Démonstration de l’alignement des séquences pour prédire l’outil de sensibilité entre espèces pour une évaluation rapide de la conservation des protéines

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la dernière version de l’outil SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) de l’Environmental Protection Agency des États-Unis. Ce protocole démontre l’application de l’outil en ligne pour analyser rapidement la conservation des protéines et fournir des prédictions personnalisables et facilement interprétables de la sensibilité chimique entre les espèces.

Abstract

L’outil SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) de l’Environmental Protection Agency des États-Unis est une application de dépistage en ligne rapide et gratuite qui permet aux chercheurs et aux organismes de réglementation d’extrapoler les informations sur la toxicité entre les espèces. Pour les cibles biologiques dans des systèmes modèles tels que les cellules humaines, les souris, les rats et les poissons-zèbres, des données sur la toxicité sont disponibles pour une variété de produits chimiques. Grâce à l’évaluation de la conservation des cibles protéiques, cet outil peut être utilisé pour extrapoler les données générées par ces systèmes modèles à des milliers d’autres espèces dépourvues de données de toxicité, ce qui donne des prédictions de la susceptibilité chimique intrinsèque relative. Les dernières versions de l’outil (versions 2.0-6.1) ont incorporé de nouvelles fonctionnalités qui permettent la synthèse, l’interprétation et l’utilisation rapides des données pour la publication et des graphiques de qualité présentation.

Parmi ces fonctionnalités figurent des visualisations de données personnalisables et un rapport de synthèse complet conçu pour résumer les données SeqAPASS pour faciliter l’interprétation. Cet article décrit le protocole pour guider les utilisateurs dans la soumission des tâches, la navigation dans les différents niveaux de comparaison des séquences de protéines, et l’interprétation et l’affichage des données résultantes. Les nouvelles fonctionnalités de SeqAPASS v2.0-6.0 sont mises en évidence. En outre, deux cas d’utilisation axés sur la conservation de la transthyrétine et des protéines des récepteurs opioïdes à l’aide de cet outil sont décrits. Enfin, les forces et les limites de SeqAPASS sont discutées pour définir le domaine d’applicabilité de l’outil et mettre en évidence différentes applications pour l’extrapolation inter-espèces.

Introduction

Traditionnellement, le domaine de la toxicologie s’est fortement appuyé sur l’utilisation d’essais sur des animaux entiers pour fournir les données nécessaires aux évaluations de la sécurité chimique. Ces méthodes sont généralement coûteuses et gourmandes en ressources. Toutefois, en raison du grand nombre de produits chimiques actuellement utilisés et du rythme rapide auquel de nouveaux produits chimiques sont mis au point, il est reconnu à l’échelle mondiale qu’il existe un besoin de méthodes plus efficaces de dépistage des produits chimiques ^1,2. Ce besoin et le changement de paradigme qui en a résulté pour s’éloigner de l’expérimentation animale ont conduit au développement de nombreuses nouvelles méthodes d’approche, y compris les tests de criblage à haut débit, la transcriptomique à haut débit, le séquençage de nouvelle génération et la modélisation informatique, qui sont des stratégies de test alternatives^{prometteuses 3,4.}

L’évaluation de la sécurité chimique dans la diversité des espèces potentiellement touchées par les expositions chimiques a été un défi permanent, non seulement avec les tests de toxicité traditionnels, mais aussi avec les nouvelles méthodes d’approche. Les progrès de la toxicologie comparative et prédictive ont fourni des cadres pour comprendre la sensibilité relative de différentes espèces, et les progrès technologiques dans les méthodes de calcul continuent d’accroître l’applicabilité de ces méthodes. Plusieurs stratégies ont été discutées au cours de la dernière décennie qui tirent parti des bases de données existantes sur les séquences de gènes et de protéines, ainsi que de la connaissance de cibles moléculaires chimiques spécifiques, pour soutenir les approches prédictives pour l’extrapolation interspécifique et améliorer les évaluations de l’innocuité chimique au-delà des organismes modèles typiques 5,6,7,8.

Pour faire progresser la science dans l’action, s’appuyer sur ces études fondamentales en toxicologie prédictive, prioriser les efforts d’essais chimiques et soutenir la prise de décision, l’outil SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) de l’Environmental Protection Agency des États-Unis a été créé. Cet outil est une application Web publique et gratuite qui utilise des dépôts publics d’informations sur les séquences de protéines en constante expansion pour prédire la susceptibilité chimique à travers la diversité des espèces⁹. Basé sur le principe selon lequel la susceptibilité intrinsèque relative d’une espèce à un produit chimique particulier peut être déterminée en évaluant la conservation des cibles protéiques connues de ce produit chimique, cet outil compare rapidement les séquences d’acides aminés protéiques d’une espèce ayant une sensibilité connue à toutes les espèces avec des données de séquence protéique existantes. Cette évaluation est complétée par trois niveaux d’analyse, y compris (1) la séquence d’acides aminés primaires, (2) le domaine fonctionnel et (3) les comparaisons de résidus d’acides aminés critiques, chacune nécessitant une connaissance plus approfondie de l’interaction chimique-protéine et fournissant une plus grande résolution taxonomique dans la prédiction de la susceptibilité. L’une des principales forces de SeqAPASS est que les utilisateurs peuvent personnaliser et affiner leur évaluation en ajoutant des sources de données supplémentaires pour la conservation des cibles en fonction de la quantité d’informations disponibles concernant l’interaction chimique-protéine ou protéine-protéine d’intérêt.

La première version a été publiée en 2016, ce qui a permis aux utilisateurs d’évaluer les séquences d’acides aminés primaires et les domaines fonctionnels de manière rationalisée pour prédire la sensibilité chimique et contenait des capacités minimales de visualisation des données (tableau 1). Il a été démontré que les différences individuelles d’acides aminés sont des déterminants importants des différences entre les espèces dans les interactions chimique-protéine, ce qui peut affecter la susceptibilité chimique^{des espèces 10,11,12}. Par conséquent, des versions ultérieures ont été développées pour prendre en compte les acides aminés critiques qui sont importants pour l’interaction chimique directe¹³. En réponse aux commentaires des intervenants et des utilisateurs, cet outil a fait l’objet d’une version annuelle avec de nouvelles fonctionnalités supplémentaires conçues pour répondre aux besoins des chercheurs et des organismes de réglementation en matière de résolution des problèmes liés à l’extrapolation interspécifique (tableau 1). Le lancement de la version 5.0 de SeqAPASS en 2020 a apporté des fonctionnalités centrées sur l’utilisateur qui intègrent des options de visualisation et de synthèse des données, des liens externes, des options de tableau récapitulatif et de rapport, ainsi que des fonctionnalités graphiques. Dans l’ensemble, les nouveaux attributs et capacités de cette version ont amélioré la synthèse des données, l’interopérabilité entre les bases de données externes et la facilité d’interprétation des données pour les prédictions de la sensibilité interspécifique.

Protocol

1. Mise en route

REMARQUE: Le protocole présenté ici est axé sur l’utilitaire de l’outil et les fonctionnalités clés. Des descriptions détaillées des méthodes, des caractéristiques et des composants sont disponibles sur le site Web dans un guide de l’utilisateur complet (tableau 1).

Tableau 1 : Évolution de l’outil SeqAPASS. Liste des fonctionnalités et mises à jour ajoutées à l’outil SeqAPASS depuis son déploiement initial. Abréviations : SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce à l’ensemble des espèces; ECOTOX = base de connaissances ECOTOXicology. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

1. Accédez à https://seqapass.epa.gov/seqapass à l’aide de Chrome. Sélectionnez Connexion pour utiliser un compte existant ou suivez les instructions pour créer un compte SeqAPASS, ce qui permettra aux utilisateurs d’exécuter, de stocker, d’accéder et de personnaliser leurs tâches terminées.
2. Avant d’effectuer une analyse, identifiez d’abord une protéine d’intérêt et une espèce ciblée ou sensible en examinant la littérature existante ou les données préexistantes (figure 1). Comme SeqAPASS contient des liens vers des ressources externes pour aider à identifier la protéine de requête, cliquez sur les boutons déroulants sous Identifier une cible protéique pour accéder aux ressources pertinentes.

Figure 1: Formulation du problème SeqAPASS: schéma des informations préliminaires nécessaires à une analyse réussie. Abréviations : SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce à l’ensemble des espèces; LBD = domaine de liaison au ligand. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Interopérabilité SeqAPASS entre les bases de données. Diagramme schématique des outils, bases de données et ressources externes intégrés dans SeqAPASS. Abréviations : SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce à l’ensemble des espèces; POA = voie de résultat indésirable; NCBI = Centre national d’information sur la biotechnologie; ECOTOX = base de connaissances ECOTOXicology. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 2 : Liens, ressources et outils intégrés dans l’outil SeqAPASS. Une liste des différentes sources de données, liens et ressources exploités dans l’outil SeqAPASS. Abréviation : SeqAPASS = alignement de séquence pour prédire la sensibilité de l’espèce. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Développement et exécution d’une requête SeqAPASS : Niveau 1

REMARQUE: Dans une analyse de niveau 1, toute la séquence d’acides aminés primaires d’une protéine de requête est comparée aux séquences d’acides aminés primaires de toutes les espèces avec des informations de séquence disponibles. Cet outil utilise des algorithmes pour exploiter, collecter et compiler des données accessibles au public afin d’aligner et de comparer rapidement les séquences d’acides aminés entre les espèces. Le backend stocke des informations provenant des bases de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et utilise stratégiquement les versions autonomes de l’outil de recherche d’alignement local de base des protéines (BLASTp)⁵⁴ et de l’outil d’alignement multiple basé sur les contraintes (COBALT)⁵⁵.

1. Sous Comparer les séquences d’acides aminés primaires, cliquez sur Par espèce ou Par accession. Utilisez la sélection Par espèce pour taper ou sélectionner dans une liste d’espèces pour choisir la protéine cible d’intérêt.
2. Soumettez les accessions de protéines (c.-à-d. ID de protéine NCBI) directement en entrant l'(les ) accession(s) dans la zone de texte Par accession .
3. Sélectionnez Exécuter la demande pour envoyer la requête. Une fois soumis, attendez qu’une notification apparaisse dans le coin supérieur droit de la fenêtre du navigateur indiquant une soumission réussie.
4. Sélectionnez l’onglet État d’exécution SeqAPASS en haut de la page pour afficher une liste de toutes les exécutions SeqAPASS effectuées sous ce compte d’utilisateur et vérifier le pourcentage d’achèvement.
   1. Cliquez sur Actualiser les données lorsque la case d’option appropriée est sélectionnée pour vérifier l’état des exécutions de niveau 2 et de niveau 3.
5. Sélectionnez l’onglet Afficher les rapports SeqAPASS en haut de la page pour accéder à la liste de tous les rapports complétés sous ce compte.
6. Dans l’onglet Afficher les rapports SeqAPASS , sélectionnez la protéine de requête qui vous intéresse. Cliquez sur Demander un rapport sélectionné pour ouvrir la page Informations sur les protéines de requête de niveau 1 et afficher les résultats, les options de personnalisation des données, les visualisations et les rapports récapitulatifs.
7. Par défaut, sélectionnez Afficher le rapport pour afficher les données dans le navigateur Web. Vous pouvez également sélectionner Enregistrer le rapport pour télécharger les données brutes sous forme de fichier .zip.
   REMARQUE : Le temps requis pour une analyse de niveau 1 varie (moyenne de 23 minutes pour la version 5.1) en fonction de la demande globale de l’utilisateur à ce moment-là, du nombre de tâches soumises à la file d’attente et de la quantité d’informations de protéines qui existent pour une tâche soumise. Si une cible protéique a déjà été complétée, les données seront disponibles en quelques secondes après la soumission.

3. Développement et exécution d’une requête SeqAPASS : Niveau 2

REMARQUE : Comme la séquence protéique entière n’est pas directement impliquée dans une interaction chimique, une analyse de niveau 2 compare uniquement la séquence d’acides aminés du domaine fonctionnel pour faire des prédictions de sensibilité aux rangs taxonomiques inférieurs (p. ex., classe, ordre, famille).

1. Dans la page Informations sur la protéine de requête de niveau 1, cliquez sur le signe plus + en regard de l’en-tête de niveau 2 pour remplir le menu Requête de niveau 2 .
2. Identifiez le(s) domaine(s) approprié(s) dans la protéine d’intérêt (protéine de requête).
   1. Si aucun domaine n’a été identifié, cliquez sur le lien intégré vers la base de données des domaines conservés (CDD) du NCBI (Tableau 1), ce qui peut faciliter l’identification de la sélection de domaine appropriée.
      REMARQUE : En règle générale, seuls des domaines d’accès spécifiques sont sélectionnés comme requêtes au niveau 2.
3. Cliquez sur la zone Sélectionner un domaine pour remplir automatiquement une liste de domaines fonctionnels pour la protéine de requête.
4. Sélectionnez la ou les accessions de domaine dans la liste déroulante et lancez la requête de niveau 2 en cliquant sur le bouton Demander l’exécution du domaine . Une fois soumis, attendez qu’une notification apparaisse indiquant une soumission réussie.
5. Cliquez sur Actualiser les exécutions de niveau 2 et 3 pour remplir les données de niveau 2, qui seront disponibles dans les secondes suivant la soumission.
6. Sous Afficher les données de niveau 2, sélectionnez l’acquisition de domaine terminée dans la liste déroulante et cliquez sur le bouton Afficher les données de niveau 2 pour ouvrir les résultats dans une nouvelle page.

4. Accès et compréhension des données : SeqAPASS Niveau 1 et Niveau 2

1. Faites défiler jusqu’au bas de la page Interroger les informations sur les protéines pour afficher un rapport des résultats - un rapport principal est fourni avec des analyses de niveaux 1 et 2 par défaut. Sélectionnez la case d’option Rapport complet pour afficher un rapport plus détaillé qui fournit tous les accès de séquence et les mesures d’alignement. Cliquez sur l’accession/ID /nom approprié dans les deux rapports pour accéder aux informations transparentes sur l’alignement des protéines et la taxonomie dans la base de données NCBI.
2. Faites défiler vers la droite du tableau des résultats pour afficher la colonne ECOTOX . Cliquez sur les liens vers la base de connaissances ECOTOXicology (ECOTOX) pour recueillir rapidement les données de toxicité correspondantes pour les espèces dont la sensibilité est prédictée.
   NOTE: ECOTOX est une base de connaissances complète et accessible au public fournissant des données uniques sur la toxicité chimique pour les plantes aquatiques et terrestres et la faune. SeqAPASS v6.0 inclut un widget ECOTOX pour se connecter plus rapidement aux données ECOTOX pertinentes par produit chimique et espèce d’intérêt.
3. Cliquez sur Télécharger le tableau pour enregistrer le tableau en tant que fichier de feuille de calcul. Cliquez sur le bouton Afficher le rapport récapitulatif pour afficher et télécharger un tableau de rapport récapitulatif présentant les données triées par groupe taxonomique.
   REMARQUE : Des tableaux sommaires des données sont disponibles pour les rapports principal et complet et donnent un aperçu des prévisions pour une cible donnée.

5. Manipulation des paramètres de données : SeqAPASS Niveau 1 et Niveau 2

REMARQUE : Dans les analyses de niveau 1 et de niveau 2, on suppose que plus la similitude protéique est grande, plus il est probable qu’un produit chimique interagisse avec la protéine de la même manière que l’espèce ou la protéine interrogée, ce qui les rend vulnérables aux impacts potentiels des produits chimiques avec cette cible moléculaire. En raison de la similitude de ces données, les étapes de compréhension des données de niveaux 1 et 2 sont décrites ensemble dans un seul protocole.

1. Reportez-vous aux sous-menus situés en haut de la section Interroger les informations sur les protéines pour accéder aux paramètres du rapport et les manipuler, et utilisez les paramètres par défaut pour toutes les options de rapport pour la plupart des analyses. S’il existe une justification scientifique pour modifier le paramètre par défaut, procédez comme suit :
   1. (FACULTATIF) Cliquez sur le signe plus + en regard de Seuil de sensibilité pour afficher et ajuster les paramètres de seuil de susceptibilité dans un nouvel onglet. Sélectionnez une nouvelle valeur seuil dans une liste déroulante ou entrez une valeur seuil définie par l’utilisateur.
   2. (FACULTATIF) Modifiez le nombre dans le champ Valeur E (le nombre d’alignements différents attendus par hasard) si quelque chose d’autre que la valeur par défaut est souhaité.
      REMARQUE: Toute protéine avec une valeur E supérieure au nombre dans la boîte sera éliminée du rapport primaire.
   3. (FACULTATIF) Utilisez l’option Trier par groupe taxonomique pour choisir le niveau de hiérarchie taxonomique à afficher dans la colonne Groupe taxonomique filtré du tableau des résultats.
      REMARQUE : La modification de la hiérarchie taxonomique modifiera également la prédiction de la sensibilité en fonction des espèces de chaque groupe filtré qui se trouvent au-dessus du seuil.
   4. (FACULTATIF) Modifiez le champ Domaine commun (combien de domaines communs une protéine doit partager avec la protéine de requête à inclure dans les résultats) si quelque chose d’autre que la valeur par défaut est souhaité.
      Remarque : Comme le paramètre par défaut est 1, toute séquence qui ne partage pas au moins un domaine commun avec la protéine de requête sera exclue.
   5. (FACULTATIF) Sélectionnez Non sous Lecture croisée des espèces pour récupérer les prédictions de sensibilité de Y uniquement si le pourcentage de similarité est supérieur ou égal au seuil ou si le résultat positif est identifié comme un candidat orthologue.
      REMARQUE : Ce paramètre par défaut est Oui, ce qui signifie qu’une prédiction de sensibilité de Y sera signalée pour tous les candidats orthologues, toutes les espèces énumérées au-dessus du seuil de sensibilité et toutes les espèces en dessous du seuil du même groupe taxonomique avec une ou plusieurs espèces au-dessus du seuil.
2. Cliquez sur le bouton Télécharger les paramètres actuels du rapport pour télécharger un fichier capturant les paramètres actuels appliqués.
   REMARQUE : Le niveau d’évaluation spécifique (1, 2 ou 3) sélectionné dictera les paramètres présentés dans le rapport.

6. Visualisation des données : SeqAPASS Niveau 1 et Niveau 2

1. Cliquez sur le signe plus + en regard de Visualisation et cliquez sur le bouton Visualiser les données pour ouvrir un onglet séparé affichant les informations définies par l’utilisateur et la possibilité de sélectionner un graphique interactif des résultats.
2. Cliquez sur Boxplot pour ouvrir les contrôles interactifs boxplot et plot et permettre à la visualisation boxplot de se mettre à jour activement pour refléter les modifications apportées au tableau de données et fournir des graphiques de qualité publication et présentation.
   Remarque : Le boxplot par défaut affiche les groupes d’espèces sur l’axe des x et le pourcentage de similarité sur l’axe y. Les diagrammes en boîte affichent le seuil de sensibilité (ligne pointillée), le pourcentage de similitude entre les espèces par rapport aux espèces interrogées, et les valeurs moyennes et médianes pour chaque groupe taxonomique ainsi que les 25e et 75e percentiles et l’intervalle interquartile. En fonction de l’objectif de l’analyse et des besoins de l’utilisateur, de nombreuses fonctionnalités du boxplot peuvent être modifiées par les étapes facultatives suivantes.
   1. (FACULTATIF) Pour personnaliser les groupes taxonomiques affichés, reportez-vous à la zone Groupes taxonomiques de la section Contrôles . Supprimez des groupes en faisant défiler les noms et en sélectionnant x ou en utilisant le menu déroulant Groupes taxonomiques .
   2. (FACULTATIF) Pour ajouter une légende qui identifiera une espèce d’intérêt ou des groupes prédéfinis spécifiques (par exemple, des espèces en voie de disparition ou menacées), passez la souris sur un nom de groupe taxonomique sur l’axe des x pour activer une boîte contextuelle répertoriant les trois principales espèces classées par pourcentage de similitude le plus élevé. Survolez les espèces dans la légende pour générer une boîte contextuelle contenant les informations sur les espèces correspondantes. Cliquez sur la case correspondant à un groupe taxonomique spécifique pour générer un tableau récapitulatif téléchargeable répertoriant les espèces et les prévisions.
3. Cliquez sur Télécharger Boxplot pour choisir un type de fichier, personnaliser la résolution largeur/hauteur et enregistrer la visualisation.

7. Élaboration et exécution d’une analyse SeqAPASS : Niveau 3

REMARQUE : Une analyse de niveau 3 évalue les résidus d’acides aminés identifiés par l’utilisateur dans la protéine de requête et compare rapidement la conservation de ces résidus entre les espèces. On présume que les espèces dans lesquelles ces résidus sont conservés sont plus susceptibles d’interagir avec un produit chimique d’une manière similaire à l’espèce/protéine modèle. Comme le niveau 3 se concentre sur les acides aminés individuels, une analyse ne peut être effectuée que lorsque des connaissances détaillées sur les résidus d’acides aminés essentiels à l’interaction chimique-protéine ou protéine-protéine sont disponibles.

1. Cliquez sur le signe plus + en regard de l’en-tête de niveau 3 de la page Informations sur les protéines de requête de niveau 1 pour remplir le menu Requête de niveau 3.
2. Cliquez sur le signe plus + en regard de l’Explorateur de références pour ouvrir l’outil Explorateur de références, qui génère une chaîne booléenne prédéfinie pour interroger la documentation disponible et aide les utilisateurs à identifier la littérature appropriée pour appuyer l’identification des acides aminés critiques à utiliser dans l’évaluation de niveau 3 (tableau 2 et figure 2).
   1. (FACULTATIF) Une fois la protéine de requête remplie automatiquement, utilisez la fonction Ajouter un nom de protéine pour ajouter des protéines supplémentaires.
3. Cliquez sur le lien Générer Google Scholar pour ouvrir une fenêtre contextuelle contenant une chaîne de recherche générée automatiquement qui inclut les termes de recherche pertinents.
4. Cliquez sur Rechercher dans Google Scholar pour interroger la base de données de littérature à l’aide de la chaîne de recherche.
   1. Vous pouvez également cliquer sur Copier dans le Presse-papiers et personnaliser la chaîne de recherche en ajoutant ou en supprimant des termes à l’aide des fonctions de l’Explorateur de références.

8. Identifier les résidus d’acides aminés critiques à l’aide de la littérature identifiée

1. Sélectionnez la séquence de modèles à laquelle les espèces sélectionnées par l’utilisateur seront alignées dans le menu Requête de niveau 3.
   REMARQUE : Cette séquence modèle est généralement choisie en fonction de la littérature pour laquelle les acides aminés critiques ont été identifiés et peut être la même espèce ou une espèce différente de celles interrogées aux niveaux 1 et 2.
   1. (FACULTATIF) Utilisez la zone Comparaisons supplémentaires pour comparer les accessions/séquences qui n’apparaissent pas dans les tableaux du rapport principal/complet .
2. Entrez un nom défini par l’utilisateur pour l’exécution de niveau 3 dans la zone de texte Entrer le nom de l’exécution de niveau 3 pour identifier l’exécution de niveau 3 terminée. Choisissez un nom unique pour chaque évaluation.
3. Sélectionnez le groupe taxonomique qui vous intéresse dans le champ Choisir le(s) groupe(s ) taxonomique(s). Sélectionnez un groupe taxonomique pour filtrer automatiquement la table en fonction de ce groupe taxonomique.
4. Dans le tableau des résultats, cochez manuellement la case en regard de n’importe quelle espèce à aligner sur la séquence de modèles.
   REMARQUE : Pour assurer un alignement approprié, un groupe taxonomique à la fois doit être comparé au modèle. Ne sélectionnez que des protéines annotées de manière similaire pour l’espèce d’intérêt. Lors de la sélection des séquences à comparer, il est important de prêter attention à certaines séquences (par exemple, hypothétiques, de MAUVAISE QUALITÉ ou partielles). À moins qu’il n’y ait une justification transparente de l’inclusion, il est préférable d’exclure ces séquences car elles peuvent fausser les prédictions en raison d’informations de séquence incomplètes ou inappropriées.
5. Répétez les étapes pour aligner tous les groupes taxonomiques d’intérêt.
6. Cliquez sur Actualiser les exécutions de niveau 2 et 3 une fois que toutes les espèces ont été alignées pour remplir le menu Sélectionner le nom de la course de niveau 3 avec les tâches de niveau 3 terminées et obtenir immédiatement les données d’un alignement de niveau 3.
7. Cliquez sur Combiner les données de niveau 3 pour combiner les alignements de plusieurs groupes taxonomiques.
   1. Pour afficher un seul rapport, vous pouvez également sélectionner le nom défini par l’utilisateur sous Choisir la requête à afficher et cliquer sur Afficher les données de niveau 3.
8. Sélectionnez le modèle de niveau 3 à utiliser comme base pour la comparaison des résidus d’acides aminés dans le menu Combiner les rapports de niveau 3 et cliquez sur Suivant.
9. Dans les tâches de niveau 3, sélectionnez les tâches terminées pour la comparaison et cliquez sur Suivant. Utilisez la fonction Order Level 3 Jobs pour réorganiser les groupes taxonomiques si vous le souhaitez. Cliquez sur Afficher les données de niveau 3 pour produire une page de rapport de niveau 3 avec les groupes taxonomiques combinés alignés.
10. Sélectionnez les positions des acides aminés précédemment identifiées pour l’espèce modèle en tapant la ou les positions des acides aminés, séparées par des virgules, dans la zone Entrer les positions des résidus d’acides aminés , puis en sélectionnant Copier dans la liste des résidus. Sélectionnez directement les résidus dans la séquence du modèle à partir de la boîte de navette.
11. Cliquez sur Mettre à jour le rapport pour actualiser la page et afficher les prévisions de susceptibilité de niveau 3.
    REMARQUE : Le niveau 3 utilise un ensemble simple de règles dérivées des descripteurs de base des propriétés fonctionnelles de la chaîne latérale (p. ex., aliphatique, aromatique) et des dimensions moléculaires (différences de poids moléculaire >30 g/mol) pour déterminer si les différences à des positions clés sont susceptibles d’affecter les interactions protéiques¹³.

9. Visualisation des données SeqAPASS de niveau 3

REMARQUE : Comme dans les niveaux précédents, les rapports principal et complet sont disponibles. En plus des données identiques aux données des niveaux 1 et 2, le rapport principal affiche les positions des acides aminés, les abréviations et une susceptibilité oui/non (O/N) similaire à celle du modèle de prédiction. De même, le rapport complet contient des informations sur la classification de la chaîne latérale des acides aminés et le poids moléculaire.

1. Sur la page Rapport de niveau 3, faites défiler vers le bas pour afficher un rapport des résultats. Cliquez sur Télécharger le tableau en bas du rapport pour enregistrer le tableau .
2. Cliquez sur Afficher le rapport récapitulatif de niveau 3 pour afficher et télécharger un tableau de rapport récapitulatif présentant les données triées par groupe taxonomique. Cliquez sur le signe plus + en regard de Visualisation sur la page Rapport de niveau 3 pour ouvrir un onglet de navigateur distinct affichant les informations définies par l’utilisateur et la possibilité d’afficher les résultats sous la forme d’une carte thermique interactive.
3. Cliquez sur Carte thermique sur la page Informations sur la visualisation pour ouvrir le graphique interactif et les contrôles et permettre à la visualisation de la carte thermique de se mettre à jour activement pour refléter les modifications apportées au tableau de données. Effectuez les étapes facultatives suivantes pour personnaliser la carte thermique.
   1. (FACULTATIF) Sélectionnez Options de rapport pour basculer entre un rapport simple, qui affiche la position des acides aminés, l’abréviation d’une lettre et la similitude des acides aminés, ou un rapport complet, qui affiche des informations détaillées sur chaque acide aminé sélectionné.
   2. (FACULTATIF) Sélectionnez Options de rapport pour modifier la façon dont les espèces sont affichées, soit par nom commun , soit par nom scientifique.
      REMARQUE : Dans le rapport simple, les acides aminés sont classés comme une correspondance totale (bleu foncé), une correspondance partielle (bleu clair, substitutions ne répondant qu’à un seul critère) ou une correspondance non (jaune, substitutions ne répondant à aucun des critères) à l’acide aminé modèle. Le rapport complet affiche les comparaisons sous la forme d’une correspondance totale (bleu foncé) ou d’une correspondance non conforme (jaune).
   3. (FACULTATIF) Sélectionnez Sélections facultatives pour mettre en évidence des informations utiles telles que les candidats orthologues, les espèces menacées, les espèces en voie de disparition ou les organismes modèles communs.
   4. (FACULTATIF) Sélectionnez Paramètres de carte thermique pour sélectionner des options de personnalisation supplémentaires, notamment l’ajout ou la suppression de colonnes, de légendes et de texte.
4. Cliquez sur Télécharger Boxplot pour choisir un type de fichier et enregistrer la visualisation.

10. Interprétation des résultats de SeqAPASS : Sources de données pour la conservation des protéines

REMARQUE : Pour faciliter l’interprétation, cet outil comprend un rapport sommaire de décision (rapport DS) conçu pour intégrer les données entre les niveaux. Le rapport DS contient les résultats (c.-à-d. tableaux de données et/ou visualisations) que l’utilisateur a sélectionnés et permet d’évaluer rapidement les prévisions de sensibilité à plusieurs niveaux pour plusieurs espèces simultanément.

1. Cliquez sur Push Level # to DS Report dans les pages de résultats ou de visualisation des données et attendez que les données soient « poussées » et que l’onglet DS Report devienne actif.
   REMARQUE : Si les résultats ou les modifications n’ont pas été transmis au rapport DS, l’option Niveau de diffusion # vers le rapport DS restera active jusqu’à ce qu’elle soit sélectionnée. Si un paramètre a été modifié, le texte Cliquez pour pousser les nouvelles modifications s’affiche jusqu’à ce que les modifications soient transmises au rapport. Les visualisations peuvent être envoyées au rapport DS à tout moment au cours de l’évaluation.
2. Sélectionnez l’onglet Rapport DS à tout moment pour accéder à la page DS .
   REMARQUE : Pour toutes les espèces alignées au niveau 1, le tableau du Rapport sommaire de décision finale contient les données importantes et les prévisions de sensibilité pour chaque analyse. Si une espèce figurant dans le tableau DS n’a pas été incluse dans le rapport de niveau 3, mais qu’elle a occupé des emplois de niveau 1 et/ou de niveau 2, la cellule du tableau recevra une désignation sans objet (NA) pour la prédiction de sensibilité de niveau 3.

Representative Results

Pour démontrer l’application de l’outil SeqAPASS et mettre en évidence de nouvelles fonctionnalités, deux études de cas sont décrites représentant des cas dans lesquels la conservation des protéines prédit qu’il existe des différences de sensibilité chimique entre les espèces (transthyrétine humaine) et qu’il n’y a pas de différences (μ récepteur opioïde [MOR]). Le premier de ces exemples porte sur les comparaisons de séquences protéiques et de structures pour prédire le domaine d’applicabilité des voies de résultats indésirables (POA, voir le tableau 2 pour la définition), tandis que le second est axé sur l’élaboration d’hypothèses de recherche pertinentes à la sensibilité interspécifique aux opioïdes présents dans les eaux usées. Les approches de base décrites dans ces études de cas peuvent être appliquées à n’importe quel produit chimique et démontrent la grande utilité de cet outil pour la prise de décision et la recherche.

Les hormones thyroïdiennes sont essentielles à la croissance et au développement normaux. Ils sont synthétisés dans la glande thyroïde et sécrétés dans la circulation sanguine où ils se lient aux protéines de distribution et circulent dans tout le corps 14,15,16,17,18. Des études récentes ont montré que les contaminants environnementaux, tels que les biphényles polychlorés (BPC), les polybromodiphényléthers (PBDE) et les substances perfluoroalkyliques et polyfluoroalkyliques (PFAS), peuvent se lier de manière compétitive à la protéine de distribution transthyrétine (TTR) et perturber les processus thyroïdiens normaux 19,20,21,22,23,24,25 . Un POA a été mis au point pour décrire la liaison compétitive au TTR entraînant une toxicité neurodéveloppementale humaine (https://aopwiki.org/aops/152). Bien qu’il existe des preuves que ce POA est également applicable aux rongeurs, l’applicabilité à d’autres groupes taxonomiques n’a pas encore été définie. Comme des produits chimiques liant le TTR sont présents dans l’environnement, il est important de comprendre la pertinence taxonomique de ce POA, un défi qui peut être relevé en partie par l’analyse SeqAPASS. En utilisant la stratégie de formulation de problèmes de l’outil, l’objectif de l’analyse peut être énoncé comme suit: sachant que les composés liant le TTR entraînent des effets indésirables chez les humains, quels groupes taxonomiques devraient partager une sensibilité similaire?

La protéine transthyrétine humaine est bien caractérisée, et il existe plusieurs ligands bien étudiés connus pour se lier au site de liaison TTR humain (hTTR), ce qui en fait une cible optimale pour l’analyse SeqAPASS 8,9,13. En utilisant l’accession NCBI pour la transthyrétine humaine, P02766.1, une analyse de niveau 1 a été effectuée avec les paramètres par défaut. Les résultats de l’analyse de niveau 1 ont fixé le seuil de similarité en pourcentage à 49 %, les mammifères (Mammalia), les oiseaux (Aves), les reptiles (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), les amphibiens (Amphibia) et la plupart des espèces de poissons (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) se situant au-dessus de ce seuil (figure 3). Ainsi, toutes les espèces de ces groupes taxonomiques ont donné lieu à une prédiction de sensibilité de « Y » (c.-à-d. oui) et sont probablement sensibles aux produits chimiques connus pour interagir avec hTTR (figure 3 et fichier supplémentaire 1).

Pour l’évaluation de niveau 2 des domaines fonctionnels, la base de données des domaines conservés du NCBI a été utilisée pour identifier TR_THY (accession smart00095) comme un domaine conservé comprenant la chaîne mature de la protéine sous-unitaire TTR des résidus 27 à 147. Comme la séquence protéique du TTR rapportée dans le NCBI comprend un présegment de 20 acides aminés non pertinent pour la présente analyse, le fait de concentrer la comparaison sur la chaîne mature fournit une source de données supplémentaire, plus spécifique, pour la conservation de cette protéine chez les espèces. D’après l’évaluation de niveau 2, un seuil de similarité en pourcentage de 58 % a été signalé, les mammifères, les oiseaux, les reptiles, les amphibiens et la plupart des espèces de poissons se situant à nouveau au-dessus de ce seuil (figure 4). Par conséquent, SeqAPASS a conclu à une prédiction de sensibilité de « Y » (c.-à-d. oui) pour les espèces de ces groupes taxonomiques, indiquant qu’elles sont probablement sensibles aux produits chimiques qui interagissent avec la protéine hTTR (figure 4 et fichier supplémentaire 1). Dans l’ensemble, les résultats des analyses de niveaux 1 et 2 suggèrent que la plupart des espèces de vertébrés partagent la conservation du hTTR et sont susceptibles d’être sensibles aux produits chimiques connus pour interagir avec cette protéine.

Figure 3 : Analyse SeqAPASS de niveau 1 de la conservation de la transthyrétine dans les groupes taxonomiques avec des informations de séquence disponibles par rapport à la protéine humaine. Le pourcentage de similitude de la séquence d’acides aminés protéiques est affiché sur l’axe des Y; le groupe taxonomique est affiché sur l’axe des abscisses. Les cercles ouverts (○) indiquent la séquence de requête, et les cercles fermés (●) indiquent les espèces du groupe taxonomique présentant le pourcentage de similitude le plus élevé. Dans le graphique, le haut et le bas de chaque case représentent les 75e^et 25e^centiles, les moustaches s’étendent jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile et les valeurs moyennes et médianes sont représentées par des lignes noires horizontales sur la boîte. La ligne pointillée indique le seuil pour les prédictions de susceptibilité. Abréviations : TTR = transthyrétine; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la susceptibilité entre les espèces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse SeqAPASS de niveau 2 de la conservation du domaine de liaison au ligand du récepteur de la transthyrétine dans les groupes taxonomiques avec des informations de séquence disponibles par rapport à la protéine LBD humaine. Le pourcentage de similitude de la séquence d’acides aminés du domaine de liaison au ligand est affiché sur l’axe Y; le groupe taxonomique est affiché sur l’axe des abscisses. Les cercles ouverts (○) indiquent la séquence de requête, et les cercles fermés (●) indiquent les espèces du groupe taxonomique présentant le pourcentage de similitude le plus élevé. Dans le graphique, le haut et le bas de chaque case représentent les 75e^et 25e^centiles, les moustaches s’étendent jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile et les valeurs moyennes et médianes sont représentées par des lignes noires horizontales sur la boîte. La ligne pointillée indique le seuil pour les prédictions de susceptibilité. Abréviations : TTR = transthyrétine; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la susceptibilité entre les espèces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Grâce à l’analyse de la modélisation moléculaire et des études de cristallographie des protéines, des acides aminés ont été identifiés dans la région de liaison du TTR qui devraient interagir avec le ligand endogène 3,3′,5,5′-tétraiodo-L-thyronine (T4, PDB 2ROX), ainsi qu’avec trois produits chimiques environnementaux: le sulfonate de perfluorooctane (SPFO, PDB 5JIM), le tétrabromobisphénol A (TBBPA, PDB 5HJG) et le diéthylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)^{19, 21,22,26}. Les résidus d’acides aminés Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 et Thr139 ont tous été identifiés comme jouant un rôle clé dans les interactions protéine-ligand, soit par des interactions directes de liaison hydrogène, soit par des interactions de van der Waals. Ces six résidus d’acides aminés ont été évalués dans le cadre d’une analyse de niveau 3 sur l’ensemble des espèces en utilisant hTTR comme séquence modèle et en excluant les séquences non homologues, hypothétiques, partielles et de faible qualité (dossier supplémentaire 1). Comme il a été déterminé précédemment que le TTR n’est conservé que pour toutes les espèces de vertébrés, les espèces d’invertébrés ont été exclues de cette analyse (figure 3 et figure 4). De plus, il est important de noter que les positions des acides aminés rapportées dans la littérature excluent un présegment de 20 acides aminés absent de la protéine hTTR mature et, pour cette raison, les positions soumises au niveau 3 ont été ajustées par rapport à celles rapportées dans la littérature pour assurer un alignement précis avec la protéine modèle¹⁵ sélectionnée (fichier supplémentaire 1).

Dans l’analyse de niveau 3 du TTR, 294 espèces de vertébrés ont été sélectionnées pour l’alignement (mammifères, oiseaux, amphibiens, reptiles et poissons). Parmi les espèces évaluées, 18 présentaient des différences dans les acides aminés clés, ce qui a entraîné une prédiction de la sensibilité de « N » (c.-à-d. non). Fait intéressant, cinq espèces de mammifères marins ont présenté une substitution d’acides aminés à la position 2 (128A), tandis que quatre espèces de poissons ont présenté des substitutions à la position 2 (128A) ou à la position 6 (139T) (figure 5). Comme ces acides aminés jouent un rôle important dans les interactions protéine-ligand dans le canal de liaison du TTR, ces données suggèrent que les ligands TTR peuvent interagir différemment chez ces espèces et entraîneraient une susceptibilité chimique différente par rapport aux humains.

Figure 5 : Analyse SeqAPASS de niveau 3 de la conservation des résidus d’acides aminés importants pour la liaison chimique TTR. (A) Tableau récapitulatif de niveau 3 indiquant le nombre d’espèces pour lesquelles des données de séquences sont disponibles dans tous les groupes taxonomiques, le nombre d’espèces dont on prévoit qu’elles sont sensibles de manière similaire (Y) et le nombre d’espèces qui ne devraient pas être sensibles de la même manière (N). (B) Carte thermique de niveau 3 montrant certaines espèces qui ne devraient pas être sensibles de la même manière par rapport à la protéine TTR de la transthyrétine humaine, démontrant des acides aminés complets, partiels et non correspondants. Abréviations : TTR = transthyrétine; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la susceptibilité entre les espèces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En réponse aux commentaires des parties prenantes et des utilisateurs, de nouvelles fonctionnalités ont été conçues et intégrées à l’outil SeqAPASS, y compris la possibilité de se connecter à des données empiriques pour différentes applications. L’interopérabilité de cet outil avec la base de connaissances ECOTOX (tableau 1) a été réalisée à la fois en intégrant des liens externes dans les tableaux de données de niveau 1 et de niveau 2 pour les accessions présentes dans ECOTOX et en créant un widget ECOTOX dans l’outil pour filtrer directement les données de toxicité les plus pertinentes dans ECOTOX. Grâce aux liens et au widget, les utilisateurs peuvent rapidement interroger ECOTOX et recueillir les données de toxicité correspondantes pour les espèces avec des prédictions de sensibilité SeqAPASS. Actuellement, les prédictions SeqAPASS sont liées à ECOTOX par un facteur de stress chimique et une espèce; cependant, les données sur la toxicité ne sont pas encore liées à des gènes/protéines spécifiques, ce qui permettrait d’établir des liens directs avec les paramètres et les cibles moléculaires spécifiques d’intérêt dans SeqAPASS. Bien qu’il ne soit pas idéal de relier les prévisions aux données de toxicité fondées sur un facteur de stress chimique, car les données peuvent ne pas être spécifiques à une voie donnée, la première étape consiste à établir un lien pour rassembler les résultats. En tant que première itération d’une intégration SeqAPASS-ECOTOX, l’approche actuelle fournit aux utilisateurs toutes les données de toxicité disponibles pour le(s) stresseur(s) chimique(s) et les espèces à un niveau général. Ces données, lorsqu’elles sont combinées avec les prévisions SeqAPASS, peuvent fournir un contexte à de grands niveaux (vertébrés vs invertébrés) et peuvent être considérées dans le contexte du cadre AOP.

Le TTR présente un bon exemple pour examiner ce lien, car l’AOP existant (AOP 152) fournit un contexte pour interpréter les données potentiellement pertinentes sur la toxicité ECOTOX. En commençant par les ligands examinés au niveau 3 du SeqAPASS, des données sur la toxicité environnementale ont été recueillies auprès de quatre espèces chimiques connues pour interagir avec le domaine de liaison au ligand TTR (diéthylstilbestrol [DES], acide perfluorohexanoïque [PFHxA], sulfonate de perfluorooctane [SPFO] et tétrabromobisphénol A [TBBPA])19,21,23,24 . Pour chaque produit chimique, ECOTOX a été interrogé pour obtenir des données aquatiques et terrestres par numéro du Chemical Abstracts Service (CAS) à l’aide de paramètres de recherche personnalisés (fichier supplémentaire 1). Les données ont été filtrées en fonction des groupes d’espèces d’intérêt (amphibiens, oiseaux, poissons, invertébrés, mammifères, reptiles). Dans les résultats filtrés de la requête, une moyenne des concentrations minimales et maximales avec effet de l’étude a été calculée et mise en œuvre comme approximation de la moyenne pour tous les résultats positifs qui n’ont pas indiqué de valeur moyenne de concentration avec effet (figure 6A et fichier supplémentaire 1). Dans le contexte d’un seul produit chimique, des tests Kruskal-Wallis ont été effectués pour comparer les concentrations moyennes avec effet de différents groupes taxonomiques, car les données ne répondaient pas aux hypothèses des tests ANOVA. Des tests de comparaison post-hoc par paires ont ensuite été effectués à l’aide du test de Dunn pour tous les produits chimiques, car les groupes taxonomiques étaient constitués d’échantillons de taille inégale. Les résultats aquatiques et terrestres ont été analysés séparément, car les données entre les deux types d’expositions ne sont pas directement comparables. Dans ECOTOX, des données sur la toxicité aquatique des produits chimiques sélectionnés étaient disponibles pour les amphibiens, les oiseaux, les invertébrés et les espèces de poissons (figure 6A). Les données sur la toxicité terrestre des produits chimiques sélectionnés n’étaient disponibles que pour les mammifères et le DES (fichier supplémentaire 1).

Figure 6 : Couplage des résultats de SeqAPASS avec des données empiriques. (A) Concentrations moyennes avec effet dans les groupes taxonomiques avec les données disponibles dans la base de connaissances ECOTOXicology pour certains produits chimiques connus pour se lier à la protéine TTR humaine. (B) Chevauchement du nombre d’espèces incluses dans chaque analyse SeqAPASS avec les espèces pour lesquelles des données ECOTOX étaient disponibles. Dans le panneau A, les parenthèses le long de l’axe des x indiquent le nombre d’accès aux requêtes pour lesquelles les données ont été agrégées. Les astérisques indiquent des paires de concentrations avec effet significativement différentes entre les groupes d’espèces dans le contexte d’un seul produit chimique (test de Dunn, p < 0,05), où un nombre plus élevé d’astérisques indique des niveaux de signification plus élevés (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Les lignes centrales à l’intérieur de chaque boîte représentent la médiane, avec des bords de boîte montrant la plage interquartile. Les moustaches s’étendent jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile. Les valeurs aberrantes se situant en dehors de cette plage sont indiquées sous forme de points individuels. Abréviations : TTR = transthyrétine; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce; ECOTOX = base de connaissances ECOTOXicology. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans l’ensemble, ces données suggèrent que la bioactivité des produits chimiques évalués se produit chez les espèces de vertébrés, mais pas chez les invertébrés. Bien que le manque d’informations sur les cibles biologiques et les voies dans ECOTOX rende impossible le lien direct entre ces données empiriques et le TTR, ces résultats appuient les prédictions du SeqAPASS selon lesquelles les espèces d’invertébrés ne partagent pas la susceptibilité. Toutes les espèces de vertébrés pour lesquelles des données étaient disponibles ont démontré une sensibilité au SPFO et au TBBPA, bien que les concentrations moyennes avec effet aient été significativement plus élevées chez les poissons et les oiseaux que chez les amphibiens. Ces données suggèrent des différences potentielles de sensibilité entre les groupes taxonomiques qui peuvent être attribuées à des différences de voies biologiques (y compris TTR). Il convient de noter que d’autres variables telles que le métabolisme et l’excrétion peuvent également jouer un rôle dans les différences de sensibilité. Pour le PFHxA et le SPFO, les poissons se sont révélés significativement plus sensibles que les invertébrés et les oiseaux et, pour le DES, les amphibiens présentaient des concentrations moyennes avec effet significativement plus élevées que les invertébrés. Encore une fois, ces données appuient notre prédiction SeqAPASS selon laquelle les invertébrés ne partagent pas la même sensibilité que les espèces de vertébrés. De toutes les espèces évaluées à l’aide de cet outil pour lesquelles il existait des données de séquence TTR, seul un petit nombre disposait de données ECOTOX correspondantes pour les quatre produits chimiques d’intérêt (figure 6B, tableau supplémentaire S1 et tableau supplémentaire S2). Pour les espèces pour lesquelles il n’y a pas de données apicales, les prédictions de sensibilité SeqAPASS ajoutent des éléments de preuve supplémentaires indiquant que les espèces apparentées peuvent se comporter de manière similaire à celles pour lesquelles les données apicales sont disponibles. Les données de toutes les analyses SeqAPASS et ECOTOX sont disponibles dans le dossier supplémentaire 1.

Selon les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en 2017, les opioïdes ont contribué à environ 47 600 décès par surdose aux États-Unis, un nombre qui continue d’augmenter^{de 27}. Aux États-Unis, les usines de traitement des eaux usées sont réglementées à l’échelle nationale par le système national d’élimination des rejets de polluants de l’Environmental Protection Agency des États-Unis, qui n’exige pas de tests de dépistage des opioïdes ou d’autres produits pharmaceutiques dans leur rejet²⁸. Au cours des dernières années, on s’est efforcé d’utiliser l’épidémiologie fondée sur les eaux usées comme outil pour cartographier la consommation communautaire d’opioïdes. Les efforts de surveillance des opioïdes ont permis de détecter des concentrations aussi élevées que 1,27 μg/L dans les effluents d’eaux usées et 0,7 μg/L dans les eaux de surface^29,30. Des études de toxicité récentes évaluant l’effet de l’exposition aux opioïdes sur les poissons ont signalé le développement de comportements addictifs et d’effets immunologiques indésirables (p. ex. taux d’infection plus élevés, régulation négative des gènes immunitaires)^31,32,33. Dans l’ensemble, ces études suggèrent qu’il existe un potentiel d’exposition environnementale nocive aux opioïdes et soulignent l’importance de comprendre le risque que posent ces produits chimiques pour les espèces aquatiques. Compte tenu de l’éventail des espèces qui peuvent rencontrer ces composés dans l’environnement, l’identification des espèces potentiellement sensibles à l’aide de SeqAPASS peut être importante pour établir l’ordre de priorité des efforts d’essai ou de surveillance.

Le MOR constitue la principale cible opioïde pour la gestion de la douleur et est responsable des puissantes propriétés analgésiques et addictives des alcaloïdes opiacés chez l’homme^34,35. En raison de l’importance de ce récepteur pour la santé humaine, les ligands MOR sont bien connus et des études de cristallographie aux rayons X de haute qualité sont disponibles, ce qui rend cette cible idéale pour l’analyse SeqAPASS 8,9,13. À l’aide de l’accession NCBI pour le récepteur des opioïdes μ humains, ACM90349.1, une analyse de niveau 1 a été effectuée en utilisant les paramètres par défaut. Le seuil de sensibilité a été établi à 55 % pour le niveau 1, avec des similitudes en pourcentage pour les mammifères (Mammalia), les oiseaux (Aves), les reptiles (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), les amphibiens (Amphibia) et la plupart des espèces de poissons (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) se situant au-dessus de ce seuil; par conséquent, les espèces de ces groupes taxonomiques ont donné lieu à une prédiction de sensibilité de « Y » (c.-à-d. oui), ce qui indique qu’elles seraient probablement sensibles aux substances chimiques connues pour interagir avec le MOR humain (figure 7 et fichier supplémentaire 1). À l’aide de la base de données des domaines conservés du NCBI, 7tmA_Mu_opioid_R a été identifié (accession cd15090) comme un domaine fonctionnel comprenant les sept hélices de la protéine MOR de 133 à 411, y compris un site de liaison putatif au ligand. Comparativement au niveau 1, les résultats du niveau 2 ont révélé un seuil de sensibilité plus élevé de 88 % de similitude, avec des mammifères, des oiseaux, des reptiles, des amphibiens et la plupart des espèces de poissons trouvés au-dessus de ce seuil et résultant en une prédiction de sensibilité de « Y » pour oui (figure 8). Dans l’ensemble, les résultats des analyses de niveaux 1 et 2 suggèrent que la plupart des espèces de vertébrés partagent la conservation du MOR et sont susceptibles d’être sensibles aux produits chimiques connus pour interagir avec le MOR humain.

Figure 7 : Analyse SeqAPASS de niveau 1 de la conservation des récepteurs opioïdes μ dans les groupes taxonomiques avec des informations de séquence disponibles par rapport à la protéine humaine. Le pourcentage de similitude de la séquence d’acides aminés protéiques est affiché sur l’axe des Y; le groupe taxonomique est affiché sur l’axe des abscisses. Les cercles ouverts (○) indiquent la séquence de requête, et les cercles fermés (●) indiquent les espèces du groupe taxonomique présentant le pourcentage de similitude le plus élevé. Dans le graphique, le haut et le bas de chaque case représentent les 75e et 25e centiles, les moustaches s’étendent jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile et les valeurs moyennes et médianes sont représentées par des lignes noires horizontales sur la boîte. La ligne pointillée indique le seuil pour les prédictions de susceptibilité. Abréviations : MOR = récepteur mu-opioïde; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la susceptibilité entre les espèces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Analyse SeqAPASS de niveau 2 de la conservation du domaine de liaison au ligand du récepteur opioïde μ par rapport au domaine dans la protéine humaine. Le pourcentage de similitude de la séquence d’acides aminés du domaine de liaison au ligand est affiché sur l’axe des Y; le groupe taxonomique est affiché sur l’axe des abscisses. Les cercles ouverts (○) indiquent la séquence de requête, et les cercles fermés (●) indiquent les espèces du groupe taxonomique présentant le pourcentage de similitude le plus élevé. Dans le graphique, le haut et le bas de chaque case représentent les 75e et 25e centiles, les moustaches s’étendent jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile et les valeurs moyennes et médianes sont représentées par des lignes noires horizontales sur la boîte. La ligne pointillée indique le seuil pour les prédictions de susceptibilité. Abréviations : MOR = récepteur mu-opioïde; SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la susceptibilité entre les espèces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Grâce à l’analyse de la modélisation moléculaire et des études de cristallographie des protéines, des acides aminés ont été identifiés dans la région de liaison de MOR qui devraient interagir avec des ligands connus. Bien que l’ensemble diversifié de ligands qui se lient bien aux récepteurs opioïdes entraîne une pharmacologie complexe, certaines interactions ligand-protéine cohérentes sont observées^36,37. Basé sur l’amarrage moléculaire à diverses structures cristallines MOR, morphine et fentanyl, agonistes MOR de haute affinité, interagissent avec D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 et Y326^36,38. Les résidus D147, Y148, M151 et H297 sont également impliqués dans les structures cristallines de MOR liées à l’agoniste de la morphine BU72, tandis que D147, M151, H297 et Y326 sont également essentiels pour se lier à l’antagoniste irréversible de la morphine β-funaltrexamine³⁷. Compte tenu de ces sources de données, neuf résidus ont été sélectionnés (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) pour l’évaluation de niveau 3 en utilisant le MOR humain comme séquence modèle et en excluant les séquences partielles, prédites, hypothétiques et de faible qualité. Il est important de noter que les positions des acides aminés rapportées dans la littérature excluent un segment de 64 acides aminés par rapport à l’accession de la protéine NCBI et, pour cette raison, les positions au niveau 3 ont été sélectionnées pour représenter celles qui correspondaient à la séquence modèle pour les séquences d’alignement correctes.

Dans l’analyse de niveau 3 du MOR humain, 284 espèces ont été évaluées parmi les espèces de vertébrés (mammifères, oiseaux, amphibiens, reptiles et poissons). Pour toutes les espèces évaluées, les neuf acides aminés étaient soit une correspondance totale, soit une correspondance partielle basée sur la classification de la chaîne latérale et le poids moléculaire; par conséquent, toutes les espèces évaluées ont donné lieu à une prédiction de sensibilité de « Y » pour oui (tableau 3 et dossier supplémentaire 1). Comme ces acides aminés sont importants dans la liaison des agonistes puissants du MOR et des antagonistes puissants, ces données suggèrent que les composés opioïdes ciblant les récepteurs humains μ opioïdes peuvent interagir de manière similaire avec les récepteurs chez les espèces de vertébrés. Bien qu’il y ait peu de données empiriques disponibles à ce jour dans la base de connaissances ECOTOX pour les composés opioïdes, plusieurs études suggèrent que les poissons sont probablement sensibles^31,32,33. Dans l’ensemble, les résultats de SeqAPASS indiquent le potentiel d’impacts environnementaux plus larges des produits chimiques modulant le MOR sur l’ensemble des espèces, ce qui indique que davantage de recherche et peut-être de surveillance pourraient être utiles. Les données de toutes les analyses sont disponibles dans le dossier supplémentaire 1.

Tableau 3 : Analyse SeqAPASS de niveau 3 de la conservation des résidus d’acides aminés importants pour la liaison chimique au récepteur opioïde μ. Tableau récapitulatif indiquant le nombre d’espèces pour lesquelles des données de séquence sont disponibles dans tous les groupes taxonomiques, le nombre d’espèces dont on prévoit qu’elles sont sensibles de manière similaire (Y) et le nombre d’espèces dont on prévoit qu’elles ne sont pas sensibles de la même manière, ainsi que les acides aminés complets, partiels et non correspondants. Abréviation : SeqAPASS = alignement de séquence pour prédire la sensibilité de l’espèce. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S1 : Espèces pour lesquelles des données ECOTOX sont disponibles pour les quatre produits chimiques d’intérêt connus pour se lier à la protéine transthyrétine humaine. Les données disponibles pour chaque produit chimique sont alignées sur les prédictions SeqAPASS de sensibilité similaire aux niveaux 1, 2 et 3. Toutes les prédictions SeqAPASS relatives à la séquence de transthyrétine humaine. Abréviations : SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce à l’ensemble des espèces; DES = diéthylstilbestrol; PFHxA = acide perfluorohexanoïque; SPFO = acide perfluorooctane sulfonique; TBBPA = tétrabromobisphénol A. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Nombre total d’espèces pour lesquelles des données sont disponibles dans les évaluations SeqAPASS et ECOTOX pour certains produits chimiques connus pour se lier à la protéine transthyrétine humaine. SeqAPASS fournit des moyens de prédire la sensibilité des espèces à de nombreuses espèces pour lesquelles les données empiriques sur la toxicité ne sont pas disponibles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Données SeqAPASS et ECOTOX pour tous les résultats représentatifs. Le fichier contient la TdC suivie des fiches techniques suivantes : Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Average Calculations, Tab 9-Comparaisons des données EcoTox de l’onglet 9-SeqAPASS, Onglet 10-Résultats de l’Onglet 10-Résultats de l’APASS SeqAPASS de l’onglet 10-MOR Niveau 1, Onglet 11-Résultats de l’Onglet 11-MOR SeqAPASS Niveau 2 et Onglet 12-μ-hMOR Résultats SeqAPASS Niveau 3. Abréviations : SeqAPASS = alignement des séquences pour prédire la sensibilité de l’espèce à l’ensemble des espèces; TdC = Table des matières; hTTR = transthyrétine humaine; ECOTOX = Base de connaissances en écotoxicologie; DES = diéthylstilbestrol; SPFO = acide perfluorooctane sulfonique; PFHxA = acide perfluorohexanoïque; TBBPA = tétrabromobisphénol A; hMOR = récepteur mu-opioïde humain. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Il est largement reconnu qu’il n’est pas possible de tester empiriquement suffisamment d’espèces pour saisir la diversité génomique, phénotypique, physiologique et comportementale des organismes vivants susceptibles d’être exposés à des produits chimiques d’intérêt toxicologique. L’objectif de SeqAPASS est de maximiser l’utilisation des données existantes et en expansion continue de la séquence protéique et des données structurelles pour aider et informer l’extrapolation des données / connaissances sur la toxicité chimique des organismes testés à des centaines ou des milliers d’autres espèces grâce à des comparaisons au niveau moléculaire. L’outil SeqAPASS a été conçu pour réduire la complexité des comparaisons de séquences de protéines pour les scientifiques, les évaluateurs des risques et les organismes de réglementation grâce à une analyse rationalisée et rapide qui comprend des tableaux récapitulatifs générés de manière transparente et téléchargeables, des visualisations de données interactives et l’identification facile des espèces menacées et en voie de disparition, ainsi que des organismes modèles communs. Les protocoles sont décrits ici pour exécuter les niveaux SeqAPASS 1, 2 et 3 pour l’évaluation de la similarité des séquences d’acides aminés primaires, de la conservation du domaine fonctionnel et des acides aminés critiques impliqués dans les interactions chimique-protéine et protéine-protéine. Les sources de données recueillies à partir de chaque niveau d’analyse SeqAPASS prédisent la sensibilité chimique entre les espèces, fournissant des données cohérentes et facilement interprétables. À ce jour, cet outil a été utilisé dans un large éventail d’applications, y compris l’identification des produits chimiques qui se lient à certains récepteurs et l’évaluation du potentiel de lecture croisée des récepteurs écologiques vertébrés avec des systèmes de mammifères. De plus, deux études de cas axées sur la protéine de distribution des hormones thyroïdiennes, TTR, et le MOR sont décrites ici pour démontrer les nouvelles caractéristiques et fonctionnalités de SeqAPASS v2 à v6.

Comme pour toute approche informatique, la capacité de générer des prédictions de la sensibilité des espèces dans l’outil SeqAPASS dépend fortement de l’entrée des paramètres appropriés ^8,9,13. Il est donc essentiel qu’avant d’effectuer une analyse, une étape de formulation du problème soit effectuée pour examiner les données et la littérature existantes pour la cible visée. Commencer une analyse avec la connaissance de la cible protéique permet à l’utilisateur d’identifier les nombres d’accession aux protéines appropriés et les séquences de haute qualité. De même, la connaissance d’une espèce sensible ou ciblée ou d’organismes modèles utilisés dans les essais ou l’élaboration de POA garantit la sélection d’une espèce de requête appropriée à laquelle toutes les autres espèces sont comparées. La sélection des domaines fonctionnels pour le niveau 2 et des résidus d’acides aminés critiques pour le niveau 3 sont également des étapes critiques qui nécessitent que l’utilisateur identifie les paramètres d’entrée appropriés pour générer des prédictions. En raison de ce besoin de connaissances préexistantes sur une interaction chimique-protéine, les versions récentes de l’outil SeqAPASS intègrent des ressources conviviales conçues pour aider les utilisateurs à obtenir des renseignements pertinents pour le lancement d’une requête (p. ex., des liens vers d’autres outils) (tableau 2 et figure 2). De plus, des messages d’information contextuels et des alertes ont été intégrés à l’outil pour guider l’utilisateur tout au long de l’analyse et aider à informer l’utilisateur de toute erreur à résoudre.

La complexité des interactions chimiques-biologiques présente une limite de l’outil SeqAPASS. Lors de l’extrapolation des données de toxicité entre les espèces, la conservation de la cible moléculaire est l’un des nombreux facteurs à considérer. L’adsorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion (ADME) d’un produit chimique sont cruciaux lorsqu’on considère la toxicité chimique, car les produits chimiques peuvent être activés ou détoxifiés par ces processus^39,40. D’autres facteurs, tels que la voie d’exposition aux produits chimiques, le stade de vie et le cycle biologique de l’organisme, ainsi que le régime alimentaire, peuvent également jouer un rôle important dans la détermination de la sensibilité chimique entre les espèces^41,42. Pour remédier à cette limitation, il est important de comprendre la question principale que SeqAPASS pose lors de la prédiction de la susceptibilité chimique: la cible protéique d’un produit chimique est-elle susceptible d’être présente chez une autre espèce sur laquelle le produit chimique peut agir? Cette question est abordée en identifiant des candidats orthologues et en tenant compte de la conservation de cette cible à travers les espèces par rapport à une espèce sensible ou ciblée connue. Cette information peut être utilisée comme source de données pour l’extrapolation interspécifique et intégrée à d’autres sources de données probantes (p. ex. le potentiel d’exposition) afin de mieux comprendre la sensibilité des espèces aux facteurs de stress chimiques. Les mises à jour de SeqAPASS ont incorporé des liens intégrés vers des outils externes, notamment la base de connaissances ECOTOX⁴³ de l’EPA des États-Unis et le système en ligne de conservation de l’environnement (ECOS) du US Fish & Wildlife ^Service44. La connexion à ces bases de données permet aux utilisateurs de SeqAPASS d’accéder facilement aux données empiriques sur la toxicité chimique pour les comparer aux prédictions basées sur les séquences et un moyen d’identifier les espèces susceptibles d’avoir un statut protégé.

L’outil SeqAPASS fournit une plate-forme scientifique pour les prédictions informatiques de la susceptibilité intrinsèque qui sont soutenues par des concepts en biologie évolutive et des exemples de cas qui comparent les prédictions aux résultats empiriques disponibles. En outre, SeqAPASS est gratuit et accessible au public sur une plate-forme Web bien prise en charge et largement accessible (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Comme cet outil exploite les données de séquençage et les informations sur les protéines provenant des bases de données existantes, sa capacité à prédire la susceptibilité chimique dans une plus grande diversité d’espèces s’améliore constamment à mesure que la technologie de séquençage progresse et que les génomes de nouvelles espèces sont séquencés et annotés. Bien que cela offre des avantages distincts en ce qui concerne la disponibilité des données, cela présente également une limite en ce sens que les informations de séquence accessibles au public peuvent être sujettes à une qualité incohérente, à une mauvaise annotation et à un caractère incomplet des séquences de protéines pour certaines espèces. Cependant, il est prometteur que les technologies et les méthodes omiques en bioinformatique progressent rapidement et, par conséquent, la conservation et la qualité des séquences continueront probablement de s’améliorer au fil du temps.

L’un des principaux objectifs de l’outil SeqAPASS est la transparence, en fournissant un accès sous forme de liens vers toutes les sources de données et les outils intégrés dans le backend. Cette transparence permet à l’utilisateur d’accéder rapidement aux sources originales de la séquence ou aux informations taxonomiques du NCBI. Le domaine d’application de cet outil est défini par l’information nécessaire pour effectuer une analyse significative. Étant donné que la connaissance d’une interaction chimique-protéine ou protéine-protéine chez une espèce sensible ou ciblée connue est un élément clé pour commencer une requête, il faut reconnaître que les requêtes effectuées sans cette information ne sont pas significatives. En outre, les produits chimiques qui ont plusieurs cibles biologiques non définies ou qui interagissent avec différentes cibles avec différents degrés de puissance présentent également un défi et une limitation de l’outil dans sa forme actuelle. On s’attend à ce que, grâce à l’amélioration de la bioinformatique, de la modélisation informatique, du criblage et de la transcriptomique à haut débit à base de cellules, une meilleure connaissance de la diversité de l’espace chimique concernant les interactions avec des protéines spécifiques continuera d’être élucidée. On s’attend à ce que la capacité d’appliquer SeqAPASS à des défis plus larges de l’extrapolation des espèces, par rapport à la compréhension du potentiel d’effets chimiques nocifs sur l’ensemble de la diversité des espèces, continue de s’améliorer.

En conclusion, l’outil SeqAPASS est une plate-forme accessible qui applique facilement les informations moléculaires pour relever le défi de taille de l’extrapolation interspécifique dans les évaluations de la sécurité chimique. Bien que les exemples mis en évidence ici soient axés sur la génération de prédictions de la sensibilité chimique, les résultats peuvent également aider à comprendre la conservation globale des voies biologiques. Rassemblant différentes sources de données et facilitant l’accès à de multiples plateformes et bases de données, cet outil aide à établir des dossiers transparents pour la priorisation des essais chimiques et l’allocation des ressources. Grâce au développement continu des capacités scientifiques et bioinformatiques, la puissance et l’utilité de l’outil continueront de croître et de s’améliorer pour répondre aux besoins des communautés de recherche et de réglementation tout en réduisant les ressources requises pour les évaluations interspécifiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spreadsheet program	N/A	N/A	Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access	N/A	N/A	SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.