでは、機能喪失表現型を示すクエリ変異株と、それに続く高コピー数のゲノムまたはcDNAライブラリによるこの変異クエリ株の形質転換が必要です。続いて、得られた形質転換体をスクリーニングしてそれらの遺伝子を同定し、過剰発現すると、クエリ変異株に関連する表現型を抑制する。特定の変異株とプラスミドライブラリクローンに存在する遺伝子との間のこの種の遺伝的相互作用は、同じ経路で作用する、または同じ生物学的プロセスに影響を与える可能性が高い遺伝子産物の単離および同定をもたらします4。したがって、この画面は、目的の遺伝子の機能、およびin vivoでの経路および生物学的プロセスへのそれらの機能的組織化に関する洞察を提供します。伝統的に、このスクリーンはS. cerevisiae 38,39,40,41,42で広く使用されてきました。
本研究の目的は、S. pombeでマルチコピー抑制遺伝子スクリーニングを実施するためのシンプルでわかりやすいプロトコルを記述することです。ell1転写伸長因子の欠失を有するS.ポンベ株を用いてスクリーニングを行った。ELLは転写伸長因子のファミリーであり、分裂酵母からヒトまで幅広い生物に存在する。Ell1の機能は、S. pombeで理解され始めたばかりです。以前の研究では、正常な成長条件における最適増殖および遺伝毒性ストレス条件下での生存におけるEll1の役割が強調されていました26。我々は、S. pombe26の遺伝毒性ストレス感受性におけるEll1の役割の根底にある分子メカニズムを明らかにするためのアプローチの1つとして、マルチコピーサプレッサースクリーニングを採用しました。マルチコピープラスミドにコードされたS.ポンベcDNAライブラリは、4-NQOに感受性を示すS.ポンベell1ヌル変異体に形質転換されました。続いて、4-NQOの存在下で増殖し得る形質転換体を選択した。
これらの形質転換体からのプラスミドの単離とこれらのプラスミドに存在するインサートのシーケンシングにより、S. pombeのell1+の2つの新しい遺伝的相互作用因子、rax2+とosh6+が同定されました。S. pombeの同様の遺伝子スクリーニングを用いた以前の研究では、抗サイレンシングタンパク質epe1+がell1欠失関連表現型のマルチコピー抑制因子として同定されました43。また、この方法を使用して、S.ポンベRNAポリメラーゼIIの非必須Rpb9サブユニットのマルチコピーサプレッサーを同定しました(未発表の観察結果)。これらの結果は、目的の遺伝子と遺伝的相互作用を示す推定遺伝子/タンパク質を同定する方法としての遺伝子マルチコピーサプレッサースクリーニングアプローチの有用性を検証し、目的の遺伝子が関与する可能性のある機能、経路、およびプロセスを解明します。
この研究で説明されている画面を使用するには、まず、マルチコピーサプレッサーを分離するために使用できる、突然変異に関連する明確な表現型を示すクエリ変異株を持つことが重要です。さらに、このスクリーニングの成功は、野生型遺伝子の最大数またはそれに対応するcDNAを表すクローンを含む高品質で優れた代表的なライブラリの入手可能性に依存します。従来、これらのスクリーニングではゲノムライブラリとcDNAライブラリの両方が使用されてきましたが、cDNAライブラリには、細胞/生物で発現するmRNAから作られるという利点があります。さらに、多数の形質転換体をスクリーニングすることが重要であり、サプレッサーを同定する確率を高めることが重要であるため、酵母細胞への形質転換の高効率はスクリーニングの成功に不可欠です。酢酸リチウムプロトコルを使用してライブラリをクエリ変異株に形質転換した後、コントロールプレート上で得られる形質転換体が少ない場合は、エレクトロポレーションを使用してライブラリを形質転換できます。
また、ライブラリを形質転換する前に、まず別のプラスミドで形質転換プロトコルを標準化することをお勧めします。そうしないと、ライブラリが不必要に失われます。ここで説明するプロトコルは、変異体表現型として4-NQO感度を使用しますが、目的の特定の変異体表現型に基づいてサプレッサーを選択するために適切なスクリーニング方法/アッセイを設計する必要があります。ライブラリをクエリ変異株に形質転換した後、サプレッサーを選択する形質転換体がプレート上に得られないか、非常に少ない場合は、可能であれば、ライブラリをプレーティングするときにストリンジェントでない条件/アッセイを使用してサプレッサーを選択し、できるだけ多くの遺伝子サプレッサーを検出してから、高ストリンジェンシー条件下でそれらを確認する必要があります。同定されたサプレッサープラスミドクローンにおけるインサートの存在を試験するために制限酵素処理を使用することに加えて、ベクター特異的プライマーを用いたPCRを使用して、所望のインサートDNA断片を増幅することができる。あるいは、サプレッサープラスミドクローンをシーケンシングのために直接与えることができ、制限酵素処理またはPCRの必要性を回避する。
このスクリーニングは、遺伝子の過剰発現を促進し、宿主酵母細胞に存在する変異表現型のレスキューを可能にする適切な変異株、プラスミド、およびプロモーター構築物に関する遺伝ツールキットが利用可能である場合、 S. cerevisiae および S. pombe 以外の酵母にも採用され得る。さらに、ゲノムワイド欠失変異体44 および過剰発現ライブラリー37の収集を含むゲノムワイドリソースの利用可能性により、このスクリーニングは、1つまたは少数のクエリプラスミドを酵母変異株コレクションの系統的アレイに形質転換することによって、または過剰発現プラスミドコレクションの系統的アレイを1つまたは少数の変異クエリ株に変換することによっても行うことができる45.結論として、このアプローチは、さまざまな生物におけるさまざまな実験的質問に明確に一般化できます。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省からの研究助成金によって資金提供されました(助成金番号。BT / PR12568 / BRB / 10/1369/2015)からニミシャシャルマへ。著者らは、 S. pombe cDNAライブラリーの寄贈についてチャールズ・ホフマン教授(米国ボストン大学)と酵母プラスミドを提供してくれたスーザン・フォースバーグ教授に感謝の意を表した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
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